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Artículo de método

Imaging MALDI espectrometría de masas para la Investigación de metabolitos en

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⸱

DOI:

10.3791/51434

⸱

5 de marzo de 2014

 , 
1Department of Chemistry, University of Wisconsin- Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin- Madison

En este artículo

Resumen

De formación de imágenes de espectrometría de masas (MSI) es una herramienta poderosa que se puede utilizar para descubrir e identificar varias especies químicas en los tejidos intactos, la preservación de los compuestos en sus ambientes nativos, que puede proporcionar nuevos conocimientos sobre los procesos biológicos. En la presente memoria un método de MSI desarrollado para el análisis de moléculas pequeñas se describe.

Resumen

La mayoría de las técnicas que se utilizan para estudiar las moléculas pequeñas, tales como fármacos o metabolitos endógenos, emplean extractos de tejidos que requieren la homogeneización del tejido de interés que podrían causar cambios en las rutas metabólicas en estudio 1. De formación de imágenes de espectrometría de masas (MSI) es una poderosa herramienta analítica que puede proporcionar información espacial de analitos dentro de rebanadas intactas de muestras de tejidos biológicos 1-5. Esta técnica se ha utilizado ampliamente para estudiar diferentes tipos de compuestos, incluyendo proteínas, péptidos, lípidos, y moléculas pequeñas tales como metabolitos endógenos. Con láser asistida por matriz de desorción / ionización (MALDI)-MSI, distribuciones espaciales de múltiples metabolitos pueden ser detectados simultáneamente. En esto, un método desarrollado específicamente para la realización de experimentos no orientados metabolómica MSI en las raíces de leguminosas y nódulos de las raíces se presenta lo que podría revelar una visión de los procesos biológicos que tienen lugar. Lamétodo presentado aquí muestra un típico flujo de trabajo de MSI, de preparación de la muestra para la adquisición de imágenes, y se centra en la etapa de aplicación de la matriz, lo que demuestra diversas técnicas de aplicación de la matriz que son útiles para la detección de moléculas pequeñas. Una vez que las imágenes son generadas con EM, se discutieron y demostraron el análisis y la identificación de los metabolitos de interés. El flujo de trabajo estándar que aquí se presenta se puede modificar fácilmente para diferentes tipos de tejidos, especies moleculares, y la instrumentación.

Introducción

El creciente campo de la metabolómica tiene muchas aplicaciones biológicas importantes, incluyendo el descubrimiento de biomarcadores, descifrando las vías metabólicas en plantas y otros sistemas biológicos, y la toxicología de perfiles 4,6-10. Un reto técnico importante en el estudio de los sistemas biológicos es el estudio de las vías de metabolómica sin interrumpir los 11. MALDI-MSI permite el análisis directo de los tejidos intactos que permite la detección sensible de analitos en órganos individuales 12,13 e incluso células individuales 14,15.

Preparación de la muestra es un paso crucial en la producción de imágenes espectrales de masa reproducibles y fiables. La calidad de las imágenes depende en gran medida de factores tales como el tejido medio de incrustación, grosor de corte, matriz de MALDI, y la técnica de aplicación de la matriz. Para aplicaciones de formación de imágenes, espesor de corte ideal es la anchura de una celda (8-20 micras dependiendo del tipo de muestra). MALDI requiere el depósito de una orgánica, cristalinacompuesto matriz E, típicamente un ácido débil, en la muestra para ayudar a la ablación analito y la ionización. 16 Diferentes matrices de proporcionar diferentes intensidades de señal, iones interferentes, y la eficiencia de ionización de diferentes clases de compuestos.

La técnica de aplicación de la matriz también juega un papel en la calidad de las imágenes espectrales de masa y diferentes técnicas son apropiadas para diferentes clases de analitos. Tres métodos de aplicación de la matriz se presentan en este protocolo: aerógrafo, rociador automático, y la sublimación. Aplicación de la matriz del aerógrafo ha sido ampliamente utilizado en la formación de imágenes de MALDI. La ventaja de la aplicación de la matriz del aerógrafo es que es relativamente rápido y fácil. Sin embargo, la calidad de la aplicación de la matriz aerógrafo depende en gran medida de la habilidad del usuario y tiende a ser menos reproducible y causar la difusión de analitos, especialmente moléculas pequeñas 17. Los sistemas automáticos de rociadores tienen los mecánicos similares a aerógrafo aplicación de la matriz, pero have sido desarrollado para eliminar la variabilidad observada con la aplicación manual de aerógrafo, haciendo que la pulverización más reproducible. Este método puede ser a veces más tiempo que la aplicación de la matriz aerógrafo tradicional. Tanto los sistemas de rociadores automáticos aerógrafo manual y son los métodos de aplicación de la matriz a base de solventes. La sublimación es una técnica de aplicación matriz seca que se está volviendo más y más popular para la formación de imágenes de espectro de masas de los metabolitos y moléculas pequeñas, ya que reduce la difusión del analito, sin embargo, carece de la necesaria disolvente para extraer y observar compuestos de masas superiores 18.

