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Un In vivo Enfoque de reticulación para aislar Complejos de Proteína Desde Drosophila Los embriones

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DOI:

10.3791/51387

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23 de abril de 2014

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1Department of Biological Sciences, Murray State University

En este artículo

Resumen

Complejos de proteínas con múltiples componentes juegan un papel crucial durante la función y el desarrollo celular. Aquí se describe un método usado para aislar los complejos de proteínas nativas a partir de embriones de Drosophila después de la reticulación en vivo seguido de la purificación de los complejos reticulados para el análisis de estructura-función subsiguiente.

Resumen

Muchos procesos celulares están controlados por complejos de proteínas con múltiples subunidades. Frecuentemente, estos complejos se forman transitoriamente y requieren entorno nativo de montar. Por lo tanto, para identificar estos complejos de proteínas funcionales, es importante para estabilizar ellos in vivo antes de la lisis celular y la posterior purificación. Aquí se describe un método para aislar grandes complejos de proteínas de buena fe a partir de embriones de Drosophila. Este método se basa en la permeabilización del embrión y la estabilización de los complejos dentro de los embriones de reticulación en vivo usando una baja concentración de formaldehído, que puede atravesar fácilmente la membrana celular. Posteriormente, el complejo proteína de interés se inmunopurificó seguido por purificación en gel y se analizaron por espectrometría de masas. Se ilustra este método mediante la purificación de un complejo de proteínas de Tudor, que es esencial para el desarrollo de la línea germinal. Tudor es una proteína grande, que contiene varios dominios Tudor - pequeñamódulos que interactúan con argininas metiladas o lisinas de las proteínas diana. Este método puede adaptarse para el aislamiento de complejos de proteínas nativas de diferentes organismos y tejidos.

Introducción

El aislamiento de las asambleas de proteínas y complejos de múltiples subunidades de ADN o ARN-proteína se realiza para identificar los complejos de proteínas, genómica loci reconocida por proteínas reguladoras se unen al ADN o ARN objetivos de las proteínas de unión de ARN. Diferentes métodos permiten la identificación de todo el genoma de ADN sitios reconocidos por factores de transcripción o proteínas de la cromatina (ChIP-seq) 1 y los objetivos de ARN asociados con una proteína de unión al ARN dado (CLIP-seq) 2. Las bibliotecas de ADNc de ARN derivados u objetivos de ADN son entonces profundamente secuenciados. Estos métodos utilizan química o reticulación para estabilizar los complejos seguido por inmunoprecipitación (IP) con un anticuerpo contra un componente de proteína del complejo estudiado inducida por UV.

Durante el desarrollo de un organismo, muchos complejos de proteínas forman transitoriamente. Por lo tanto, es crucial para analizar la composición y función de estos complejos in vivo para comprender los mecanismos moleculares que controlan development. Tal análisis in vivo sería superior a enfoque in vitro, ya que es prácticamente imposible de reproducir concentraciones nativas de los componentes que interactúan y entorno bioquímico celular in vitro. Aquí se demuestra un enfoque in vivo que utilizamos con éxito para aislar grandes complejos de proteínas a partir de embriones de Drosophila. En este método, los complejos de proteínas en los embriones vivos se reticulan con una baja concentración de formaldehído y, posteriormente, los complejos de proteínas de interés se aíslan por IP con un anticuerpo contra un componente conocido de los complejos seguido de purificación en gel de los complejos y el análisis de espectrometría de masas para identificar los componentes complejos desconocidos. Dado que el formaldehído es capaz de permear la membrana de la célula y tiene un rango de reticulación de 2.3 a 2.7 Å 3, los complejos de proteínas se pueden reticular in vivo y los componentes complejos son propensos a estar cerca el uno al otro. En este artículodescribir este método usando el aislamiento de entramado (Tud) complejo de la proteína como un ejemplo. Tud es una proteína de la línea germinal que es esencial para el desarrollo de la línea germinal 4-7. Esta proteína contiene 11 dominios TUD conocidos para interactuar con argininas metiladas o lisinas de otros polipéptidos 8-10.

