Perfiles de Células Madre Embrionarias Humanas individual por RT-PCR cuantitativa

Resumen

Se necesita ensayo de expresión de un solo gen celular para comprender las heterogeneidades de células madre.

Resumen

La heterogeneidad de la población de células madre dificulta la comprensión detallada de la biología de células madre, tales como su propensión hacia la diferenciación de diferentes linajes. Un único ensayo transcriptoma de células puede ser un nuevo enfoque para la disección de la variación individual. Hemos desarrollado el método de QRT-PCR de una sola célula, y confirmado que este método funciona bien en varios perfiles de expresión génica. En el nivel de una sola célula, cada célula madre embrionarias humanas, ordenados por OCT4 :: células positivas EGFP, tiene una alta expresión en OCT4, pero un nivel diferente de expresión NANOG. Nuestro ensayo de expresión solo gen celular debe ser útil para interrogar a las heterogeneidades de la población.

Introducción

Poblaciones eucariotas más altas son heterogéneos por lo tanto con el análisis de la población total combinada, a menudo es difícil de interpretar sus características celulares. Las células individuales dentro de una población pueden ser sutilmente diferente, y estas diferencias pueden tener consecuencias importantes para la propiedad y el funcionamiento de toda la población ^{de 1, 2.} Especialmente, las células madre embrionarias humanas (hESCs) son conocidos por ser heterogéneo, lo que provoca diferentes niveles de pluripotencia y diversas posibilidades para la especificación de linaje en delicadamente formas distintivas ^{3, 4.} Por ejemplo, diferentes antígenos de superficie celular se pueden utilizar para clasificar las células madre pluripotentes no diferenciadas, ⁵ y el grupo de Austin Smith propuesto diferentes niveles de la pluripotencia en células madre embrionarias de ratón, sobre la base de su morfología, la propensión diferenciación y la dependencia de la vía de señalización ^6. Este fenómeno se planteó la hipótesis de embrión humanolas células madre de la NIC ^7. Mientras que los estudios se realizaron en general entre las diferentes líneas de células madre, las células madre no solo individuo, que podría ser muy interesante para analizar los diferentes niveles de la pluripotencia en el nivel de células individuales, lo que potencialmente afecta a su capacidad de diferenciación hacia todos los linajes de células somáticas.

Heterogeneidad celular y molecular podría ser dictada por la transcripción de perfiles, que se llama la 'transcriptoma de células individuales "y hace hincapié en nuevos enfoques para cuantificar los niveles de expresión de genes ^8-10. Para el análisis de los niveles de expresión de genes en células individuales, hemos desarrollado un protocolo sencillo, pero robusto de una sola célula RT-PCR cuantitativa. Se confirmó la eficacia y la viabilidad de nuestro protocolo mediante la comparación de cada mitad de lisados ​​de células individuales, así como diluidos en serie RNAs totales de hESCs, dando como resultado variaciones técnicas mínimas y las diferencias. Además, se utilizó una línea reportero genética para aislar p homogéneaoblación de hESCs utilizando sistema de selección de genes. El vector donante para la orientación locus Oct4 (Oct4-2A-EGFP-PGK-Puro construir) y un par de plásmidos TALEN se utilizaron ^11. El vector de donantes y un par de plásmidos Talen se introdujeron en hESCs (H9, WA09) utilizando nuestra nucleofection y protocolo de selección clonal y el mantenimiento de hESCs se realizó sobre la base de nuestro protocolo de rutina ^12. Se confirmó esta línea genética reportero expresar EGFP para la expresión OCT4 en OCT4 :: EGFP hESCs.

Nuestro resultado demuestra que hESCs individuales (ordenados por OCT4 :: células fuertemente positivas EGFP) mantienen altos niveles de expresión OCT4, pero diferentes niveles de expresión de NANOG. Así, nuestro ensayo de expresión solo gen celular debe ser útil para estudiar las heterogeneidades de la población de células madre pluripotentes.

Protocolo

1. Preparación de una placa de 96 pocillos

1. Mezclar 1 l de Single Cell Dnase1 a 9 l Single Cell Lysis Solution.
2. Ponga la 10 l solución mixta en cada pocillo de placas de 96 pocillos PCR.

