Proteómica cuantitativos utilizando reductiva dimethylation de isótopos estables de etiquetado

Resumen

Etiquetado de isótopos estables de péptidos por dimethylation reductora (etiquetado REDI) es una estrategia rápida, de bajo costo para la proteómica precisas de masa basados ​​en espectrometría cuantitativos. Aquí se demuestra un método robusto para la preparación y el análisis de mezclas de proteínas utilizando el enfoque Redi que se puede aplicar a casi cualquier tipo de muestra.

Resumen

Etiquetado de isótopos estables de péptidos por dimethylation reductora (etiquetado REDI) es un método para cuantificar con precisión las diferencias de expresión de proteínas entre muestras mediante espectrometría de masas. Etiquetado REDI se lleva a cabo utilizando formas regulares deuterados (pesados) de formaldehído y cianoborohidruro de sodio (luz) o para agregar dos grupos metilo a cada amina libre. Aquí se demuestra un protocolo robusto para el etiquetado Redi y la comparación cuantitativa de mezclas complejas de proteínas. Proteína muestras para la comparación se digieren en péptidos, etiquetados para llevar la luz o las etiquetas de metilo pesados, mezclados, y co-analizados por LC-MS/MS. Abundancias de proteínas relativas se cuantificaron mediante la comparación de las áreas de los picos del cromatograma de iones de versiones pesadas y ligeras marcados de la péptido constituyente extraído de la plena espectros de MS. El método descrito aquí incluye preparación de la muestra por extracción en fase sólida de fase inversa, etiquetado Redi en columna de péptidos, péptido fraccionamiento por rev de pH básicofase ersed (BPRP) cromatografía y purificación de péptidos StageTip. Se discuten las ventajas y limitaciones de etiquetado Redi con respecto a otros métodos para la incorporación de isótopos estables. Destacamos las nuevas aplicaciones utilizando el etiquetado Redi como un método rápido, económico y preciso para comparar la abundancia de proteínas en casi cualquier tipo de muestra.

Introducción

Medición de diferencias de concentración de muchas proteínas entre muestras complejas es un reto central en la proteómica. Cada vez más, esto se hace mediante el etiquetado de proteínas en cada muestra con diferentes etiquetas isotópicas, la combinación de las muestras, y el uso de la espectrometría de masas para cuantificar las diferencias de concentración. Existen varios métodos para el marcaje isotópico estable de proteínas y péptidos. ¹⁵ N etiquetado ¹ y ² SILAC introducen marcadores isotópicos metabólicamente in vivo, mientras que iCAT ^3, iTRAQ ^4, y la reducción de dimethylation ⁵ agregan....

Protocolo

NOTA: Este método fue descrito previamente ^12.

1. De aislamiento de proteínas

Prepare 1 mg de proteína celular por las células de lisis, preferiblemente por métodos físicos como la prensa francesa, golpes de talón, o ultrasonidos. Evitar la lisozima lisis celular mediada porque la enzima confundirá mediciones de espectrometría de masas.

2. Precipitación con TCA de las proteínas

Añadir ácido tricloroacético 1 volumen (TCA) a 4 volúmenes de proteínas y se enfría en hielo durante 10 minutos para precipitar las proteínas. Centrifugar a 12.000 xg dura....

Resultados

Se evaluó la exactitud, precisión y reproducibilidad de etiquetado Redi utilizando Saccharomyces cerevisiae y Clostridium phytofermentans lisados ​​de células enteras. Primero cuantificamos el etiquetado de eficiencia Redi de una mezcla de C. phytofermentans lisados ​​de proteínas a partir de celulosa culturas (pesada etiqueta, H) y glucosa (etiqueta de la luz, L). Cuando se filtra a un péptido falso descubrimiento tasa del 1%, la muestra contenía 11.194 secuencias de péptidos únicos con un et.......

Discusión

Varios puntos hacen que el etiquetado de isótopos estables de péptidos utilizando un método atractivo para proteómica cuantitativa dimethylation reductora (etiquetado REDI): reactivos baratos etiquetado (reactivos cuestan menos de $ 1 por muestra), la velocidad de reacción rápida (~ 10 min), ausencia de productos secundarios, altas reproducibilidad (Figuras 3, 4), productos de reacción estable, capacidad de utilizar cualquier proteasa y de alta eficiencia de ionización de péptidos marcados. Etiquetado q.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido tricloroacético	Sigma-Aldrich	T9159	precipitación de proteínas
Acetona	Sigma-Aldrich	650501	precipitación de proteínas
Dodecil sulfato de sodio	Sigma-Aldrich	71736	desnaturalizar, reducir proteínas
Hidróxido de sodio	Sigma-Aldrich	S8045	desnaturalizar, reducir proteína
DL-Ditiothreitol	Sigma-Aldrich	43816	desnaturalizar, reducir, alquilato de proteína
Inhibidor de la proteasa Complete Mini Cocktail	Roche	4693124001	desnaturalizar, reducir proteína
Yodoacetamida	Sigma-Aldrich	I6125	proteína alquilato
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523	resuspender, extraer, etiquetar proteína
Cloruro de calcio	Sigma-Aldrich	C5670	Resuspender proteína
Lysyl Endoproteasa	Wako Chemicals	129-02541	digestión de proteínas
Tripsina de grado secuencial	Digestión de proteínas	Promega	V5111
Ácido acético	Sigma-Aldrich	320099	digestión de proteínas
Ácido trifluoroacético	Sigma-Aldrich	299537	Extracción de péptidos en fase reversa
Cartuchos tC18 Sep-Pak C18	Aguas	WAT054960	Extracción de péptidos en fase reversa
Colector de extracción	Aguas	WAT200609	Extracción de péptidos en fase reversa
Acetonitrilo	Sigma-Aldrich	14261	varios
Formaldehído	Sigma-Aldrich	252549	" luz" marcaje de péptidos
Cianoborohidruro	Sigma-Aldrich	71435	" luz" marcaje de péptidos
Formaldehído deuterado	Sigma-Aldrich	492620	" pesado" marcaje de péptidos
Cianoborodeuteruro de sodio	Isótopos CDN	D-1797	" pesado" marcaje de péptidos
MES	Sigma-Aldrich	M3671	marcaje de péptidos
C18-HPLC columna (4,6 x 250 mm, 5 y micro; m tamaño de partícula)	Agilent	770450-902	cromatografía básica de fase reversa
de pH ácido fórmico	Sigma-Aldrich	399388	varios
discos C18 Empore 3M		14-386-3	Consejos para la etapa
Consejos de metanol	Sigma-Aldrich	494437	STAGE