Imaging MALDI espectrometría de masas para la Investigación de metabolitos en<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; nódulos de las raíces

Resumen

De formación de imágenes de espectrometría de masas (MSI) es una herramienta poderosa que se puede utilizar para descubrir e identificar varias especies químicas en los tejidos intactos, la preservación de los compuestos en sus ambientes nativos, que puede proporcionar nuevos conocimientos sobre los procesos biológicos. En la presente memoria un método de MSI desarrollado para el análisis de moléculas pequeñas se describe.

Resumen

La mayoría de las técnicas que se utilizan para estudiar las moléculas pequeñas, tales como fármacos o metabolitos endógenos, emplean extractos de tejidos que requieren la homogeneización del tejido de interés que podrían causar cambios en las rutas metabólicas en estudio ^1. De formación de imágenes de espectrometría de masas (MSI) es una poderosa herramienta analítica que puede proporcionar información espacial de analitos dentro de rebanadas intactas de muestras de tejidos biológicos ^1-5. Esta técnica se ha utilizado ampliamente para estudiar diferentes tipos de compuestos, incluyendo proteínas, péptidos, lípidos, y moléculas pequeñas tales como metabolitos endógenos. Con láser asistida por matriz de desorción / ionización (MALDI)-MSI, distribuciones espaciales de múltiples metabolitos pueden ser detectados simultáneamente. En esto, un método desarrollado específicamente para la realización de experimentos no orientados metabolómica MSI en las raíces de leguminosas y nódulos de las raíces se presenta lo que podría revelar una visión de los procesos biológicos que tienen lugar. Lamétodo presentado aquí muestra un típico flujo de trabajo de MSI, de preparación de la muestra para la adquisición de imágenes, y se centra en la etapa de aplicación de la matriz, lo que demuestra diversas técnicas de aplicación de la matriz que son útiles para la detección de moléculas pequeñas. Una vez que las imágenes son generadas con EM, se discutieron y demostraron el análisis y la identificación de los metabolitos de interés. El flujo de trabajo estándar que aquí se presenta se puede modificar fácilmente para diferentes tipos de tejidos, especies moleculares, y la instrumentación.

Introducción

El creciente campo de la metabolómica tiene muchas aplicaciones biológicas importantes, incluyendo el descubrimiento de biomarcadores, descifrando las vías metabólicas en plantas y otros sistemas biológicos, y la toxicología de perfiles ^4,6-10. Un reto técnico importante en el estudio de los sistemas biológicos es el estudio de las vías de metabolómica sin interrumpir los ^11. MALDI-MSI permite el análisis directo de los tejidos intactos que permite la detección sensible de analitos en órganos individuales ^12,13 e incluso células individuales ^14,15.

Preparación de la muestra es un paso crucial en....

Protocolo

1. Instrumentación

1. MALDI-TOF/TOF MSI. Utilice un espectrómetro de masas equipados con una fuente MALDI para el análisis de pequeñas moléculas (véase la Tabla de Materiales / Equipos). Lleve a cabo adquisiciones en modo de iones positivos o negativos en función de los analitos de interés. Especificar un intervalo de masa de interés y recoger 500 disparos de láser / lugar en intervalos de 50 micras, tanto en la dimensiones X e Y a través de la superficie de la muestra para generar imágenes de iones. La anchura de trama y el número de disparos de láser se pueden ajustar para obtener una mayor resolución espacial y la intensidad máxima de la ....

Resultados

Una visión general experimental de MSI se muestra en la Figura 1. Al principio del experimento, la preparación de la muestra es un paso crítico. Los nódulos se recortan de la raíz de la planta y embebidos en gelatina. El tejido debe ser presionada plana contra la copa criostato, sin burbujas, mientras se está congelado, ya que asegura una alineación más fácil y adecuada del tejido mientras se está seccionado. Cuando se está en rodajas el tejido, es importante para cortar el tejido en el espesor adecuado.......

Discusión

Como se comentó anteriormente, la preparación de la muestra es el paso más crítico en el flujo de trabajo de MSI. Incorporación de los tejidos de manera desigual hará que el corte a ser difícil o imposible en algunos casos. El tamaño de la sección y el tiempo de equilibrio adecuado son cruciales para el mantenimiento de la integridad del tejido y evitar el plegado y lágrimas. La selección de la matriz y la técnica de aplicación tendrá un papel en la determinación de los tipos de analitos que se detecten, la resolución e.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Gelatina	Difco	214340	calentar para disolver
Cryostat- HM 550	Thermo Scientific	956564A
Portaobjetos de vidrio recubiertos de óxido de indio y estaño (ITO)	Delta Technologies	CB-90IN-S107	25 mm x 75 mm x 0,8 mm (ancho x largo x grosor)
matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB);	ICN Biomedicals	PI90033
Aerógrafo	Paasche Airbrush Company	TG-100D	acoplado con contenedor de acero de 75 ml
Sistema de pulverización de matriz automática- TM-Sprayer	HTX Technologies, LLC	HTX. TMSP. H021-U	Se darán instrucciones específicas de puesta en marcha y apagado cuando se instale el instrumento
Aparato de sublimación	Chemglass Life Science	CG-3038-01
Bomba de vacío- Alcatel 2008 A	Ideal Vacuum Products	P10976	Presión Máxima = 1 x 10-4 Torr
ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF	Bruker Daltonics	276601
			Un ejemplo de "software específico para el vendedor"
MALDI LTQ Orbitrap	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFADBMASZ	Instrumento MALDI de alta resolución para mediciones de masa precisas
Q Exactive	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR	Instrumento LC-MS de alta resolución para mediciones de masa precisas

FlexImaging Bruker Daltonics 269841