Identificación Confiado de metabolitos normalmente requiere mediciones precisas de masa para obtener identificaciones putativos seguido de masas en tándem (MS / MS) experimentos de validación, con MS / MS espectros que se comparan con los estándares, la literatura, o espectros teóricos. En este protocolo de alta resolución (masa poder de resolución de 60.000 a m ​​/ z 400), cromatografía líquida (LC)-MS está acoplado a MALDI-MSI para obtener tanto la información espacial y las identificaciones seguras de metabolitos endógenos, utilizando Medicago truncatula raíces y nódulos de las raíces como el sistema biológico. Experimentos MS / MS se pueden realizar directamente en el tejido con MALDI-MSI o en extractos de tejidos con LC-MS y utilizados para la validación de la identificación de metabolitos.

Este protocolo proporciona un método simple para mapear metabolitos endógenos en M. truncatula, que puede ser adaptada y aplicada a MSI de pequeñas moléculas en diversos tipos de tejidos y los sistemas biológicos.

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Protocolo

1. Instrumentación

  1. MALDI-TOF/TOF MSI. Utilice un espectrómetro de masas equipados con una fuente MALDI para el análisis de pequeñas moléculas (véase la Tabla de Materiales / Equipos). Lleve a cabo adquisiciones en modo de iones positivos o negativos en función de los analitos de interés. Especificar un intervalo de masa de interés y recoger 500 disparos de láser / lugar en intervalos de 50 micras, tanto en la dimensiones X e Y a través de la superficie de la muestra para generar imágenes de iones. La anchura de trama y el número de disparos de láser se pueden ajustar para obtener una mayor resolución espacial y la intensidad máxima de la señal, respectivamente. Utilice picos de matriz de DHB o normas internas aplicadas a la diapositiva o directamente al tejido para calibrar los espectros de masas.
  2. Alta Resolución LC-MS. (Véase la Tabla de Materiales / Equipos) extractos de muestras correr con LC-MS usando ya sea en fase inversa (RP) LC con una columna C-18, o fase normal (NP) con una columna HILIC dependiendo de los analitos de interés. Utilice fases móviles ygradientes como apropiadas para el tipo de muestra específica. Realizar adquisiciones en modo de iones positivos o negativos dependiendo del tipo de muestra.

2. Preparación de Tejido

  1. Recorte el nódulo de la raíz de la planta, dejando 3-4 mm de raíz unidos al nódulo.
  2. Inmediatamente después de la disección, el uso de fórceps para colocar el tejido en una taza criostato y cubrir con gelatina (100 mg / ml en agua desionizada). Es esencial para el tejido que se va pegado a la parte inferior de la copa sin burbujas de aire.
  3. Flash congelar el tejido mediante la colocación de la copa en un baño de hielo seco / etanol hasta que la gelatina se endurece y se vuelve opaca. Almacene las muestras a -80 ° C hasta su uso.
  4. Retire muestras del -80 ° C congelador, cortar la copa criostato de plástico y retirar el exceso de gelatina. Monte el tejido embebido al mandril criostato con una cantidad tamaño de una moneda de la temperatura óptima de corte (OCT) medios, aunque no soltar el octubre tocar el tejido. Colocar en criostatoboxear hasta que solidifica octubre.
  5. Permita que el mandril y la gelatina se equilibren en el cuadro de criostato (ajustado a -20 o -25 ° C) durante aproximadamente 15 min.
  6. Utilice el criostato (véase la Tabla de Materiales / Equipos) a la sección de tejido de aproximadamente el grosor de una celda (8-20 micras dependiendo del tipo de tejido) y descongelación montar cada rebanada sobre el vidrio revestido con ITO por el calentamiento de la parte posterior (no ITO lado) de un portaobjetos de vidrio recubierto de ITO en la parte posterior de su mano-revestido. Coloque el lado recubierto de ITO de la diapositiva calentado cerca de la lámina de tejido congelado y permita que el segmento se pegue en la diapositiva. La colocación de las secciones juntas en la diapositiva proporcionará una mejor alineación durante el MSI.