Anteriormente, hemos generado una línea de Drosophila transgénica que expresa HA-etiquetados funcional Tud 5 y por lo tanto, el anticuerpo específico anti-HA se utiliza para tirar hacia abajo compleja Tud después de la reticulación.

Además de reticulaciones proteína-proteína, el formaldehído puede generar enlaces cruzados de proteína-ácido nucleico y se utiliza en los experimentos de ChIP-ss. Además, en Drosophila, in vivo de reticulación con formaldehído ha permitido la identificación de una diana de ARN de la proteína helicasa Vasa ARN 11.

Aunque en este artículo se describe un método para la reticulación in vivo y purficación de complejos de proteínas a partir de embriones de Drosophila, este método se puede adaptar para otros organismos y tejidos.

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Protocolo

1. Preparación grandes de Apple Juice Placas de agar

  1. Para hacer 4 platos, añadir 375 ml de H2O, 11,25 g de agar con mosca y una barra de agitación en un matraz de 1000 ml. Se trata de Mix A. Autoclave Mix A con la tapa frasco sin apretar tope en un ciclo de 30 min-esterilización para productos líquidos.
  2. Añadir 125 ml de jugo de manzana, 12,5 g azúcar de mesa y una barra de agitación a un vaso de 500 ml. Esta es la mezcla B. El calor de la mezcla B en una plataforma calentada mientras se agitaba y mantener la temperatura a aproximadamente 70 ° C hasta que se terminó el tratamiento en autoclave de la mezcla A.
  3. Tras la finalización de Mix A autoclave, transferir Mix B en Mix A. Mantenga la agitación de la mezcla combinada con suavidad y deje que se enfríe durante 15 minutos. Evitar el exceso de enfriamiento y la solidificación de agar dado lugar antes de la adición de conservante.
  4. Hacer 10% (peso / volumen) metil solución de 4-hidroxibenzoato en etanol. Esto actuará como un conservante. Añadir 3,75 ml de la solución a la mezcla de jugo de manzana-agar anteriormente. Mantener la agitación durante anotheR 5 min.
  5. Vierta 125 ml manzana mezcla de jugo-agar con conservante en cada 300 cm2 de plástico o placa de espuma de poliestireno. Deje que se enfríe a temperatura ambiente y se solidifique. Evite la formación de burbujas de aire mientras se vierte.
    Nota: Las placas de manzana jugo de agar están listos para usar inmediatamente. Cubra las placas utilizadas con los abrigos claros y almacenar a 4 ° C durante un máximo de una semana.

