A largo plazo intravital Inmunofluorescencia imágenes de tejido Componentes de Matriz con epifluorescencia y microscopía de dos fotones

Resumen

La matriz extracelular se somete a la remodelación sustancial durante la cicatrización de heridas, la inflamación y la tumorigénesis. Se presenta un novedoso enfoque de inmunofluorescencia microscopía intravital de visualizar la dinámica de fibrilar, así como componentes de la matriz de tipo malla con una alta resolución espacial y temporal mediante epifluorescencia o microscopía de dos fotones.

Resumen

Además de ser un andamio física para mantener la morfología del tejido, la matriz extracelular (ECM) está activamente involucrada en la regulación de la función celular y de tejidos durante el desarrollo y la homeostasis de órganos. Lo hace, actuando a través de las vías de señalización bioquímicos, biomecánicos, y biofísicos, como a través de la liberación de fragmentos de proteínas ECM bioactivos, que regula la tensión del tejido, y proporcionar vías para la migración celular. La matriz extracelular del microambiente del tumor se somete a la remodelación sustancial, caracterizado por la degradación, deposición y la organización de proteínas de la matriz fibrilares y no fibrilares. Estroma de refuerzo del microambiente del tumor puede promover el crecimiento del tumor y la invasión, y causar la remodelación de los vasos sanguíneos y linfáticos. Formación de imágenes en vivo de proteínas de la matriz, sin embargo, a este punto está limitada a los colágenos fibrilares que pueden ser detectados por generación de segundo armónico mediante microscopía multifotónica, dejando la mayoría de los componentes de la matriz Largely invisible. Aquí se describen los procedimientos para la inoculación del tumor en la piel de la oreja dorsal fina, immunolabeling de las proteínas de la matriz extracelular y de imagen intravital del tejido expuesto en ratones vivos mediante epifluorescencia y microscopía de dos fotones. Nuestro método intravital de imágenes permite la detección directa de tanto fibrilar y proteínas de la matriz no fibrilares en el contexto de un tumor dérmico creciente. Mostramos ejemplos de remodelado vascular causada por la contracción de la matriz local. También se encontró que la matriz fibrilar del tumor detectado con la segunda generación de armónicos es espacialmente distinta de componentes de la matriz recién depositados tales como tenascina C. También mostramos a largo plazo (12 horas) de formación de imágenes de la interacción de células T con células tumorales y las células tumorales la migración a lo largo del colágeno IV de la membrana basal. Tomados en conjunto, este método permite de forma única para la detección simultánea de las células tumorales, su microambiente físico y la respuesta inmune tejido endógeno con el tiempo, lo que puede provide importantes conocimientos sobre los mecanismos subyacentes a la progresión del tumor y el éxito o la resistencia a la terapia definitiva.

Introducción

Intravital de imágenes de enfermedades inflamatorias, metastásicos y los procesos de remodelación de la matriz ha sido un área importante de la investigación y ha motivado la creación de numerosos modelos de ratones transgénicos reportero que expresan proteínas fluorescentes ^1,2. Debido a las señales de fuera de foco fluorescentes, que reducen la calidad de la imagen y los límites de penetración de la luz a través del tejido, tejido grueso de formación de imágenes es posible sólo con confocal o microscopía de barrido de múltiples fotones ^3. Usando más rápido, menos caro y complejo microscopía de epifluorescencia es posible sólo con los tejidos casi de dos dimensiones, tales como la membrana corio-alantoideo de pollo ⁴ o la dermis del oído de ratón ^5. La mayoría de los sistemas de imagen se aprovechan de ratones transgénicos que expresan diferentes proteínas fluorescentes de una manera específica del tipo celular. A pesar de que estas proteínas ofrecen fototoxicidad débil, que inducen la respuesta inmune ^6. Además, es difícil cambiar entre subtipos celulares específicos o marcar elbasal ir o estados activados como tal cambio requiere la preparación de un nuevo modelo genético. Además, como expresión de la proteína fluorescente se restringe generalmente al compartimiento intracelular, por lo general no es posible imagen estructuras extracelulares, como las proteínas de la membrana basal o depósitos de quimioquinas tejido ^7. En lugar de ello, el marcaje indirecto con anticuerpos contra antígenos extracelulares ofrece flexibilidad para prácticamente cualquier tipo de célula o matriz de componentes específica ^8,9. Sin embargo, la principal desventaja de este enfoque de etiquetado se asocia con la inmunotoxicidad mediada por complejos inmunes antígeno-anticuerpo que pueden desencadenar complemento toxicidad celular dependiente del sistema y la fagocitosis de las células y estructuras extracelulares ^10.