3. Aplicación Matrix

  1. Aplicación del aerógrafo de Matrix MALDI
    1. Todos los procedimientos de aerógrafo se debe realizar en una campana de humos.
    2. Limpiar a fondo el depósito de solución aerógrafo y la boquilla (véase la Tabla de Materiales / Equipos) con metanol yllenar el envase de la solución con una solución de matriz de DHB (150 mg / ml en 50% methanol/0.1% de TFA v / v).
    3. Mantenga el aerógrafo aproximadamente 35 cm de la muestra y aplicar 10-15 capas de matriz en la superficie de la corredera con una duración de 10 segundos de pulverización y 30 seg tiempo de secado entre cada capa.
    4. Limpiar a fondo el aerógrafo de nuevo con metanol cuando haya terminado para evitar la obstrucción de la solución matriz.
  2. Automático Aplicación pulverizador de Matrix MALDI
    1. Siga las instrucciones de puesta en marcha proporcionados por los fabricantes del sistema de rociador automático.
    2. Para MSI de metabolitos en nódulos de las raíces utilizando 40 mg / ml (en el 50% methanol/0.1% TFA v / v) DHB como la matriz, ajustar la temperatura de ~ 80 ° C, la velocidad de 1250 mm / min, velocidad de flujo de 50 l / min, y el número de pasadas a 24. Para una mejor cobertura, se recomienda para rotar la boquilla de 90 ° y / o desplazamiento de la boquilla de 1,5 mm entre cada pasada. Inicie método pulverizador.
      Como una SIde nota, el sistema pulverizador particular usado aquí se calienta la boquilla para acelerar la evaporación del disolvente. Como el disolvente se evapora, la concentración de la matriz aumenta rápidamente. La matriz aplicada a la muestra con el aerógrafo y el pulverizador automático tiene concentraciones comparables.
    3. Siga las instrucciones de apagado proporcionadas por los fabricantes del sistema de rociador automático.
  3. Aplicación de la sublimación de la matriz de MALDI
    1. Pesar 300 mg de DHB en la parte inferior de la cámara de sublimación (véase la Tabla de Materiales / Equipos).
    2. Pegar el portaobjetos de vidrio para el dedo frío (parte superior de la cámara de sublimación) con las secciones de tejido hacia abajo con cinta de doble cara, conductora. Cubrir toda la parte de atrás de la corredera con la cinta de doble cara, incluso para conductividad, la producción de incluso la deposición de matriz.
    3. Fije las mitades superior e inferior de la cámara de la sublimación, junto con el C-clamp. Conecte el vacío y add hielo y agua fría al depósito superior.
    4. Coloque cámara de sublimación en una manta de calentamiento que está a temperatura ambiente.
    5. Encienda la bomba de vacío. Espere 15 minutos y encienda la manta calefactora. El manto de calentamiento debe alcanzar 120 º C en el transcurso de 10 min.
    6. Después de 10 minutos, se apaga el fuego, cierre la válvula de vacío (por lo que el interior de la cámara se mantiene al vacío) y apague la bomba de vacío.
    7. Deje que la cámara alcance la temperatura ambiente, abra la válvula de liberación de la presión de vacío y retire la muestra. El tamaño de la cámara de sublimación determinará la cantidad de matriz sublimado a la lámina de vidrio. Las cámaras de sublimación más grandes (del tamaño de un vaso de 400 ml) utilizarán aproximadamente 300 mg de DHB mientras que las cámaras más pequeñas (del tamaño de un vaso de 150 ml) utilizarán aproximadamente 100 mg de DHB y requerirán el corte de la lámina de vidrio de forma que encaja en la cámara.

4. Adquisición de imágenes

  1. Marcar un patrón + en cada esquina de la muestra con un lápiz corrector líquido WiteOut para ser utilizado como "enseñar a los puntos". Coloque la placa de vidrio en la placa de adaptador de diapositivas MALDI y tomar una imagen óptica de la muestra utilizando un escáner.
  2. Crear un archivo de adquisición de imágenes mediante el software proporcionado por el fabricante del aparato, con un tamaño de paso de trama de 50 my un diámetro de láser igual o más pequeño que el tamaño de paso de la trama. En este instrumento en particular, el ajuste mínimo láser da un diámetro de láser de ajuste de láser de aproximadamente 10 micras y pequeño tiene un diámetro de 40-50 micras.
  3. Cargar la imagen óptica en el software y alinear la placa con la imagen óptica.
  4. Calibre el instrumento antes de iniciar la adquisición utilizando iones comunes de la matriz de racimo, las normas internas, o una mezcla de calibración.
  5. Especifique las áreas de tejido para ser analizados con MSI, incluyendo un punto de la matriz pura en la diapositiva para ser utilizado como un "espacio en blanco".
  6. Comience acadquisición.

