Medición pH simultánea en Endocítica y citosólicas compartimentos en las células vivas usando microscopía confocal

Resumen

Existen varios métodos para medir el pH intracelular, pero muy pocos de ellos permiten la medición simultánea del pH citoplasmático y orgoncelar. Aquí, describimos en detalle una metodología rápida y precisa para medir simultáneamente el pH citoplasmático y vesicular mediante imágenes radiométricas de células vivas.

Resumen

El pH intracelular está estrechamente regulado y se han reportado diferencias en el pH entre el citoplasma y los orgánulos¹. La regulación del pH celular es crucial para el control homeostático de los procesos fisiológicos que incluyen: síntesis de proteínas, ADN y ARN, tráfico vesicular, crecimiento celular y división celular. Las alteraciones en la homeostasis del pH celular pueden conducir a cambios funcionales perjudiciales y promover la progresión de diversas enfermedades². Existen varios métodos para medir el pH intracelular, pero muy pocos de ellos permiten la medición simultánea del pH en el citoplasma y en los orgánulos. En este trabajo describimos en detalle un método rápido y preciso para la medición simultánea del pH citoplasmático y orgonelar mediante el uso de microscopía confocal en células vivas³. Este objetivo se logra con el uso de dos tintes radiométricos sensibles al pH que poseen una partición selectiva del compartimento celular. Por ejemplo, SNARF-1 está compartimentado dentro del citoplasma, mientras que HPTS está compartimentado dentro de orgánulos endosómicos/lisosomales. Aunque el HPTS se usa comúnmente como un indicador de pH citoplasmático, este colorante puede marcar específicamente vesículas a lo largo de la vía endosómica-lisosomal después de ser absorbido por la pinocitosis^3,4. Con el uso de estas sondas sensibles al pH, es posible medir simultáneamente el pH dentro de los compartimentos endocítico y citoplasmático. La longitud de onda de excitación óptima de HPTS varía en función del pH, mientras que para SNARF-1, es la longitud de onda de emisión óptima la que varía. Después de la carga con SNARF-1 y HPTS, las células se cultivan en diferentes soluciones calibradas con pH para construir una curva estándar de pH para cada sonda. La obtención de imágenes celulares por microscopía confocal permite la eliminación de artefactos y ruido de fondo. Debido a las propiedades espectrales del HPTS, esta sonda es más adecuada para la medición del compartimento endosomal ligeramente ácido o para demostrar la alcalinización de los orgánulos endosómicos/lisosomales. Este método simplifica el análisis de datos, mejora la precisión de las mediciones de pH y se puede utilizar para abordar preguntas fundamentales relacionadas con la modulación del pH durante las respuestas celulares a desafíos externos.

Protocolo

1. Preparación de las soluciones de calibración pH celular

1. Agregue los siguientes compuestos de cinco tubos de 50 ml cónicos separados para preparar 5 soluciones que se utilizarán para la calibración:
   • De NaCl (1 ml de 1 M de NaCl) (1 M de NaCl = 0,58 g en 10 ml de H ₂ 0)
   • KCl (6,75 ml de KCl 1 M) (1 M KCl = 0,75 g en 10 ml de H ₂ 0)
   • La glucosa (1 ml de 1 M de D-glucosa) (1M D-glucosa = 1,80 g en 10 ml de H ₂ 0)
   • MgS0 ₄ (0,05 ml de 1 M _MgSO4) (1 M _MgSO4 = 1,20 g en 10 ml de H ₂ 0)
   • HEPES 20 mM (1 ml de HEPES 1 M) (1 M HEPES = 2,38 g en 10 ml de H ₂ 0)
   • _CaCl2 (0,05 ml de _CaCl2 1 M) (1 M de CaCl ₂ = 1,47 g en 10 ml de H ₂ 0)
     Preparar todas las soluciones en doble destilada H ₂ O _(ddH2O).
2. Complete cada solución con 35 ml de _ddH2O y mezclar con un agitador magnético hasta que por lolución se logra.
3. Ajuste el pH de cada solución con KOH 1 N o HCl 1 N para obtener valores de pH de 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 y 7,5. A continuación, ajuste el volumen con agua desionizada hasta un volumen final de 50 ml.
4. Medida 5 mg de nigericina y agregarlo a 670 l de EtOH absoluto para preparar a 10 mM nigericina solución madre.
   Precaución: nigericina es altamente tóxica y debe manejarse con mucho cuidado (guantes, gafas de seguridad y mascarilla). Mezclar la solución por inversión hasta que la nigericina se haya disuelto completamente.
5. Añadir 0,05 ml de 10 mM de nigericina (concentración final 10 mM) a cada solución de calibración. Nigericina es un ionóforo que aumenta la permeabilidad de la membrana celular y causa de equilibrado del pH intracelular y extracelular en presencia de una concentración de despolarización de K ⁺ extracelular.
6. Soluciones de calibración se pueden almacenar hasta 1 mes a 4 ° C

