Métodos para facilitar el crecimiento microbiano en los flujos de residuos de las fábricas de celulosa y caracterización del potencial de biodegradación de los microbios cultivados

Resumen

Los desechos industriales se pueden recolectar y modificar para analizar el crecimiento microbiano. Las técnicas de extracción de lignocelulosa proporcionan componentes para analizar la capacidad específica de biodegradación. La cromatografía de gases-espectrometría de masas identifica los productos de fermentación de los microorganismos cultivados en los residuos de la fabricación de pulpa. Estos métodos determinan la capacidad metabólica de los microorganismos para degradar los residuos de pulpa.

Resumen

El proceso kraft se aplica a las astillas de madera para separar la lignina de los polisacáridos dentro de la lignocelulosa para la pulpa que producirá un papel de alta calidad. El licor negro es un residuo de pulpa generado por el proceso kraft que tiene potencial para la bioconversión posterior. Sin embargo, la naturaleza recalcitrante de los recursos de lignocelulosa, sus derivados químicos que constituyen la mayoría del carbono orgánico disponible dentro del licor negro y su pH básico presentan desafíos para la biodegradación microbiana de este material de desecho. Los métodos para la recolección y modificación del licor negro para el crecimiento microbiano tienen como objetivo la utilización de este residuo de pulpa para convertir la lignina, los ácidos orgánicos y los subproductos de la degradación de polisacáridos en productos químicos valiosos. Las técnicas de extracción de lignocelulosa presentadas proporcionan un método reproducible para la preparación de sustratos de crecimiento de lignocelulosa para comprender las capacidades metabólicas de los microorganismos cultivados. El uso de cromatografía de gases-espectrometría de masas permite la identificación y cuantificación de los productos de fermentación resultantes del crecimiento de microorganismos en los residuos de pulpa. Estos métodos, cuando se utilizan en conjunto, pueden facilitar la determinación de la actividad metabólica de los microorganismos con potencial para producir productos de fermentación que proporcionarían un mayor valor al sistema de fabricación de pasta y reducirían los residuos de efluentes, aumentando así las ganancias potenciales de la molienda de papel y ofreciendo usos adicionales para el licor negro.

Introducción

La fabricación de pasta de madera es un proceso químicamente intensivo que se ha optimizado durante muchos años para crear un sistema con un desperdicio mínimo. Sin embargo, algunos resultados de este proceso podrían utilizarse para producir productos de mayor valor. El licor negro es un ejemplo de ello. Se genera a partir del proceso kraft, que es el método de fabricación de pasta química dominante, representando el 85% de la producción mundial de lignina¹. El proceso kraft (Figura 1) utiliza la temperatura (160-200 °C), la presión (120 psig) y los productos químicos contenidos en el licor blanco (hidróxido de sodio y sulfuro de sodio) para disolver la lignina de las fibras de madera^2,3. El licor negro contiene lignina, ácidos orgánicos y subproductos de degradación de polisacáridos⁴. Se incinera para producir vapor y recuperar productos químicos en la caldera de recuperación que proporciona energía térmica para los procesos posteriores de fabricación de papel y pulpa. El volumen de licor negro generado por la fabricación de pulpa puede exceder la cantidad que la caldera de recuperación puede procesar de manera efectiva. Desechar el licor negro como efluente afecta negativamente a la flora y fauna acuática y, por lo tanto, no es una opción. La aplicación de organismos microbianos que podrían utilizar el licor negro para el crecimiento sería beneficiosa en términos de aumentar la recuperación química y la generación de productos de valor agregado que mejorarían el análisis del ciclo de vida general del sistema de fabricación de pulpa. La conversión química y biológica de monómeros derivados de la lignina ha producido con éxito vainillina y ácido cinámico para su uso como edulcorantes alimentarios y aditivos de fragancias, fenol utilizado para plásticos y resinas, y ciclohexano, que podría usarse como combustible⁵.

