Medición pH simultánea en Endocítica y citosólicas compartimentos en las células vivas usando microscopía confocal

Resumen

Existen varios métodos para medir el pH intracelular, pero muy pocos de ellos permiten la medición simultánea del pH citoplasmático y orgoncelar. Aquí, describimos en detalle una metodología rápida y precisa para medir simultáneamente el pH citoplasmático y vesicular mediante imágenes radiométricas de células vivas.

Resumen

El pH intracelular está estrechamente regulado y se han reportado diferencias en el pH entre el citoplasma y los orgánulos¹. La regulación del pH celular es crucial para el control homeostático de los procesos fisiológicos que incluyen: síntesis de proteínas, ADN y ARN, tráfico vesicular, crecimiento celular y división celular. Las alteraciones en la homeostasis del pH celular pueden conducir a cambios funcionales perjudiciales y promover la progresión de diversas enfermedades². Existen varios métodos para medir el pH intracelular, pero muy pocos de ellos permiten la medición simultánea del pH en el citoplasma y en los orgánulos. En este trabajo describimos en detalle un método rápido y preciso para la medición simultánea del pH citoplasmático y orgonelar mediante el uso de microscopía confocal en células vivas³. Este objetivo se logra con el uso de dos tintes radiométricos sensibles al pH que poseen una partición selectiva del compartimento celular. Por ejemplo, SNARF-1 está compartimentado dentro del citoplasma, mientras que HPTS está compartimentado dentro de orgánulos endosómicos/lisosomales. Aunque el HPTS se usa comúnmente como un indicador de pH citoplasmático, este colorante puede marcar específicamente vesículas a lo largo de la vía endosómica-lisosomal después de ser absorbido por la pinocitosis^3,4. Con el uso de estas sondas sensibles al pH, es posible medir simultáneamente el pH dentro de los compartimentos endocítico y citoplasmático. La longitud de onda de excitación óptima de HPTS varía en función del pH, mientras que para SNARF-1, es la longitud de onda de emisión óptima la que varía. Después de la carga con SNARF-1 y HPTS, las células se cultivan en diferentes soluciones calibradas con pH para construir una curva estándar de pH para cada sonda. La obtención de imágenes celulares por microscopía confocal permite la eliminación de artefactos y ruido de fondo. Debido a las propiedades espectrales del HPTS, esta sonda es más adecuada para la medición del compartimento endosomal ligeramente ácido o para demostrar la alcalinización de los orgánulos endosómicos/lisosomales. Este método simplifica el análisis de datos, mejora la precisión de las mediciones de pH y se puede utilizar para abordar preguntas fundamentales relacionadas con la modulación del pH durante las respuestas celulares a desafíos externos.

Protocolo

1. Preparación de las soluciones de calibración pH celular

1. Agregue los siguientes compuestos de cinco tubos de 50 ml cónicos separados para preparar 5 soluciones que se utilizarán para la calibración:
   • De NaCl (1 ml de 1 M de NaCl) (1 M de NaCl = 0,58 g en 10 ml de H ₂ 0)
   • KCl (6,75 ml de KCl 1 M) (1 M KCl = 0,75 g en 10 ml de H ₂ 0)
   • La glucosa (1 ml de 1 M de D-glucosa) (1M D-glucosa = 1,80 g en 10 ml de H ₂ 0)
   • MgS0 ₄ (0,05 ml de 1 M _MgSO4) (1 M _MgSO4 = 1,20 g en 10 ml de H ₂ 0)
   • HEPES 20 mM (1 ml de HEPES 1 M) (1 M ....

Resultados

Para la medición simultánea de pH en tanto intracelular y compartimentos celulares endosomal / lisosomales, se utilizaron las sondas fluorescentes de pH de detección ratiometric SNARF-1 y HPTS. SNARF-1 está limitada al compartimiento citosólico de HPTS mientras que permite la medición del pH radiométrica del compartimiento endosomal / lisosomal. Carga celular con HPTS durante 16 horas permite su localización selectiva en endosomas / lisosomas ^4. Un ejemplo típico de fluorescencia registrada a partir de célula.......

Discusión

Es necesaria la medición cuantitativa de pH en imágenes de células vivas de diferentes compartimentos celulares para medir con precisión las variaciones de pH en las respuestas celulares a los desafíos externos. Sin embargo, uno de los principales obstáculos que queda es para apuntar fácilmente y, específicamente, los compartimentos celulares. A este respecto, algunos estudios han puesto de relieve el uso de HPTS como un indicador de pH intracelular introducido en las células mediante electroporación o microinyección

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Soluciones para la calibración
Cloruro de sodio	Fischer	L-11621
Cloruro de potasio	Fischer	M-12445
D-Glucosa (dextrosa)	Fischer	D16-1
Sulfato de magnesio	Fischer	M65-500
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Cloruro de calcio dihidratado	Fischer	M-1612
Agua desionizada	N/A	N/A
Nigericina	Calbiochem	481990	Tóxico por inhalación o en contacto con la piel
Mantener protegido de la luz a 4 &°; C
Placas de cultivo y vacías; 35mm	BD Biosciences	354456
sondas sensibles al pH Ácido
8-hidroxipireno-1,3,6-trisulfónico (HPTS)	Life technologies	H-348	Mantener alejado de la luz a temperatura ambiente
5-(y-6)-Carboxy SNARF®-1, Acetoximetil Éster, Acetato	Life technologies	C-1271	Manténgase alejado de la luz y la humedad a -20 ° C; C
Dimetil Sufóxido (DMSO)	Fischer	BP231-1	nocivo
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 100X
Cloruro de potasio	Fischer	M-12445	20 g
Fosfato de sodio monobásico	Fischer	S369-1	115 g
Fosfato de potasio monobásico	J.T Baker	3246-01	20 g
Agua desionizada	N/A	N/A	Llevar a 1 L
Autoclave y ajustar el pH a 7,4
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X
PBS 100X	N/A	N/A	50 ml
Cloruro de sodio	Fischer	L-11621	40,5 g
Agua desoinizada	N/A	N/A	Llevar a 5 L
moduladores
Bafilomycin A1	Sigma-Aldrich	B-1793
5-(N-etil-N-isopropil)amilorida (EIPA)	Sigma-Aldrich	A3085
Cloruro de amonio	Fischer	A649-500

de pH