5. Generación de Imagen

  1. Abra el archivo de imágenes en el software disponible en el mercado proporcionado por el vendedor y extraer las imágenes de iones. Otro software de código abierto está disponible para el procesamiento de datos MSI 19.

6. Identificación de metabolitos

  1. Seleccionar un m / z de interés específico del espectro de masas mediante el software específico del proveedor (véase la Tabla de Materiales / Equipos). Un analito puede ser distinguido de un ión matriz cuando un pico del analito se selecciona entre el espectro de masas de iones y las imágenes se generan localiza específicamente a la sección de tejido.
  2. Generar una lista de los analitos de interés y llevar a cabo experimentos de MS / MS. Ver Tabla 1 y Tabla 2 en Resultados representante para las listas de muestra de analitos.
  3. Realizar análisis LC-MS específica en un espectrómetro de masas de alta resolución (o alta resolución MALDI-MS, si está disponible) para obtener información precisamediciones de la masa de los analitos de interés y también realizar LC-MS/MS de los analitos de interés para obtener patrones de fragmentación característicos.
  4. Realice la búsqueda de base de datos para determinar las identificaciones putativos para los analitos específicos. Ejemplos de bases de datos de metabolitos incluyen: METLIN, Propiedades físicas, PubChem, KEGG, y HMDB.
  5. Para confirmar las identificaciones putativos de búsqueda de base de datos precisa de masas, que coincida con la MS / MS de los analitos dirigidos a MS / MS espectros de las normas, la literatura, y / o software de predicción de la fragmentación.

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Resultados

Una visión general experimental de MSI se muestra en la Figura 1. Al principio del experimento, la preparación de la muestra es un paso crítico. Los nódulos se recortan de la raíz de la planta y embebidos en gelatina. El tejido debe ser presionada plana contra la copa criostato, sin burbujas, mientras se está congelado, ya que asegura una alineación más fácil y adecuada del tejido mientras se está seccionado. Cuando se está en rodajas el tejido, es importante para cortar el tejido en el espesor adecuado...

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Discusión

Como se comentó anteriormente, la preparación de la muestra es el paso más crítico en el flujo de trabajo de MSI. Incorporación de los tejidos de manera desigual hará que el corte a ser difícil o imposible en algunos casos. El tamaño de la sección y el tiempo de equilibrio adecuado son cruciales para el mantenimiento de la integridad del tejido y evitar el plegado y lágrimas. La selección de la matriz y la técnica de aplicación tendrá un papel en la determinación de los tipos de analitos que se detecten, la resolución e...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al Dr. Jean-Michel Ané en el Departamento de Agronomía de la Universidad de Wisconsin-Madison para proporcionar muestras de Medicago truncatula. Este trabajo fue apoyado en parte por fondos de la Fundación Nacional de Ciencia (NSF) de subvención CHE-0957784, de la Universidad de Wisconsin Escuela de Postgrado y la Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) y el programa Romnes Facultad de Becas de Investigación (para SD). EG reconoce un Graduate Research Fellowship NSF (DGE-1256259).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
GelatinaDifco214340calentar para disolver
Cryostat- HM 550Thermo Scientific956564A
Portaobjetos de vidrio recubiertos de óxido de indio y estaño (ITO) Delta TechnologiesCB-90IN-S10725 mm x 75 mm x 0,8 mm (ancho x largo x grosor)
matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB);ICN BiomedicalsPI90033
AerógrafoPaasche Airbrush CompanyTG-100Dacoplado con contenedor de acero de 75 ml
Sistema de pulverización de matriz automática- TM-SprayerHTX Technologies, LLCHTX. TMSP. H021-USe darán instrucciones específicas de puesta en marcha y apagado cuando se instale el instrumento
Aparato de sublimación Chemglass Life ScienceCG-3038-01
Bomba de vacío- Alcatel 2008 AIdeal Vacuum ProductsP10976Presión Máxima = 1 x 10-4 Torr
ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOFBruker Daltonics276601
Un ejemplo de "software específico para el vendedor"
MALDI LTQ OrbitrapThermo ScientificIQLAAEGAAPFADBMASZInstrumento MALDI de alta resolución para mediciones de masa precisas
Q ExactiveThermo ScientificIQLAAEGAAPFALGMAZRInstrumento LC-MS de alta resolución para mediciones de masa precisas
FlexImaging Bruker Daltonics 269841

Referencias

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