El trabajo previo sobre la biodegradación de este residuo de pulpa se ha centrado en la despolimerización de la lignina. El Instituto Internacional de Lignina (ILI) informa que cada año se producen entre 40 y 50 millones de toneladas de lignina (http://www.ili-lignin.com/aboutlignin.php). Solo el 1,5% de esa lignina se utiliza para procesos industriales comerciales⁶. Se ha estudiado en profundidad la despolimerización de la lignina por las enzimas lacasa y peroxidasa producidas por hongos de pudrición blanca de los géneros Phanerochaete y Trametes⁷. También se ha demostrado que las bacterias del suelo que se sabe que degradan compuestos aromáticos como Nocardia y Rhodococcus⁸, Pseudomonas putida mt-2⁹ y Streptomyces viridosporus T7A¹⁰ son capaces de degradar la lignina. La degradación bacteriana de los residuos de pulpa es prometedora porque algunas bacterias pueden prosperar en las condiciones salinas y alcalinas (pH 10-14) que caracterizan los efluentes de los residuos de pulpa¹¹. Si bien la lignina es el componente principal del licor negro, los microorganismos también pueden degradar los otros componentes que componen el licor negro. Estas técnicas no identifican exclusivamente los microorganismos que degradan la lignina, sino que sirven para identificar microorganismos que se pueden aplicar directamente al licor negro de residuos de pulpa en lugar de a sus componentes procesados posteriormente.

Se recolectó y modificó el licor negro para el crecimiento microbiano a través de la neutralización y la esterilización por filtro. Los requisitos de crecimiento microbiano se identificaron para un aislado microbiano ambiental mediante experimentos de crecimiento mínimo en componentes lignocelulósicos producidos por un nuevo protocolo de extracción de lignocelulosa. Los medios de crecimiento se analizaron mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) para determinar los productos metabólicos del aislado microbiano ambiental cuando se cultiva en licor negro como única fuente de carbono. La combinación de estas técnicas proporciona una herramienta de evaluación para determinar la capacidad metabólica de un microorganismo cuando se cultiva en desechos de fábricas de celulosa, como el licor negro. El uso de estas técnicas también ofrece información sobre el valor de la aplicación de microorganismos específicos a los residuos de las fábricas de celulosa para la generación de subproductos.

Protocolo

1. Recolección de licor negro y preparación de licor negro para cultivos en crecimiento

1. Recoja una muestra de licor negro de la válvula de salida conectada al digestor kraft en una botella de vidrio estéril y deje que se enfríe a temperatura ambiente antes >neutralización
2. Agregue 100 ml de muestra de licor negro a un vaso de precipitados de 500 ml equipado con una barra agitadora.
3. Coloque el vaso de precipitados en una placa para remover y ajuste la velocidad a media.
4. Agregue lentamente gotas de ácido fosfórico hasta que el licor negro se vuelva viscoso (viscosidad similar al glicerol).
5. Alícuota toda la solución de licor negro vertiendo lentamente en tubos cónicos de 50 ml y centrifugando a 9.300 x g durante 30 min.
6. Coloque el sobrenadante en el vaso de precipitados y mida el pH con cintas de prueba de pH. El pellet de lignina precipitada puede ser desechado y tratado como residuo sólido no peligroso.
7. Continúe agregando ácido fosfórico y centrifugando la solución hasta que las tiras de pH indiquen un pH neutro del sobrenadante.
   esterilización
8. Pase la solución a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar cualquier bacteria contaminante y coloque la solución filtrada en un recipiente estéril para su almacenamiento. Almacene a temperatura ambiente.