2. Preparación de la célula

1. Bajo un safet biológicaY capó, en células de semillas 35 mm de placas de cultivo de 10 mm x en 2 ml de medio de crecimiento suplementado con suero bovino fetal al 10% y antibióticos. Utilice la cantidad de células necesaria para asegurar aproximadamente el 50% de confluencia después de 24 horas.
   NOTA: En nuestros experimentos, utilizamos la línea celular HT-1080 y 1 x 10 ⁵ células por placa de cultivo en placa.
2. Determinar el número de placas de cultivo necesarios para el experimento y la placa 5 placas de cultivo adicionales que se utilizarán para la calibración.
3. Platos sitúan la cultura en el C / 5% de CO ₂ incubadora a 37 º durante al menos 24 horas.

3. Preparación de sondas de sensor de pH

1. Preparar una solución madre 1 M de la sonda de pH fluorescente 8-hidroxipireno-1, 3,6 trisulfónico, sal trisódica (HPTS / piranina) en ddH ₂ 0. Esta solución debe ser almacenada a temperatura ambiente y protegido de la luz.
2. Preparar una solución madre de 1 mM 5 - (y-6)-carboxilo seminaphthorhodafluor acetoximetil éster de acetato (C-SNARF-1 am; llamado thereâespués de SNARF-1) por disolución de 1 mg de SNARF-1 en 1,76 ml de DMSO. Mezcle bien con la pipeta repetido. SNARF-1 solución deberá conservarse a -20 ° C y protegido de la luz.

4. Etiquetado Celular

1. Dieciséis horas antes de imágenes de células vivas, añadir 2 l de solución madre 1 M de HPTS (concentración final 1 mM) a cada placa de cultivo que contiene 2 ml de medio completo.
2. Vuelva a poner las placas de cultivo a la incubadora. La sonda HPTS es celular-impermeant, por lo tanto, a la etiqueta organelos la sonda debe ser tomado por pinocitosis. Esta condición requiere que las incubaciones de células con HPTS se llevan a cabo en medio de cultivo suplementado con suero.
3. Tras la incubación con HPTS, se lavan las células dos veces con PBS estéril y añadir 2 ml de medio libre de suero durante al menos 2 horas. La incubación con SNARF-1 necesita ser realizada en medio libre de suero, porque el suero puede prevenir la absorción de la sonda.
4. Añadir 10 l de una SNARF-1 de solución madre 1 mM para obtener afconcentración inal de 5 M y permiten a las células se incuban durante 20 minutos a 37 ° C, bajo luz tenue. C-SNARF-1 concentración y tiempo de incubación pueden variar según el tipo de célula.
5. Al final de la incubación, lavar las células dos veces en PBS estéril y añadir 2 ml de medio libre de suero.

5. La adición de pH Moduladores

1. Para evaluar si el método puede detectar cambios de pH en las células, diferentes reactivos que modulan el pH intracelular se pueden utilizar:
   • Bafilomicina A1, un inhibidor específico de la V-ATPasa ⁵
   • De Na ⁺ / H ⁺ intercambiador de isoforma 1 (NHE-1) ⁶
   • NH ₄ Cl, una base débil que aumenta intracelular pH ⁷
   1. Preparar las soluciones madre de los reactivos mencionados anteriormente:
      • Bafilomicina A1: añadir 10 g de bafilomicina A1 a 160 l de DMSO para obtener una solución madre de 100 mM
      • EIPA: añadir 25 mg de EIPA a 1,67 ml de metanol para obtena concentración final de 50 mM
      • _NH4Cl: disolver 0,53 g de cloruro de amonio en 10 ml de _ddH2O para obtener una concentración final de 1 mM.
      