La matriz extracelular del microambiente del tumor, sino también de tejido normal durante la inflamación o la curación de heridas, se somete a la remodelación sustancial. Estroma de refuerzo del microambiente del tumor puede promoel crecimiento del tumor y la invasión TE debido a los mecanismos de señalización inducidas por el estrés y causa la remodelación de la sangre y los vasos linfáticos ^11. Sin embargo, de formación de imágenes en vivo de proteínas de la matriz está limitada a los colágenos fibrilares que pueden ser detectados por generación de segundo armónico mediante microscopía de múltiples fotones. Recientemente hemos publicado un nuevo método intravital de imágenes que reduce al mínimo el riesgo de daños foto-y-inmune tóxico para las células fotografiados y las estructuras de tejido ^5. En comparación con las técnicas de imagen establecidos donde la única ronda de visualización intravital continua está en un intervalo de 30 minutos a 2 horas ^12-17, nuestra técnica (SI) de inmunofluorescencia intravital permitió 12 horas (a largo plazo ⁸⁾ de formación de imágenes. Es importante tener en cuenta que el tiempo de formación de imágenes se limita a 12 horas debido a los límites definidos en el protocolo de los animales, pero no hay contra-indicaciones técnicas que no se puede prolongar si los parámetros críticos de la salud del animal, como la presión arterial y el corazóntasa se ​​controlan ^8. Además, mediante el uso de un microscopio estereoscópico de fluorescencia automatizado pudimos recoger imágenes de varios campos en un solo experimento y observamos raros procesos inmunológicos y remodelación que se produjeron en el contexto fisiológico de la piel con el apoyo de la sangre funcionales y vasos linfáticos. Debido a que la lente estereomicroscópica tiene una relativamente grande, 2 cm, distancia de trabajo y en contraste con dos fotones ópticas microscópicas no requiere vaporización inmersión en agua, tratamiento de imágenes a largo plazo se realiza sólo bajo microscopio estereoscópico de fluorescencia. Intravital Si se permite el etiquetado inmune y la detección de cualquier componente de la matriz extracelular de la piel normal. El diseño de esta técnica se basa en el concepto innovador de la utilización de la inmunotinción de las células vivas y los elementos de la matriz del tejido de la dermis de ratones expuestos quirúrgicamente sin causar efectos dañinos inmunotóxicas ^5. El procedimiento quirúrgico en sí es seguro a la dermisvasculatura ya que se basa sólo en la separación de dos capas de la piel en el oído que se inervado de forma independiente, de manera autónoma alimentada por la sangre y drenado por circulaciones separadas linfáticos. Nuestro sistema experimental permite obtener imágenes de una serie de eventos fisiopatológicos importantes sobre al menos 12 horas, incluyendo el tráfico de leucocitos entre los vasos sanguíneos y linfáticos y los procesos de cicatrización de heridas. En la publicación original, comparamos nuestra técnica con los estándares del estado de la técnica en diversos campos de la imagen intravital. En consecuencia, se observó la extravasación de los vasos sanguíneos y linfáticos eventos intravasation por varios tipos de leucocitos, incluyendo la visualización única de las células inmunes que entran en la recogida en lugar de esperar vasos linfáticos iniciales ^15. Además, como complemento de las observaciones hechas por otros grupos ^9,18, encontramos que en CCL21 in vivo es capaz de formar depósitos fuertes, discontinuos en la recogida, pero sólo con poca frecuencia en los linfáticos iniciales.

Aquí se describe un intravital modificado SI técnica que se puede combinar con la microscopía de dos fotones para detectar la red de colágenos fibrilares que utilizan generación de segundo armónico (SHG). Se demuestra que este método también se puede utilizar para la invasión de células de cáncer de formación de imágenes en el contexto del microambiente del tumor dinámico, que incluye moléculas de la matriz tales como la tenascina C, que son en gran parte sin explorar por técnicas de imagen actuales ^19. Se encontró que la matriz fibrilar del tumor, detectado con la segunda generación de armónicos, ocupa diferentes lugares del microambiente del tumor que la matriz recién depositada compuesta de tenascina C. Además, se describen ejemplos de remodelado vascular causadas por la contracción de la matriz local, de larga- plazo (12 horas) de formación de imágenes de las interacciones de células T con las células tumorales y la migración de células del tumor a lo largo de colágeno IV de la membrana basal. Este tipo de eventos se pueden obtener imágenes durante la grabación simultánea de parámetros fisiológicos locales, como pe los vasos sanguíneosrmeability y el drenaje linfático.

Protocolo

Todos los procedimientos realizados en animales se encontraban en estricta conformidad con la Ley de Protección Animal de Suiza, la ordenanza sobre protección de los animales y de la ordenanza sobre la experimentación animal. Confirmamos que nuestro Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC), llamada Comisión de Supervisión de l'Etat de Vaud (Número de permiso: 2687), específicamente aprobado este estudio.