2. Extracción de lignocelulosa

Separación de carbohidratos

1. Coloque 5 g de pasto varilla, pino o bermuda (molido a 1 mm o un tamaño de partícula menor) en un matraz Erlenmeyer de 500 ml. A continuación, añada al matraz 200 ml de agua destilada o desionizada, 7,5 g de_NaClO2, 2,5 ml de ácido acético glacial y una barra agitadora.
2. Coloque el matraz en un baño de aceite colocado encima de una placa de agitación a 80 °C durante 1 hora. Ajuste la velocidad de la placa de agitación a media.
3. Añadir 7,5 g adicionales de_NaClO2 y 2,5 ml de ácido acético glacial al matraz. Continuar removiendo a 80 °C en el baño de aceite durante 30 min.
4. Repita el paso anterior 2 veces (Nota: se añaden un total de 30 g de_NaClO2 y 10 ml de ácido acético glacial al matraz que contiene la biomasa lignocelulósica). Enfríe la solución a temperatura ambiente.
5. Coloque una hoja de papel de filtro en un embudo Büchner. Coloque el embudo encima de un matraz de brazo lateral y conéctelo a una aspiradora.
6. Vierta lentamente la solución en el embudo.
7. Lave el material sólido 3 veces con 100 ml de agua destilada o desionizada. Deseche el filtrado después de lavar el material sólido.
8. Reserve 1 g del material sólido y colóquelo sobre una hoja limpia de papel de filtro.
9. Seque este material sólido durante la noche en un horno a 50 °C. Después de retirar la muestra del horno, colóquela en un vial de almacenamiento etiquetado como 'holocelulosa'.
10. Añadir el material sólido restante a 250 ml de NaOH (v/v) al 10% en un matraz Erlenmeyer de 500 ml. Tape el matraz con un tapón.
11. Coloque la solución en una incubadora a 70 °C durante 1 hora agitando a 250 rpm.
12. Enfríe la solución durante 30 minutos a temperatura ambiente.
13. Retire el material sólido con papel de filtro y embudo Büchner unido a un matraz de brazo lateral.
14. Transfiera el material sólido en una hoja limpia de papel de filtro a un horno a 50 °C y deje que se seque durante la noche.
15. Una vez que el residuo se haya secado, colóquelo en un vial de almacenamiento y etiquételo como "celulosa".
16. Transfiera el filtrado del paso 2.13 a un matraz Erlenmeyer de 500 ml y agregue 30 ml de ácido acético y 250 ml de alcohol isopropílico. Tape el matraz y coloque la solución en la mesa de trabajo durante al menos 8 horas a temperatura ambiente.
17. Transfiera toda la solución a tubos cónicos de 50 ml y centrifugue la solución a 9.300 x g durante 30 min. Pipetee cuidadosamente la solución fuera del tubo cónico y deséchela.
18. Vuelva a suspender el pellet en 30 ml de agua destilada o desionizada por vórtice.
19. Repita los pasos 2.17-2.18 15 veces para lavar a fondo el pellet.
20. Retire el sobrenadante y guarde el pellet para liofilizar. Una vez liofilizada, recoja la muestra y colóquela en un vial etiquetado como 'hemicelulosa'.
    Separación de ligninas
    Protocolo de separación de lignina basado en Karaaslan et al. ¹²
21. Añadir 5 g de pasto varilla, pino o bermuda (molido hasta 1 mm o menor tamaño de partícula) a 500 ml de una solución de 0,25 M de NaOH y etanol al 30%. Coloque el purín en una incubadora a 75 °C agitando a 250 rpm durante 2 horas.
22. Enfríe la solución a temperatura ambiente.
23. Coloque una hoja de papel de filtro en un embudo Büchner encima de un matraz de brazo lateral. Conéctalo a una aspiradora y vierta lentamente la solución en el embudo.
24. Deseche el material sólido.
25. Añada una barra de agitación al matraz que contiene el filtrado y coloque el matraz encima de una placa de agitación ajustada a velocidad media. Añadir ácido clorhídrico concentrado gota a gota a la solución hasta obtener un pH de 2,0 (aproximadamente 20 ml).
26. Deje reposar la solución acidificada durante la noche a temperatura ambiente.
27. Centrifugar la solución a 9.300 x g durante 30 min en tubos cónicos. Pipetee con cuidado la solución del tubo cónico y deséchela.
28. Vuelva a suspender el pellet en 30 ml de agua destilada o desionizada por vórtice.
29. Repita los pasos 2.27-2.28 15 veces para lavar a fondo el pellet.
30. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y guarde el pellet para liofilizar. Una vez liofilizada, coloque la muestra en un vial etiquetado como 'lignina'.

