Nucleósidos Trifosfatos - De la síntesis a la Caracterización bioquímica

Resumen

El protocolo descrito en el presente documento tiene como objetivo explicar y limite los numerosos obstáculos en el camino de la ruta intrincada que conduce a trifosfatos de nucleósidos modificados. En consecuencia, este protocolo facilita tanto la síntesis de estos bloques de construcción activados y su disponibilidad para las aplicaciones prácticas.

Resumen

La estrategia tradicional para la introducción de funcionalidades químicas es el uso de la síntesis en fase sólida añadiendo precursores de fosforamidita adecuadamente modificados a la cadena naciente. Sin embargo, las condiciones utilizadas durante la síntesis y la restricción de las secuencias más cortas dificultan la aplicación de esta metodología. Por otro lado, trifosfatos de nucleósidos modificados son bloques de construcción que se han empleado para la introducción suave de numerosos grupos funcionales en los ácidos nucleicos, una estrategia que allana el camino para el uso de ácidos nucleicos modificados en una gama de colores amplia de aplicaciones prácticas activan tales como etiquetado funcional y generación de ribozimas y ADNzimas. Uno de los principales desafíos reside en la complejidad de la metodología que conduce al aislamiento y caracterización de estos análogos de nucleósidos.

En este artículo de vídeo, se presenta un protocolo detallado para la síntesis de these análogos modificados utilizando fósforo reactivos (III) con sede en. Además, el procedimiento para su caracterización bioquímica es divulgada, con un énfasis especial en las reacciones de extensión de cebador y polimerización del tizón TdT. Este protocolo detallado será de utilidad para la elaboración de dNTPs modificados y su uso posterior en la biología química.

Introducción

Trifosfatos de nucleósidos 5'-((d) PNT) representan una clase de biomoléculas vitales que están implicadas en incontables procesos y funciones que van desde ser la moneda universal de energía a los reguladores del metabolismo celular. Además de su papel en estas transformaciones biológicas fundamentales, sus homólogos modificados han avanzado como una plataforma versátil y suave para la introducción de grupos funcionales en oligonucleótidos, una metodología que complementa muy bien la síntesis en fase sólida automatizada que por lo general se aplica ^1,2. De hecho, siempre que las (d) los PNT pueden actuar como sustratos para ARN y ADN polimerasas....

Protocolo

1. Síntesis de los trifosfatos de nucleósido modificado

El enfoque sintético elegido sigue el procedimiento desarrollado por Ludwig y Eckstein ya que este método es generalmente fiable y conduce a muy pocos subproductos secundarios (Figura 1A) ^39.

1. Coevaporate el nucleósido protegido adecuadamente-3'-OAc (típicamente 0,1 mmol) dos veces con piridina anhidra (2 ml) y después se seca a vacío durante la noche. Al mismo tiempo, pirofosfato de tributilamonio seca (0,13 mmol) bajo vacío durante la noche.
2. Se disuelve el nucleósido en un mínimo de piridina seca (0,2 ml) y añadir dioxano seco (0,....

Resultados

Trifosfatos de nucleósidos modificados son atractivos objetivos sintéticos ya que permiten la introducción fácil de una gran variedad de grupos funcionales en los ácidos nucleicos ^41. Sin embargo, el aislamiento y la caracterización de estos bloques de construcción activados es frecuentemente revelado a ser ardua. En consecuencia, se cree que los resultados que se muestran en este documento para ofrecer una mano de ayuda para seguir los diferentes pasos dentro de los procedimientos sintéticos y bioquímicas an.......

Discusión

La inclusión de las modificaciones en los ácidos nucleicos es de interés para numerosas aplicaciones prácticas, incluyendo el desarrollo de agentes antisentido y antigenes ^42,43, el etiquetado y el marcado funcional de oligonucleótidos ^41, y en los esfuerzos para ampliar el alfabeto genético ^44-46. Las alteraciones químicas y grupos funcionales son por lo general introducidos en ácidos nucleicos mediante la aplicación de protocolos de síntesis en fase sólida estándar y automatizados. Sin.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pirofosfato de tributilamonio	Sigma Aldrich	P8533	Sólido higroscópico, mantener bajo Ar
2-Cloro-1,3,2-benzodioxafosforina-4-ona	Sigma Aldrich	324124	Piridina sensible a la humedad
	Sigma Aldrich	82704	Bajo tamices moleculares
Dioxano	Sigma Aldrich	296309	Bajo tamices moleculares
Dimetilformamida (DMF)	Sigma Aldrich	40248	Bajo tamices moleculares
Acetonitrilo	Fisher Scientific
de HPLC Trietilamina	Sigma Aldrich	90342
Tributilamina	Sigma Aldrich	90781
ddH2O	Milli-Q		desionizada y purificada, esterilizada en autoclave en presencia de dietilpirocarbonato (DEPC
)Dietilpirocarbonato (DEPC)	Sigma Aldrich	159220
D2O	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-4-25
γ-[32P]-ATP	Hartmann Analytics	FP-301
Natural dNTPs	Promega	U1420
Vent (exo-) ADN polimerasa	NEB	M0257S
ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow)	NEB	MO210S
9° Nm ADN polimerasa	NEB	MO260S
Desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT)	Promega	M828A
Pwo ADN polimerasa	Peqlab	01 01 5010
T4 PNK	Thermo Scientific	EK0032
Acrilamida/bisacrilamida (19:1, 40%)	Serva	10679.01
Agarosa	Apollo Scientific	BIA1177
G10 Sephadex	Sigma	G10120
Urea	Apollo Scientific	BIU4110
Júpiter columna RP-HPLC semipreparativa (5μ C18 300 Å)	Phenomenex
Gene Q Thermal Cycler	Bioconcept	BYQ6042E
viales de PCR	Bioconcept	3220-00
Sistema de HPLC	Amersham Pharmacia Biotech		Ä kta basic 10/100
Todos los oligonucleótidos fueron comprados a Microsynth y purificados por PAGE
5'-CAAGGACAAAATAC CTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGA CATCGCCTCTGGGCTA ATAGGACTACTTCTAAT CTGTAAGAGCAGATCC CTGGACAGGCAAGGAA TACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
Se puede encontrar más información sobre procedimientos y equipos experimentales en los siguientes artículos: Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330 Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F