1. La inoculación del tumor del oído

1. Cultura B16-F10-GFP células de melanoma en un plato de Petri de 10 cm usando DMEM + 10% FBS medios.
2. Cuando las células son del 80-90% de confluencia, lavarlas con PBS y separarlos por tratamiento con tripsina. Centrifugar las células a 1500 xg durante 5 min a 4 º C, resuspender el precipitado en 1 ml de solución de Ringer y la transfiere en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Girar de nuevo y eliminar todo el sobrenadante excepto una fina capa de medio que se mantiene justo por encima del sedimento. Resuspender las células a terminar con una suspensión de células de espesor.
3. Anestesiar el ratón con una mezcla de mercadoamina / dorbene [medetomidina] (75mg/kg-1mg/kg) y confirme que el animal está suficientemente anestesiado mediante la realización de una pizca dedo del pie suave. Aumenta la concentración de isoflurano en pasos de 0,1% en los movimientos de casos se observan (por ejemplo, la retirada de la pata). Mantenga el ratón sobre una almohadilla térmica controlada termistor rectal (37 ° C) durante todo el procedimiento y proteger sus ojos con un ungüento oftálmico adecuado.
4. Preparar una jeringa Hamilton (33 g de aguja, 10 ml de volumen de la jeringa). Retirar la capucha con la aguja y la carga 20 l de suspensión de células en la parte superior de la cámara de la punta. Tire del émbolo hasta 5 ml suspensión se carga en el interior de la jeringa. Retire el exceso de suspensión de la cámara de la punta y cierre la tapa de la punta.
5. Con cinta adhesiva, fije el borde proximal de la oreja en la punta de un dedo índice. En un ángulo de 45 °, introduzca lentamente la aguja de la jeringa Hamilton entre dermis dorsal y los cartílagos. Una vez dentro, penetrar en el oído proximal a distal durante unos 2-3 mm.
   Nota: El procedimiento de la inyección de células debe ser realizado por técnicos capacitados y certificados. Además este proceso se debe realizar lentamente y en secuencia: primero la aguja debe colocarse horizontalmente a la piel de la oreja y se inserta lentamente en la dermis del oído. Una vez y sólo entonces el extremo de la aguja se encuentra en la piel, el émbolo debe ser presionado. Al presionar el émbolo de iniciará células de la inoculación en la piel. En el caso poco probable de la aguja, pasando las dos capas de la dermis del oído, la capa del cartílago y entra en la piel de la persona que realiza el experimento, el dolor infligido al dedo experimentador debe ser considerado como un signo alarmante y causa la retracción inmediata de la aguja de la piel experimentador. En ese caso, el émbolo no debe ser presionado y la piel debe ser esterilizado con alcohol. Alternativamente, objeto inanimado en lugar de un dedo se puede utilizar para estabilizar el oído.
6. Inyectar suspensión celular 3 l y retraer lentamente la aguja de la oreja.Deje que las células tumorales forman un tumor sólido durante 7-9 días y siguen el crecimiento del tumor mediante el uso de un microscopio estereoscópico de fluorescencia.
7. Alternativamente, para seguir los primeros pasos de la interacción de las células tumorales con matriz de tejido, aplicar 50 l de 100.000 células tumorales suspendidas en solución de Ringer en la dermis del oído expuestos y teñidas después de la etapa (3.3).

2. Cirugía de Orejas

1. Tres días antes del experimento, afeitarse la cabeza del ratón, depilar los pelos alrededor de la cabeza y el oído (10-15 seg) y enjuagar con agua.
2. Anestesiar el ratón con una mezcla de oxígeno humedecido y isoflurano (3-4% de la inducción, mantenimiento 1-2%) y confirme que el animal está suficientemente anestesiado mediante la realización de una pizca dedo del pie suave. Aumenta la concentración de isoflurano en pasos de 0,1% en los movimientos de casos se observan (por ejemplo, la retirada de la pata). Mantenga el ratón sobre una almohadilla térmica controlada termistor rectal (37 ° C) durante todo el procedimiento y proteger sus ojos con unpomada oftálmica adecuada.
3. Construir una plataforma hecha de 8 pegados histología diapositivas de cristal. Ponga el ratón sobre su espalda y coloque suavemente el oído que tiene un tumor en la pila de láminas de vidrio. Use pequeñas tiras de cinta adhesiva para fijar los bordes anterior y posterior de la oreja a la pila.
4. Cortar la piel ventral de la oreja a lo largo del antihelix del pabellón de la oreja de ratón utilizando un bisturí. Con la ayuda de unas pinzas curvas, pelar suavemente de la dermis y el cartílago ventral de la dermis dorsales donde se inoculó el tumor. Salga de la piel ventral y el cartílago con pinzas curvas, dejando al descubierto la dermis dorsal. NOTA: Si se cortan los principales vasos del oído o de la circulación de la sangre no vuelve a flujo normal en los 15 minutos, el oído no puede ser utilizado para la imagen. Mantenga siempre la piel de la oreja abierta húmeda utilizando tampón de Ringer y proteger de la humedad mediante el uso de un cubre.
5. En caso de que haya sangrado persistente vasos tumorales forma, detener el sangrado mediante la adición de 100 ltrombina (5 U / ml) en solución de Ringer (NaCl 102 mM, KCl 5 mM, CaCl2 ₂ mM, lactato de sodio 28 mM) en la parte superior de la oreja durante 5 min.
6. Lave el oído dos veces con aproximadamente 5 ml de tampón de Ringer y eliminar el exceso de líquido con paños estériles. Inmediatamente proceder al siguiente paso (no dejes que el oído abierto seca en cualquier momento!).

3. Inmunofluorescencia La tinción

Tampón de Uso Ringer suplementado con suero humano (01:10), policlonal de ratón anticuerpo secundario de IgG humana (01:50), y 125 UI / ml (2,5 mg / ml) de aprotinina (tampón de bloqueo) para todos los pasos de tinción. La aprotinina inhibe la plasmina promover la coagulación para limitar el sangrado inicial que puede ocurrir después de la cirugía.