3. Preparación de cultivos de crecimiento microbiano

Placas de agar

1. Agregue 0.2% (p/v) de productos de extracción de lignocelulosa estériles al agar M9 minimal media¹³ antes de verter las placas.
2. Placas solidificadas con aproximadamente 200 ul de un cultivo bacteriano cultivado en un medio mínimo M9 con un diámetro exterior de aproximadamente 2.0.
3. Incubar las placas a 37 °C y controlar el crecimiento.
   Cultivos líquidos
4. Añadir 50 ml de medio estéril Luria-Bertani (LB)¹³ o M9 medio mínimo¹³ a un matraz estéril de 125 ml. Añadir licor negro al 10% (v/v) o al 0,2% (p/v) de los productos de extracción de lignocelulosa.
5. Inocular el medio con 0,1% (v/v) de un cultivo bacteriano a un diámetro exterior de aproximadamente 2,0.
6. Incubar los cultivos a 37 °C con agitación a 200 rpm.
7. Evalúe el crecimiento cada 6 horas durante el período de cultivo midiendo la densidad óptica (λ = 600 nm). Coloque una alícuota de 1 ml del cultivo en una cubeta. Determinar la densidad óptica del cultivo en blanco frente a medios no inoculados.
8. Transfiera las bacterias a un frasco de suero anaeróbico en la fase media de logaritmo.
   1. Para preparar el frasco de suero anaeróbico: selle el frasco de suero con un tapón de caucho butílico y una tapa de engarce de aluminio en condiciones aeróbicas y autoclave. No modifique el espacio libre dentro del frasco de suero después de la esterilización.
   2. Transfiera todo el cultivo de 50 ml del matraz de 125 ml al frasco de suero estéril sellado con una jeringa.
   3. Incubar a 37 °C con agitación a 200 rpm.

4. Preparación de muestras para GC-MS

Prepare muestras de acuerdo con Raj, Reddy y Chandra¹⁴. El control negativo utilizado para la comparación consiste en medios mínimos M9 con 10% de licor negro y también se conoce como muestra no inoculada.

1. Centrifugar cultivos bacterianos inoculados y no inoculados (50 ml) a 9.300 x g durante 30 min después de 450 horas de incubación.
2. Transfiera 10 ml del sobrenadante a un tubo de ensayo de vidrio. (Nota: El plástico es incompatible con los productos químicos en los siguientes pasos).
3. Acidificar el sobrenadante con HCl concentrado a pH 1-2.
4. Añadir 3 volúmenes de acetato de etilo (30 ml), tapar el tubo y mezclar invirtiendo 4-6x.
5. Coloque una pequeña cantidad de Na₂SO₄ anhidro (1-2 g) en un tubo de ensayo de vidrio limpio.
6. Recoja cuidadosamente la capa orgánica (parte superior) de la solución de acetato de etilo pipeteando con una pipeta Pasteur de vidrio desechable.
7. Coloque la capa orgánica en el tubo de ensayo con Na₂anhidro SO₄.
8. Deshidratar la capa orgánica sobre el Na₂SO₄ anhidro golpeando suavemente el tubo de ensayo para mezclar. Agregue gradualmente pequeñas cantidades de Na₂SO₄anhidro y mezcle hasta que no queden grumos grandes.
9. Coloque una hoja de papel de filtro en un embudo Büchner encima de un matraz de brazo lateral conectado a una aspiradora.
10. Vierte la solución en el embudo. Deseche el material sólido.
11. Transfiera la solución a un matraz evaporador y evapore el filtrado utilizando un evaporador rotativo.
12. Coloque 3 mg de residuo de extracción de acetato de etilo en un vial de cromatografía ámbar de 2 ml.
13. Disolver el residuo con la adición de 100 μl de 1,4-dioxano y 10 μl de piridina.
14. Añadir 50 μl de N,O-Bis(trimetilsilil) trifluoroacetamida con trimetilclorosilano 99:1% (BSTFA). Luego colóquelo en una incubadora a 60 °C agitando durante 15 min.
15. Almacene las muestras a 4 °C hasta su uso.