2. Drosophila embriones Recolección y Tratamiento Pre-reticulación

  1. Cargue una jaula de población con aproximadamente 40.000 a 50.000 moscas de la que se recogen los embriones.
  2. Haga dos placas que contienen cada uno 125 ml de harina de maíz-melaza estándar medio 12 y espolvorear aproximadamente 4 g de levadura de panadería seca en cada plato. Coloque estas placas en la jaula de la población en una incubadora a 25 ° durante 48 horas para engordar a las moscas.
  3. Caliente 2 manzana jugo de placas de agar a 25 ° C. Espolvorear aproximadamente 1 g de levadura de panadería seca en cada unoplato. Coloque las 2 placas en la jaula de la población para comenzar a recoger 0-1 embriones-hr de edad.
  4. Saque las placas al final de la colección 1 hr. Reemplace con 2 nuevas placas si se necesita otra ronda de recolección.
  5. Agregar suficiente agua para cubrir las placas y volver a suspender los embriones suavemente con un pincel fino. Vierta los embriones se volvieron a suspender por un tamiz de dos capas hechas de malla de alambre de acero inoxidable.
    Nota: La capa superior está hecha de tamaño de poro medio (850 m) de malla que recoge gran parte de la mosca vez que deja pasar los embriones. La capa inferior está hecha de malla fina (75 micras), que recoge los embriones vez que deja pasar la levadura y el agua.
  6. Utilice el pincel fino para transferir los embriones recogidos en una canasta de la colecta hecha con un tubo de 50 ml y malla de nylon fino. Enjuague los embriones brevemente con agua y luego seque la malla en toallas de papel para secarse.
  7. Sumerja los embriones en el 50% de lejía con agitación suave durante 3 min. Enjuague a fondoLY con agua para eliminar cualquier lejía restante. Seque la malla en toallas de papel para secarse.
  8. Sumerja los embriones dechorionated en isopropanol con agitación suave durante 15 segundos o hasta que la descomposición de agregados múltiples del embrión (esto no debe durar más de 30 segundos). Seque la malla en toallas de papel para secarse a fondo.
  9. Sumerja los embriones en heptano durante 5 minutos mientras se utiliza una pipeta para transmitir heptano sobre los embriones para mantenerlos resuspendido. Seque la malla en toallas de papel para secarse.
  10. Enjuague los embriones con corrientes de Tampón fosfato salino, pH 7,4 (PBS) que contenía 0,1% de Triton X-100 (PBST) durante 3 min.
  11. Desmontar la canasta de la colecta y transferir los embriones junto con la malla a un tubo de 15 ml que contiene 10 ml de PBST. Invertir el tubo suavemente para lavar los embriones de la malla.
  12. Retire la malla del tubo. Poner el tubo en posición vertical y dejar que los embriones se hunden hasta el fondo del tubo por gravedad.
    Nota: Aproximadamente 100-300l de embriones se espera para una colección de 1 hr de una jaula.
  13. Retire el PBST y continuar realizando reticulación inmediatamente.

3. In vivo La reticulación de embriones obtenidos

  1. Preparar 0,2% de formaldehído en PBST inmediatamente antes de su uso. Añadir 10 ml de fijador formaldehído para los embriones y se incuba a 25 ° C con agitación suave en un agitador rotatorio durante 10 min. Desechar fijador no utilizada por el final del día.
  2. Se detiene la reacción de reticulación
    1. Al final de la reticulación, dejar que los embriones se hunden hasta el fondo del tubo.
    2. Eliminar la solución de formaldehído. Inmediatamente después, añadir 10 ml de 0,25 M de glicina en PBST para inactivar la reacción de reticulación. Incubar a 25 ° C con agitación suave en un agitador rotatorio durante 5 min.
    3. Deje que los embriones se hunden hasta el fondo del tubo. Eliminar la solución de enfriamiento. Lavar los embriones con 10 ml de PBST tres veces.
    4. Retire completamente el PSolución de lavado BST utilizando una pipeta. Embriones Almacenar a -80 ° C hasta su uso.

4. Proteína preparación de la muestra y la inmunoprecipitación

  1. Homogeneizar 500 l embriones reticulados usando un homogeneizador Dounce en 2 ml de tampón de lisis (urea 0,5 M, 0,01% de SDS, 2% de Triton-X 100, fluoruro de fenilmetanosulfonilo 2 mM de [PMSF] y cóctel inhibidor de la proteasa en PBS).
    Nota: Realice este y los siguientes pasos a temperatura ambiente a menos que se especifique lo contrario.
  2. Transferir el lisado a 1,5 ml de tubos de centrífuga y mueva suavemente sobre una plataforma giratoria durante 15 minutos para asegurar la lisis completa. Centrifugar el lisado a 16.000 xg durante 5 min para sedimentar los restos celulares. Guardar el sobrenadante en un tubo limpio 15 ml.
  3. Añadir 40 l perlas de agarosa anti-HA suspensión al sobrenadante y se incuba en una plataforma giratoria durante 2,5 h.
  4. Se precipitan las perlas mediante centrifugación a 2500 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante, pero dejan aproximadamente 250 l en el tubo. Resuspender las perlas en el sobrenadante restante y transferir a una columna de centrifugación de 1,5 ml con un filtro de poro de 10 micras.
  5. Se centrifuga la columna de centrifugación a 12.000 xg durante 10 seg y desechar el flujo a través.
  6. Lavar las perlas mediante la adición de 200 l de tampón de lavado (0,1 M de glicina, 1 M de NaCl, 1% de Igepal CA-630, 0,1% de Tween-20, en PBS). Centrifugar la columna a 12.000 xg durante 10 seg y deseche el lavado. Repetir el lavado dos veces más.
  7. Añadir 40 l de tampón de elución (2 mg / ml de HA-péptido en PBS) a las perlas y se incuba a 37 ° C durante 15 min con agitación suave cada 5 min. Centrifugar la columna a 12.000 xg durante 10 segundos y recoger el eluido.
  8. Confirmar elución del complejo por análisis de transferencia Western usando anticuerpo anti-HA 13.