1. Doble la parte de la oreja con la dermis se abren en los cornetes eminencia y secar la dermis del oído sin abrir exteriores con toallitas estériles. Inmovilizar el oído en la pila de portaobjetos de vidrio mediante la aplicación de 0,5 l de pegamento quirúrgico a la anterior y posterior Dorsal bordes. Entonces, aplanar suavemente la dermis oído dorsales en el cristal.
2. Aplicar anticuerpos primarios dirigidos moléculas de la matriz extracelular a una concentración de 10 g / ml en un volumen total de 100 l de tampón de bloqueo a la oreja expuesta. Cubrir la oreja con una hoja de cubierta con el fin de evitar que la solución de tinción a secar en los bordes del oído. Incubar durante 15 min. Lave el oído dos veces con aproximadamente 5 ml de tampón de Ringer.
3. Aplicar anticuerpos secundarios apropiados o conjugados de estreptavidina (fluoróforos con una longitud de onda de excitación de alta tal como 594 nm o 647 nm son favorables para intravital de imágenes) a una concentración de 10 mg / ml en un volumen total de 100 l de tampón de bloqueo a la oreja expuesta. Cubra la oreja con un cubre y se incuba durante 15 min. Lave el oído dos veces con aproximadamente 5 ml de tampón de Ringer.

4. Interacción de esplenocitos activados transmitidas por la sangre con células tumorales in situ

1. 7 días después de inoculation de melanoma GFP-B16-F10 en la piel de la espalda de ratón congenic, practicar la eutanasia del animal y recoger el bazo. Aislar esplenocitos con disrupción mecánica del bazo a través de un filtro de células de 70 micras.
2. Esplenocitos en las etiquetas de 8 minutos a 37 ° C con Red CMTPX mancha citoplasma celular (1 M en PBS), se lavan 4 veces en 15 ml a 4 º C y se inyecta inmediatamente con medio libre de suero de 200 l en la vena de la cola de ratón cuyos oídos estaban inoculado con B16-F10-GFP 7 días antes.

5. Imaging intravital utilizando un microscopio estereoscópico

1. Para imágenes de corta duración (hasta 2 horas), añadir tampón de ascorbato-Ringer estéril recién preparada que contenga 140 ascorbato de sodio mM, HEPES 10 mM, 4 mM KCl y _CaCl2 5 mM, a un pH de 7,5 (finales de amortiguamiento del ascorbato-Ringer osmolaridad 320 mOsm) en la parte superior de la oreja inmovilizada. Cubrir el oído con un cubreobjetos y empezar de formación de imágenes mediante el uso de un microscopio estereoscópico de fluorescencia con la lente 2X.
2. Para imágenes a largo plazo(Más de 2 horas), colocar la salida de una aguja (conectado a un depósito que contiene tampón de ascorbato-Ringer) bajo el cubreobjetos, aproximadamente 0,5 cm de distancia de la oreja. Utilice una bomba peristáltica a una velocidad de 1 l / min para entregar constantemente tampón de ascorbato-Ringer a la cámara bajo el cubreobjetos.
3. Cambie la lente 1X (distancia de trabajo 6 cm) para la lente 2X (distancia de trabajo 2 cm). Abra el software de adquisición y configurar los ajustes del microscopio estereoscópico fluorescente. En ajustes de la cámara elija 12 bits como la profundidad de color de la imagen y ajustar el rango de la cámara de los valores de la escala de grises de 0% (mínimo) a 5,1% (máximo) y ajustar la corrección gamma a 2.
   1. Ajuste la ganancia de adquisición a 1 (mínimo), la intensidad de fluorescencia a 1000 (máxima), ampliación establecida en 280X-320X y ajustar el tiempo de exposición evitando sobre-o sub-exposición (tiempo de exposición debe ser inferior a 1 segundo). Dependiendo del número de campos de imagen (generalmente 10 a 20), el intervalo de tiempo para el ciclo de adquisición debe fijarse serentre 1 y 2 minutos. Acortar los tiempos pueden causar la decoloración y fototoxicidad.
4. Elija varios campos que contienen las células tumorales, así como proteínas ECM teñidas (como en la Figura 3). Uso de la platina motorizada, adquirir imágenes de los canales fluorescentes apropiados (tales como GFP y fluoróforo 647 en la Figura 3) en el tiempo (por ejemplo, cada 2 min).
5. Después del experimento, la eutanasia el ratón de acuerdo con las directrices institucionales de animales. En este caso, al final del experimento, la eutanasia el ratón anestesiado por dislocación cervical seguido de exanguinación (perfusión intracardiaca).

6. Imaging intravital utilizando un microscopio Multifotónica

1. Usando grasa de silicona, construir una pared circular de aproximadamente 2 cm de diámetro y 2-3 mm de altura alrededor de la oreja, a partir de la base de la oreja. Asegúrese de que no hay puntos de fuga. Rellene el círculo con tampón de ascorbato-Ringer.
2. Coloque el ratónen el escenario y conectar la almohadilla caliente (37 ° C).
3. Software de adquisición abierto y configurar los ajustes del microscopio multifotónica.
4. Elige hasta cuatro campos diferentes que contienen las células tumorales y las proteínas ECM manchados (como en la Figura 3). En este ejemplo, ajustar el láser Ti-zafiro y 850 nm para GFP señal de un fotón único posterior 647 para fluoróforo 647 tinción y visualizar colágenos fibrilares con SHG. Adquirir imágenes de los canales fluorescentes apropiados (tales como las buenas prácticas agrarias y fluoróforo 647 en la figura 3) y segunda generación armónica en el tiempo, por ejemplo cada 2 minutos, con la inmersión en agua HCX APO 20X con 1.00 lente NA y 2 mm de distancia de trabajo.
5. Después del experimento, la eutanasia ratón anestesiado con dislocación cervical procederse al desangrado (perfusión intracardiaca).