      Nota: Todas las soluciones madre deben mantenerse a 4 ° C con excepción de bafilomicina A1, que deben ser almacenados a -20 ° C y protegido de la luz.
   2. En placas de cultivo separadas, agrega uno de los reactivos como se indica a continuación:
      • 2 l de 100 mM bafilomicina A1 (concentración final 100 nM)
      • 1 l de 50 mM EIPA (concentración final 25 mM)
      • 40 l de 1 M _NH4Cl (concentración final 20 mM)
   3. Se incuban las células durante 30 min a 37 ° C.
2. Proceder a la adquisición de imágenes.

6. Especificaciones del microscopio Células vivas imágenes y ajustes de adquisición

1. Realizar imágenes de células vivas utilizando un objetivo de 40x montada en un escaneo confocal espectral invertida microscópicape equipado con una platina motorizada XY, una cámara que acomoda vidrio placas de cultivo de fondo en un ambiente controlado (temperatura, humedad, CO ₂₎ etapa incubadora.
2. El instrumento confocal (Olympus FV1000) usado aquí está equipado con:
   • Un láser de diodo de 405 nm
   • Un láser de argón de 40 mW (458 nm, 488 nm, 515 nm)
   • Un láser de helio-neón (543 nm)
   • Fluorita objetivo 10X, NA0.4
   • Un objetivo LUCPLFLN 40X, NA0.60
   • Un objetivo aceite PLAPONSC PLAN APO 60X, NA1.4
   • Un espejo dicroico 405/458/488/543 DM
   • Un SDM 560 y un SDM 640 filtros dicroicos
   • Un filtro de barrera BA655-755
   • A BS20/80 divisor de haz
   • Software de análisis de datos para la adquisición y análisis de imágenes,
3. Una vez que la etapa incubadora se ha calentado a 37 ° C y el microscopio está establecido, coloque una placa de cultivo previamente incubados con HPTS y SNARF-1 en la cámara de imagen confocal etapa.
4. Laespués de la localización de un área de interés, ajustar la configuración de adquisición de software Figura 1.
   • La creación de dos conjuntos de canales virtuales.
   • Iniciar la primera fase que corresponde a HPTS excitación a 405 nm y recogida de emisión a 505-525 nm y SNARF-1 excitación a 543 nm y recogida de emisión a 570-600 nm.
   • Iniciar la segunda fase que corresponde a HPTS excitación a 458 nm y recogida de emisión a 505-525 nm y SNARF-1 excitación a 543 nm y recogida de emisión a 640-650 nm.
   • La apertura confocal se establece en 175 micras por defecto y apertura óptimos debe configurarse manualmente a 300 micras.
   • Tome imagen apilando secciones ópticas horizontales en serie (800 x 800 píxeles) de 0,4 m de espesor.

NOTA: Un objetivo de 40X es útil observar varias celdas a la vez y funciona bien para la visualización orgánulo. Sin embargo, la resolución espacial y la intensidad de la señal son better logra utilizando un objetivo de aceite de 60X. Además, no hay ninguna excitación o de emisión de la diafonía entre los dos colorantes.

7. Calibración de sondas de pH con sensor

1. Antes de la calibración, retire medio de la placa de cultivo previamente incubadas con HPTS y SNARF-1, lavar dos veces con PBS estéril y luego añadir 2 ml de una de las cinco soluciones de calibración.
2. Coloque la placa de cultivo en la cámara etapa confocal.
3. Proceda a la adquisición de la imagen de lapso de tiempo de acuerdo a los siguientes parámetros:
   1. Configure el número de imágenes y de los tiempos de duración de intervalo para el experimento.
      NOTA: Por lo general utilizan un intervalo de 1 minuto entre las imágenes para un máximo de 30 min.
   2. Programar el obturador para cerrar entre la adquisición de cada imagen.
4. Anote la intensidad de fluorescencia por minuto en un software de hoja de cálculo y determinar el momento en el que la intensidad de fluorescencia es constante. PH intracelular es generalmente estable después del 15 - 20 min.
5. REPEAT pasos 7.1 a 7.4 usando una nueva placa de cultivo para cada solución de calibración restante.