5. GC-MS

Equipe el cromatógrafo de gases (GC) interconectado con un espectrómetro de masas (MS) con una columna capilar no polar y helio como gas portador con un caudal de 1 ml/min.

1. Una vez estabilizada la temperatura del horno a 50 °C, inyectar 1 μl de la muestra en una proporción de división de 1/50.
2. Mantenga la columna a 50 °C durante 5 min y aumente a 280 °C a 5 °C/min. Mantenga la temperatura final de 280 °C durante 20 min.
3. Mantenga la línea de transferencia entre el cromatógrafo de gases y el espectrómetro de masas a 300 °C.
4. Seleccione un retardo del disolvente de 15 min.
5. Registre espectros de masas de ionización de electrones entre el rango de 10-500 (m/z) a una energía de electrones de 70 eV.
6. Derivatizar y cromatógrafo estándar como el anterior. Identifique los compuestos comparando los tiempos de retención de los estándares comprados o los datos en la base de datos espectral de masas del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST).

Resultados

La recolección y modificación del licor negro generado en el proceso de fabricación de pasta kraft (Figura 1) permitirá utilizar este residuo de pulpa para determinar la capacidad de biodegradación de un solo aislado bacteriano o cultivo mixto. La Figura 2 muestra el crecimiento aeróbico medido por la densidad óptica del aislado ambiental microbiano cultivado en medio LB solo y en medio LB suplementado con licor negro neutralizado al 10%. Estos resultados indican que esta bacteria crece ...

Discusión

Este protocolo describe una combinación de técnicas que tiene como objetivo identificar microorganismos que pueden degradar los desechos de pulpa, las fuentes de carbono utilizadas durante el crecimiento en los desechos de pulpa y los productos metabólicos microbianos producidos cuando se cultivan en los desechos de pulpa. Hemos demostrado el éxito de este protocolo con el aislado ambiental microbiano: un anaerobio facultativo que puede crecer con un 10% de licor negro y utilizar los componentes de extracción de lignocel...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1,4-Dioxano (certificado ACS)	Fisher	D111	Químico inflamable y preoxidable
Licor negro	Departamento de Biomateriales Forestales de la Universidad Estatal de Carolina del Norte	N/A	pH 12,72, 13,67% sólidos
Etanol (grado de microbiología)	Fisher	BP2818
Acetato de etilo (grado de reactivo ACS)	EMD	EX0240-9	Inflamable
Ácido acético glacial (Certificado ACS)	EMD	AX0073	Guaiacol corrosivo
	Sigma Aldrich	PHR1136	Nocivo por ingestión, corrosivo
Columna capilar HP-5	Agilent	19091J-577	60 m x 0,18 mm diámetro interno, 0,18 μ m espesor
Ácido clorhídrico (certificado ACS)	EMD	HX0603P
N,O-Bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida con trimetilclorosilano 99:1% (BSTFA)	Fluka	15238	Inflamable, causa quemaduras en la piel y daños oculares por contacto con
Na2SO4 (grado FCC)	VWR	BDH8026
NaClO2 (80%)	Sigma Aldrich	244155	Inflamable, tóxico
NaOH (certificado ACS)	EMD	1.06498.1000	Cintas
de prueba de pH de alcácidos	Fisher	A979
Ácido fosfórico (certificado ACS)	Espectrómetro	A242
Polaris Q	Thermo Electron Corporation
Piridina (99%)	Alfa Aesar	A12005	Inflamable, tóxico en contacto con la piel
Switchgrass	Cherry Research Farm Goldsboro, NC	N/A	Cosechado en agosto de 2011
Cromatógrafo de gases traza Thermo Finnigan	Thermo Electron Corporation
Whatman n.º 1 papel de filtro	Whatman	1001-150