Resultados

Hasta la fecha, la inmunotinción en el tejido vivo no se usa normalmente debido a la formación de complejos inmunes que conducen a fondo de alta tinción e inmunotoxicidad ^20. Esto fue superada por la pre-bloqueo de los receptores Fc gamma en macrófagos tisulares, por lo que "cegar" a estas células a la posterior inmunotinción fuerte indirecta. A medida que el etiquetado era extracelular, fototoxicidad y fluoróforo blanqueo podría ser controlado por inmersión del tejido en antioxidante natural tamponada, ácido ascórbico isosmótica (fig. 1A). Desde nuestra descripción inicial de este método ^5, mejoramos nuestra técnica anti-blanqueo y contra la fototóxico para que photobleaching ahora pueden no sólo ser inhibida pero completamente impedido (Fig. 1B). Esto se hace mediante la incorporación de la oreja en un gran volumen de antioxidante (100 l) dentro de la cámara donde se inmoviliza el oído. Tenga en cuenta que el tiempo 300 segundos de imagen constante corresponde a 10 horas de proyección de imagen cuando las imágenes sonrecopilada durante 500 ms cada minuto (la configuración de medios de formación de imágenes).

Figura 1. Photobleaching y fototoxicidad se detuvo mediante la sustitución de cloruro con el ascorbato en tampón de Ringer y la incrustación de la oreja expuestos en 100 l de volumen de esa solución. (A) El tejido se tiñeron primero con un anticuerpo biotinilado contra el colágeno IV, el componente de la membrana basal. La tinción fue más tarde detectó con estreptavidina-647 (rojo), y luego constantemente fotografiada durante 300 segundos en cualquiera de búfer normales de Ringer (panel superior) o ascorbato-Ringer (panel inferior) de. Tenga en cuenta que 300 segundos de tiempo de formación de imágenes constante corresponde a 10 horas de formación de imágenes cuando las imágenes se recogieron para 500 mseg cada minuto (la configuración de imagen habituales). La más brillante del 25% del pivalores de intensidad xel son de color verde. (B) Cuantificación de la decadencia de inmunofluorescencia (50% en contra de Ringer 0% de ascorbato-Ringer). Los valores se normalizaron a la fluorescencia inicial. Las imágenes recogidas con microscopio estereoscópico inmunofluorescencia. La barra de escala en A, 100 m. Haz clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La investigación de la interacción entre las células de tumores metastásicos y estroma tumoral es crucial para entender el proceso de migración de células tumorales y la inmunidad tumoral. Esto es porque el estroma asociado a tumor compone de hasta 90% de la masa tumoral y regula activamente el crecimiento del tumor y la diseminación metastásica ^21. Sin embargo, la visión mecanicista de cómo la migración de células tumorales unidades de la matriz ya sea hacia los vasos linfáticos o los vasos sanguíneos se carece de ^22. Esto se debe parcialmente al hecho de que im intravitalenvejecimiento de proteínas de la matriz se limita a la visualización de las fibras de colágenos fibrilares madurado utilizando segunda generación de armónicos en la microscopía de dos fotones ^23. Por lo tanto, hemos adaptado nuestro método para la visualización de la microambiente del tejido incluyendo la sangre y los vasos linfáticos, pericitos, nervios, músculo y adipocitos para incluir la visualización directa de los componentes de la matriz extracelular. Muchas estructuras se pueden distinguir sobre la base de su morfología después de la inmunotinción para los componentes de la membrana basal, tales como colágeno IV o perlecan (Figura 2A), sin embargo, la tinción directa para los marcadores específicos de la superficie celular, por ejemplo Lyve1 (Fig. 2B y C) y podoplanin (Fig. . 2C), permite además distinguir, linfáticos capilares iniciales (Lyve1 ⁺⁾ de los colectores linfáticos (Lyve1 ^-). La tinción para CCL21 unido a la matriz de la piel reveló depósitos de esta quimiocina en la membrana basal de los colectores linfáticos identified con la tinción para perlecan, el proteoglicano heparán sulfato (fig. 2D).

Figura 2. Ejemplos de tinción en vivo en los oídos de un ratón normal. (A) La tinción de perlecan, un componente de la membrana basal, representa a todos los vasos sanguíneos y linfáticos, nervios, fibras musculares y adipocitos. (B) tinción Lyve1 marca la primera red capilar linfático. (C) Co-tinción para Lyve1 y podoplanin, un marcador pan-linfática, representa a las redes de los linfáticos iniciales y de recogida. La dermis dorsal del oído se pueden obtener imágenes mediante microscopía de epifluorescencia clásico (sin seccionamiento óptico) como la dermis del oído tiene un bajo número de adipocitos que de otra manera cubrir el campo de la imagen. (D) stai CCL21 ning (verde) de la membrana basal linfático teñido de perlecan (rojo). Las imágenes recogidas con microscopio estereoscópico inmunofluorescencia. Las barras de escala en A y B, 1 mm; en C, 100 micras y 50 micras de D. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Más importante aún, las proteínas estructurales que normalmente no pueden ser detectados por los grupos de autoayuda, el método de detección de la matriz clásico ^23, se pueden visualizar. Por ejemplo, se encontró que la tenascina C (Fig. 3A), una proteína de la matriz que se expresa durante la tumorigénesis, la cicatrización de heridas y la inflamación ¹⁹ se deposita en diferentes lugares de estroma tumoral que los colágenos fibrilares (Fig. 3B). Esta heterogeneidad matriz podría afectar a la distribución de las células tumorales y la metástasis (fig. 3C).