8. Adquisición de Datos

1. Una vez que la calibración se ha hecho, la adquisición de datos de la muestra 4-5 campos elegidos al azar que contienen 15 a 20 células por campo. Dos imágenes se obtienen para cada campo: uno para el etiquetado de HPTS (vesículas) y la segunda para SNARF-1 etiquetado (citosol).
2. La fluorescencia de fondo (zona extracelular) se resta digitalmente de imágenes fluorescentes de ambas sondas. Vesículas etiquetadas y citosol de sus respectivas imágenes almacenadas se seleccionan usando una máscara binaria. Para cada sonda de pH con sensor de intensidad de fluorescencia se miden en una escala numérica (0-4,095 escala de nivel de gris). Una intensidad media para todos los píxeles en el orgánulo o citoplasma se calcula y valores se utilizan para calcular los coeficientes de fluorescencia.

9. Análisis de Datos

1. Distintos paquetes de software disponibles en el mercado para el análisis de datos. IeSoftware Fluoview.
2. En una hoja de cálculo, valores de registro y cálculo de coeficientes de fluorescencia de la siguiente manera: En el caso de HPTS, R = (F _{458 nm} / F _{405 nm)} y, en el caso de SNARF-1, R = (F _{644 nm} / F _{584 nm} ).
3. Grafica los datos utilizando software de gráficos científico como GraphPad Prism. La trama debe representar coeficientes de fluorescencia (eje Y) como una función del pH (eje X). El ajuste de curvas se consigue mediante regresión no lineal.
4. Recoger la intensidad de fluorescencia de las muestras como se describe en el paso 8.2 y calcular los coeficientes de fluorescencia. Utilice las curvas de calibración para transformar relaciones en valores de pH.

Resultados

Para la medición simultánea de pH en tanto intracelular y compartimentos celulares endosomal / lisosomales, se utilizaron las sondas fluorescentes de pH de detección ratiometric SNARF-1 y HPTS. SNARF-1 está limitada al compartimiento citosólico de HPTS mientras que permite la medición del pH radiométrica del compartimiento endosomal / lisosomal. Carga celular con HPTS durante 16 horas permite su localización selectiva en endosomas / lisosomas ^4. Un ejemplo típico de fluorescencia registrada a partir de célula...

Discusión

Es necesaria la medición cuantitativa de pH en imágenes de células vivas de diferentes compartimentos celulares para medir con precisión las variaciones de pH en las respuestas celulares a los desafíos externos. Sin embargo, uno de los principales obstáculos que queda es para apuntar fácilmente y, específicamente, los compartimentos celulares. A este respecto, algunos estudios han puesto de relieve el uso de HPTS como un indicador de pH intracelular introducido en las células mediante electroporación o microinyección

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Soluciones para la calibración
Cloruro de sodio	Fischer	L-11621
Cloruro de potasio	Fischer	M-12445
D-Glucosa (dextrosa)	Fischer	D16-1
Sulfato de magnesio	Fischer	M65-500
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Cloruro de calcio dihidratado	Fischer	M-1612
Agua desionizada	N/A	N/A
Nigericina	Calbiochem	481990	Tóxico por inhalación o en contacto con la piel
Mantener protegido de la luz a 4 &°; C
Placas de cultivo y vacías; 35mm	BD Biosciences	354456
sondas sensibles al pH Ácido
8-hidroxipireno-1,3,6-trisulfónico (HPTS)	Life technologies	H-348	Mantener alejado de la luz a temperatura ambiente
5-(y-6)-Carboxy SNARF®-1, Acetoximetil Éster, Acetato	Life technologies	C-1271	Manténgase alejado de la luz y la humedad a -20 ° C; C
Dimetil Sufóxido (DMSO)	Fischer	BP231-1	nocivo
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 100X
Cloruro de potasio	Fischer	M-12445	20 g
Fosfato de sodio monobásico	Fischer	S369-1	115 g
Fosfato de potasio monobásico	J.T Baker	3246-01	20 g
Agua desionizada	N/A	N/A	Llevar a 1 L
Autoclave y ajustar el pH a 7,4
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X
PBS 100X	N/A	N/A	50 ml
Cloruro de sodio	Fischer	L-11621	40,5 g
Agua desoinizada	N/A	N/A	Llevar a 5 L
moduladores
Bafilomycin A1	Sigma-Aldrich	B-1793
5-(N-etil-N-isopropil)amilorida (EIPA)	Sigma-Aldrich	A3085
Cloruro de amonio	Fischer	A649-500

de pH