2. Extracción hESCs para FACS Purificación

1. Separar Oct4 :: línea celular EGFP ES desde el plato de 60 mm con 1 ml de Accutase durante 20 min, a 37 ° C, la cual se neutralizó con los medios de comunicación ES humana.
2. Preparar población de células en 1 ml de tampón FACS y ajustar la celda a 1 x 10 ⁶ células / ml.
3. Pasar la muestra de células a través de un tubo con tapa de filtro de células de 35 micras.
4. Guarde el tubo en hielo antes de la clasificación de células.

3. Lisis de purificado FACS celda única en cada pocillo de la placa de 96 pocillos

1. Ordene la muestra para células positivas EGFP en un clasificador de células con un operador entrenado. Ponga la única célula en una solución Lysis/DNase1 Single Cell en placas de 96 pocillos PCR. Si es necesario, el 9Placa de 6 pocillos con muestra puede ser almacenada en un -80 ° C congelador menos de un mes.
2. Incubar las muestras 5 min a TA durante la lisis celular.
3. Añadir 1 l de solución de parada para detener la reacción de lisis.
4. Incubar 2 min a TA.

4. Transcripción inversa

1. Añadir en cada una alícuota de 0,5 l de 20 mM SMA-T15, SMA-A.
2. Añadir 4 l de tampón 5X, 2 l de DTT, 1 l de la transcriptasa inversa, y 1 l de dNTP a cada pocillo.
3. Realizar la transcripción inversa en un termociclador.
   1. Establecer el programa térmica a 42 ° C × 90 min e inactivar la transcriptasa inversa a 85 ° C × 5 min.

5. Amplificación

1. Añadir 4 l de reactivo ExoSAP-IT a cada muestra invertir transcritas.
   1. Incubar las muestras a 37 ° C durante 15 min y 80 ° C durante 15 minutos para inactivar el reactivo ExoSAP-IT.
2. Prepare la mezcla de reacción de PCR wITH SMA-P2 (2 nM)
3. Añadir 10 l de mezcla de reacción de PCR para cada muestra transcripción inversa.
4. Realizar la amplificación, que consta de 20 ciclos de desnaturalización (94 ° C durante 30 segundos), recocido (57 ° C durante 30 seg), y extensión (68 ° C durante 10 min).

6. Rendimiento QRT-PCR

1. Añadir 10 l de 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 l de ADNc amplificado, 2 nM primers, y 7 l de agua a cada pocillo.
   1. Establecer el programa seguido de 95 ° C durante 3 segundos, 60 ° C durante 30 seg x 40 ciclos.
2. Lleve a cabo por duplicado de los errores técnicos.

Resultados

Amplificación de ARN de una sola célula eficiente y robusto

Para reducir al mínimo la variación transcripcional entre hESCs, utilizamos OCT4 :: EGFP células madre clon para la purificación FACS. Después de la clasificación Oct4 :: células EGFP positivas en una placa de 96 pocillos, cada célula se lisaron en tampón de lisis y se convierte poli (A) + ARN a ADNc de longitud completa usando SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) y cebador de anclaje con SM...

Discusión

Solo gen celular de perfiles podría ser una herramienta importante para predecir la funcionalidad de una sola célula o una población entera. Debido a limitaciones técnicas, todo el análisis de perfiles de genes se ha restringido a los promedios de la población. Se han propuesto variaciones en los patrones y niveles entre las células individuales y las subpoblaciones de expresión de genes para causar una interpretación errónea. Estos aspectos celulares diversos se pueden encontrar en hESCs y su heterogeneidad hace que su...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de PCR de 96 pocillos	USA scientific	1402-8900
Kit de lisis celular Ambion	Technologies	4458235
SMARTScribe transcriptasa inversa	Clonetech	639536
ExoSAP-IT	USB	78200
Platinum Taq DNA polymerasa	Invitrogen	11304
10 mM dNTP Mix, PCR Grade	Invitrogen	18427
SYBR Universal 2X Master Mix	Kapa biosystem	KR0389
Accutase	Innovative Cell Tech	S-1100-1
FACS tampón			45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μ l DNasa, filtro esterilizado 35
μ m tubos de tapón de filtro de células BD	Biosciences	352235