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Figura 3. La dermis dorsal del oído se pueden obtener imágenes en vivo utilizando microscopía multi-fotón. Un solo campo de tumor B16-F10. Estroma tumoral se marcó con anticuerpo tenascina C y la tinción se detectó con anti-cabra-594 anticuerpo de burro. Inmunofluorescencia de tenascina C (roja) de red se muestra en A y colágenos fibrilares detecta con generación de segundo armónico (SGH) en B. Estas dos redes se superponen con las células tumorales (cian) en C (fusionada). Nueva matriz tumoral marcado por la tenascina C no se solapa con colágenos fibrilares detectados con SHG (verde). La imagen con 44, cuatro veces en promedio z secciones con z paso 1.0 micras fue adquirido en el modo de profundidad de color de 16 bits. Las imágenes recogidas con el microscopio de dos fotones. La barra de escala, 100 m.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg" target = "_blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tras la inmunomarcación de diferentes componentes de la matriz tumoral (por ejemplo, la tenascina C y colágeno IV) de la matriz tumoral que pudimos identificar restringida y eventos súbitos de tumor remodelación direccional matriz (Video 1). Fuerzas que se desarrollan dentro microambiente del tumor pueden dar lugar a la expansión o contracción de la matriz tumoral y en la remodelación de consecuencia y el alargamiento de la vasculatura del tumor a un grado similar como se mostró anteriormente en el caso de la curación de heridas ^11,24.

Vídeo 1. De expansión de la matriz tumorales marcadas con colágeno IV (rojo) y la tenascina C (cian) alargado vasos sanguíneos (flechas) y pasivamente trasladar tres células tumorales (verde). Contracción localizada de teascin C-rica tumor matriz translocate vaso sanguíneo (rojo orientado horizontalmente estructuracióne) por aproximadamente 100 micras durante 12 horas de formación de imágenes. Las imágenes recogidas con microscopio estereoscópico inmunofluorescencia. Haz click aquí para ver el video.

Usando microscopía multi-fotón con etiquetado fluoróforo es problemático, ya que el flujo de fotones utilizados en estos experimentos se blanquear rápidamente tintes fluorescentes que no están protegidos contra la oxidación ^25. Aquí mostramos que podemos realizar de dos fotones de time-lapse microscopía mientras que las imágenes simultáneamente matriz tenascina C immunolabeled con fotoblanqueo mínima de fluoróforos incluso en alta densidad de fotones microscopía de dos fotones (Video 2).

Video 2. Fotoblanqueo Bajo nivel de C inmunofluorescencia tenascina (rojo) durante la microscopía de dos fotones. Células tumorales B16-F10-GFP (cian) se obtuvieron imágenes en la oreja dorsal abierta 9 días después de la inoculación. La señal fluorescente fue protegido por la aplicación de ascorbato-Tampón de Ringer sobre el tejido fotografiado. Generación de segundo armónico (verde) no se solapa con nueva matriz representado por C. imagen profundidad de color de 16 bits tenascina con 11, cuatro veces promedio de z secciones con z-etapa 1.9 micras fue adquirida durante 15 min. Las imágenes se recogieron cada 1 minuto 5 segundos en 6 z aviones recogidos. Haz clic aquí para ver el video.

También Imaged interacciones célula inmune con células tumorales metastásicas. Esplenocitos marcados CMTPX de un ratón portador de tumor extravasado de asociados al tumor de los vasos sanguíneos 8 horas después de la transfusión intravenosa, invadieron la matriz tumoral e interactuaron activamente con las células tumorales mediante la formación de larga duración contactos celulares (Video 2). Estructuras marcadas con fluoróforo-647 de colágeno IV fueron resistentes a photobleaching durante las 12 horas de imágenes.

Vídeo 3. Interacción de esplenocitos marcados con CMTPX de tumor (B16-F10)-bearing ratón con células tumorales individuales (GFP-B16-F10). esplenocitos fueron iv transfundida después de la tinción de tejidos para el colágeno IV. El colágeno IV-verde (647), los esplenocitos-roja (CMTPX), cian B16-F10 (GFP). Las imágenes recogidas con microscopio estereoscópico inmunofluorescencia. Duración del video 12 horas. Haz clic aquí para ver el video.

Células tumorales recién aisladas fueron superpuestos en la dermis del oído expuestos previamente teñidas para colágeno IV. Podríamos observado que después de adherir al tejido algunos grupos de células comenzaron la migración colectiva a lo largo de la membrana basal de los vasos sanguíneos y los adipocitos.