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Resultados

La eficacia de la reticulación y la purificación con éxito del complejo de la proteína reticulada Tud se analizaron por SDS-PAGE en un 3% - 7% de gel de paso (ilustrado en la Figura 1), seguido de Western blot (Figura 2).

El propósito de utilizar el 3% - gel de paso 7% se basa en la separación efectiva de reticulado complejo de proteínas Tud de la proteína Tud no reticulada restante y la concentración del complejo. Bajo nuestras condiciones in vivo ...

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Discusión

El formaldehído se ha usado comúnmente como un reactivo de reticulación para la identificación de proteína-proteína y las interacciones proteína-ácido nucleico. Su buena solubilidad y permeabilidad de la membrana celular, junto con la compatibilidad con los procedimientos de espectrometría de masas aguas abajo, crea formaldehído un agente candidato ideal para aplicaciones de reticulación intracelulares 3,15-17. En particular, se utiliza con éxito para identificar los ARNm asociados con Vasa, una helicasa de A...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Damos las gracias a Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler y Jimiao Zheng por su ayuda técnica con este estudio. Este trabajo fue apoyado por NSF CARRERA conceder MCB-1054962 de ALA

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Drosophila agarLab Scientific (http://www.labscientific.com/)FLY-8020-1No autoclave la mezcla de agua y agar durante un período prolongado de tiempo, ya que hará que los platos de jugo de manzana se vuelvan frágiles
4-hidroxibenzoato de metiloSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)H5501Otro nombre: TEGOSEPT
Jaula de poblaciónMateria mosca ( http://www.flystuff.com/)59-104
Malla de nailon finoFlystuff (http://www.flystuff.com/)57-102Al hacer la cesta de recolección, corte la malla un poco más grande que la abertura de la tapa del tubo de halcón para asegurar un sellado hermético
Homogeneizador DounceSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)D8938-1SETEnfríe el homogeneizador con hielo y enjuague previamente con tampón de lisis en frío antes de usar para evitar la degradación de proteínas
.Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa)4693132001PBS podría usarse para preparar una solución madre concentrada de inhibidores de proteasa
Perlas de agarosa anti-HAMBL international (http://www.mblintl.com/)561-8El kit también incluye péptido de HA y columnas de centrifugación
Péptido de HAMBL international (http://www.mblintl.com/)561-8Prepare para 2 mg / ml con PBS 
Columna de centrifugadoMBL international (http://www.mblintl.com/)561-8Las columnas de centrifugado están incluidas como parte del kit
IsopropanolFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)
Tritón X-100Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP151-500
HeptaneFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)H350-4
PBSInvitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)AM9625Diluir de 10X a 1X con agua nanopura antes de usar
formaldehídoFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP531-500
GlicinaBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0724
SDSBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0301
UreaBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0730
Fluoruro de fenilmetanosulfoniloSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)P7626-1GPrepare 200 mM de solución madre en isopropanol y luego diluya hasta una concentración de trabajo de 2 mM en tampón de lisis
IGEPAL CA-630Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)I8896-50ML
Tween 20Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP337-100
Tubos de 15 mlUSA Scientific (http://www.usascientific.com/)1475-0511
LejíamarcaDiluir con igual volumen de agua nanopura para hacer lejía al 50%
Tubos de 50 mlBD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)352098
Tamiz de capa superiorFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)04-884-1AK
Tamiz de capa inferiorFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)04-884-1BA
BP26324 Clorox

Referencias

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