Vídeo 4. Las células tumorales migran a lo largo de las membranas basales. La piel normal del oído manchado para el colágeno IV (647, rojo) se cubrió con un pase reciente células B16-F10-GFP y la imagen durante 5 horas. Algunas células tumorales que se adhirieron al tejido empezaron a lo largo de la migración colectivala membrana basal de los vasos sanguíneos y los adipocitos. Las imágenes recogidas con microscopio estereoscópico inmunofluorescencia. Duración del video:. 5 horas Haga clic aquí para ver el video.

Además, debido a la dermis del oído es prácticamente bidimensional, podríamos recopilamos fácilmente grandes volúmenes de datos mediante microscopía estereoscópica fluorescencia rápido, en lugar de confocal más lento y más caro o microscopía multifotónica. Sin embargo, también es posible utilizar cualquiera de los métodos de microscopía de barrido mencionados con nuestra intravital si las preparaciones (Fig. 3, Vídeo 1).

Discusión

Significado

Aquí se presenta un enfoque novedoso microscopía intravital que permite una alta resolución y visualización dinámica de los diferentes componentes del microambiente del tejido, incluyendo fibrilar, así como proteínas de la matriz de tipo malla. Este método tiene varias ventajas sobre las técnicas actuales de formación de imágenes intravital: (i) de imágenes de fluorescencia intravital se ha utilizado en estudios de la microcirculación, por ejemplo, para realizar un seguimiento soluto fugas de la sangre o en los vasos linfáticos, pero no se ha combinado con la inmunotinción. (Ii) El empleo de reportero ratones modificados genéticamente permite determinados tipos de células para ser fotografiados, pero requiere de la disponibilidad (o esfuerzo sustancial para crear otras nuevas) y limita el número de interactuar tipos de células que se pueden estudiar. (Iii) La matriz extracelular se pueden obtener imágenes in vivo utilizando segunda generación de armónicos, pero esta técnica sólo puede detectar colágenos fibrosos, dejando un gran número de componentes extracelulares importantestales como las membranas basales, fibronectinas, tenascinas, factores de crecimiento, quimiocinas y glicosaminoglicanos tejido fuera del alcance de la investigación actual. Nuestro método supera estas limitaciones, y permite que las técnicas de imagen estándar para ser incorporados y más combinan con inmunotinción para otros tipos de células, estructuras de tejido, los depósitos de sulfato de heparina de unión de factores de crecimiento (por ejemplo VEGF ²⁶⁾ y quimiocinas (CCL21 y ^5,18. Fig. 2D ), o proteínas de la matriz extracelular mientras que el seguimiento de forma simultánea en la sangre y / o en los flujos linfáticos.

Limitaciones

La formación de imágenes de epifluorescencia intravital de SI se limita a los colgajos de piel delgadas, privados de hipodermis gruesas (tejido adiposo). Si bien hemos encontrado que la dermis del oído dorsal es óptima para la exposición quirúrgica relativamente inofensiva de la piel de la oreja, con epifluorescencia intravital SI técnica no se limita a la dermis del oído y potencialmente se podrían aplicar a por ejemplo,la piel expuesta de los dedos del pie o la piel de la espalda del ratón recién nacido. Tinción de anticuerpos rápida (15 minutos) en inmunofluorescencia SI no depende de la difusión pasiva, sino que requiere el drenaje linfático funcional y el flujo de fluido intersticial, por lo tanto, ninguna tinción se puede observar si los vasos linfáticos se ocluyen ^27. En línea con esto, los vasos linfáticos se tiñen más fuerte vasculatura sanguínea luego gotea (vasos lesionados, arteriolas) ^5. La separación de la dorsal y ventral del oído colgajos de piel es un procedimiento quirúrgico leve pero causa daño a algunos capilares y la muerte celular a diversas células del tejido. Esto podría ser un problema cuando se necesita investigar tejido completamente intacto, por ejemplo, en términos del efecto leve de medicamentos sobre la supervivencia celular. También la aplicación de antioxidante que sirve para proteger la piel de la fototoxicidad y fotoblanqueo excluye el uso de la técnica de inmunofluorescencia intravital para estudiar por ejemplo, el estrés oxidativo de tejidos o Biolog óxido nítricoY.

Por último, el cegamiento de los macrófagos residentes del tejido con complejos inmunes puede activar estas células y la influencia por ejemplo el estudio de la respuesta inmune del tejido y la activación de células dendríticas.

Modificaciones y solución de problemas

Con el fin de estudiar el estrés oxidativo del tejido o de la biología óxido nítrico, ascorbato tiene que ser reemplazado con otros medios de comunicación compatible con los tejidos que no interfiera con la salida experimental. Del mismo modo, los receptores de Fc de bloqueo en las células inmunes dérmicos deben evitarse si el objetivo del estudio es la función y la activación de la respuesta inmune de tejido y activación de células dendríticas y la migración. Esto se puede hacer con el uso de anticuerpo secundario con fragmento Fc troceados (F (ab) 2 de anticuerpos) o el uso de anticuerpo biotinilado y estreptavidina fluorescente como reactivos de detección.

Las aplicaciones futuras

Presentamos un intra novedoso y únicovital si la técnica para obtener imágenes de los componentes no fibrilares de la matriz extracelular en tumores de piel trasplantables en combinación con fibrilar detectado-SHG y colágenos madurado utilizando microscopía de dos fotones. Una de las ventajas de la utilización de múltiples fotones (o confocal) de formación de imágenes de microscopía de epifluorescencia sobre posibilidad es-Z apilamiento y en consecuencia espacial co-localización de los eventos que ocurren dentro de la matriz extracelular, por ejemplo, la intravasación tumoral en linfático o vaso sanguíneo, que en el caso de los microscopía de epifluorescencia estándar puede ser sólo inferirse de cambios morfológicos de la célula invasora. Esta técnica tiene un potencial mucho más amplio. Por ejemplo, hemos utilizado la intravital SI para investigar el mecanismo de la oclusión linfático mediante terapia fotodinámica-linfático específico ^27. Aplicaciones potenciales adicionales de este método incluyen, pero no se limitan a la investigación de la inmunidad de la piel durante la inflamación, el mecanismo de rechazo o métodos de la sangre y la linfa trasplante crecimiento de los vasos ática durante la tumorigénesis.

Los pasos críticos en el procedimiento

El paso más importante que tiene implicaciones críticas para el mantenimiento de un entorno de tejido fisiológico es una separación quirúrgica de la piel ventral y el cartílago de la dermis dorsal. Cortar u ocluir el principal arteria o vena dará lugar a un sangrado excesivo e hipoxia tisular local, lo que afectará a la respuesta celular a los tratamientos y el movimiento celular ^8. Inmovilizar el oído con pegamento quirúrgico se debe hacer con cuidado ya que se derrame el pegamento en exponer el tejido causará una lesión permanente en el tejido por la oclusión de los vasos sanguíneos. La temperatura del ratón debe ser controlado y se mantiene a 37 ° C. Además, oxígeno humidificado necesita ser utilizado para la anestesia con isoflurano, de manera que los ojos y los pulmones se mantienen adecuadamente humidificado durante el experimento. Además, el ascorbato de sodio debe prepararse justo y su pH comprobado antes de su uso.

ntent "> En resumen, este inmunofluorescencia intravital puentes en tiempo real, las mediciones locales de la función fisiológica con imagen molecular de eventos celulares complejos en la piel de ratón. Además, este método tiene un gran potencial, ya que puede ser fácilmente aplicado a, por ejemplo estudio post-desarrollo mecanismos de sangre y la linfa-angiogénesis o para visualizar las primeras fases de la infección de la piel por diversos agentes patógenos. Con su flexibilidad y alto potencial de rendimiento, esta técnica intravital pueden contribuir significativamente a múltiples campos de la biología.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cepa
de ratones Ratones BALB/C (8-12 semanas	) Charles River		Orleans, Francia
C57/Bl6 Ratones (8-12 semanas)	Harlan		Carshalton UK
Cell Line
B16 F10 Melanoma que expresa OVA-GFP
Mantenimiento de Anestesia
Isofluorano	Minrad Inc.	2222	Minrad Inc., Buffalo, NY
Sistema de entrega humidificado	Rothhacher GmBH		Berna, Suiza
Sistema de control de temperatura de CC	FHC Inc		Bowdoin, MA
Microscopio estereoscópico
Microscopio estereoscópico de fluorescencia con platina motorizada.	M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Alemania
Lente 1X (aumento del sistema lineal de 7,5X a 160X)	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Alemania
Lente 2X (aumento del sistema lineal de 15,6X a 320X)	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Alemania
Cámara DFC 350 FX controlada por el software LAS AF	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Alemania
Microscopía multifotónica
LEICA SP5, multiplicador de dos fotones, platina motorizada	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Alemania
HCX APO 20X/1.2 inmersión en aceite
Chameleon Ultra Laser
Tampón de Ringer (102 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 28 mM de lactato de sodio)	B. Braun Medical AG	445968	Sempach, Alemania
Aprotinin	Elastina	AP92	Owensville, MO
Trombina	Sigma-Aldrich	T7326-1KU	Taufkirchen, Alemania
Ascorbato de sodio	Sigma-Aldrich	11140-50G	Taufkirchen, Alemania
Suero de ratón criado contra IgG humana	Abcam	ab34834	Cambridge, Reino Unido
Colágeno IV	Abcam	AB6581	Cambridge, Reino Unido
Perlacan	RnD	ab79465	Minneapolis, MN
Tenascin C	RnD	AF3358	Minneapolis, MN
Podoplanin	RnD	AF3244	Minneapolis, MN
LYVE-1	Reliatech	103-PA50	Wolfenbü ttel, Alemania
CCL21	RnD	AF457	Minneapolis, MN
Estreptavidina Azul del Pacífico	Invitrogen	S11222	Grand Island, NY
Streptavidin Alexa 647	Invitrogen	S21374	Grand Island, NY
Streptavidin Alexa 488	Invitrogen	S11223	Grand Island, NY
Burro Anti Cabra 594	Invitrogen	A21113	Grand Island, NY
Burro Anti Conejo 594	Invitrogen	A21207	Grand Island, NY
CMTPX CellTracker	Lifetechnologies	C34552	Carlsbad, California
Histocryl (pegamento quirúrgico)	Braun Aesculap	1050060	Tuttlingen, Alemania
Reactivos de cultivo celular
Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM	Gibco Invitrogen	E15-843	Grand Island, NY
Suero fetal bovino (FBS	Gibco Invitrogen		Grand Island, NY
Trypsin	Gibco Invitrogen	25300062	Grand Island, NY
PBS	Gibco Invitrogen		Grand Island, NY