La investigación de las interacciones proteína-proteína en las células vivas utilizando la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia

Resumen

Las interacciones entre las proteínas son fundamentales para todos los procesos celulares. El uso de bioluminiscencia de transferencia de energía de resonancia, la interacción entre un par de proteínas se puede controlar en células vivas y en tiempo real. Además, los efectos de las mutaciones potencialmente patógenos pueden ser evaluados.

Resumen

Los ensayos basados ​​en la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) proporcionan un medio sensible y confiable para monitorear las interacciones proteína-proteína en las células vivas. BRET es la transferencia no radiativa de energía a partir de un "donante" de la enzima luciferasa a una proteína fluorescente aceptora. En la configuración más común de este ensayo, el donante es de la luciferasa de Renilla reniformis y el aceptor es proteína amarilla fluorescente (YFP). Debido a que la eficiencia de la transferencia de energía es fuertemente dependiente de la distancia, la observación del fenómeno BRET requiere que el donante y aceptor de estar en estrecha proximidad. Para la prueba de una interacción entre dos proteínas de interés en células de mamífero en cultivo, una proteína se expresa como una fusión con la luciferasa y la segunda como una fusión con YFP. Una interacción entre las dos proteínas de interés puede llevar el donador y el aceptor suficientemente cerca para que se produzca la transferencia de energía. En comparación con otras técnicas para la investigación de la proteína-proteína eninteracciones, el ensayo BRET es sensible, requiere poca práctica en el tiempo y unos reactivos, y es capaz de detectar interacciones que son débiles, transitorio o dependiente del entorno bioquímico encontrado dentro de una célula viva. Por lo tanto, es un enfoque ideal para la confirmación de las interacciones putativas sugeridas por estudios de proteómica de levadura de dos híbridos o espectrometría de masas, y además es muy adecuado para cartografiar regiones interactuar, evaluar el efecto de las modificaciones post-traduccionales en las interacciones proteína-proteína, y evaluar el impacto de las mutaciones identificadas en el ADN del paciente.

Introducción

Tanto vinculación clásica y de próxima generación análisis de secuenciación de trastornos humanos están revelando la relevancia clínica de las proteínas que participan en una variedad de procesos biológicos. A menudo es el caso que, antes de su identificación en tales estudios, ha habido poca o ninguna investigación del papel biológico de estas proteínas. Una vía fructífera para comenzar a explorar la función biológica de una proteína de interés es identificar qué otras proteínas interactúa con en su contexto fisiológico. Caracterización de las redes moleculares de esta manera proporciona información detallada sobre los procesos biológicos que subyacen al fenotipo hu....

Protocolo

1. Creación de plásmidos

1. Subclonar el ADNc para cada proteína de interés en ambos los vectores pluc y pYFP, ​​utilizando técnicas estándar de biología molecular (Figura 1). Para ver protocolos detallados Green et al ^13.
2. Secuencia de todos los constructos para verificar que las proteínas de interés están en marco con la secuencia de Luc / YFP sin codones de parada intermedios.
3. Realizar ensayos funcionales como se desee para confirmar que las proteínas de fusión conservan su actividad biológica. En el caso que aquí se presenta la localización subcelular de las proteínas de fusión YFP se determinó por m....

Resultados

El principio del ensayo BRET se ilustra en la Figura 2. La configuración de ensayo utilizado a través de los experimentos presentados aquí se representa en la figura 3. La detección de una señal BRET fuerte a partir de células transfectadas con una proteína de fusión luciferasa-YFP confirmó que la transferencia de energía era observable en este montaje experimental (Figura 4).

Nuestra investigación se centra en el papel de la familia FOXP de.......

Discusión

El diseño de las construcciones de expresión de la proteína de fusión es un paso fundamental en la creación del ensayo BRET. En los experimentos presentados aquí, las proteínas de interés se fusionan con el extremo C-terminal de la luciferasa o YFP. También es posible, y puede ser necesario, para fusionar proteínas a la N-terminal de luciferasa / YFP. Para algunas proteínas, las fusiones sólo podrán aceptarse en el extremo N-o C-terminal con el fin de evitar la interrupción de la estructura y función de proteínas. Ademá.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nanodrop 8000	Nanodrop		Cualquier espectrofotómetro capaz de leer absorbancias a 260 nm será adecuado. La determinación de la masa molecular del plásmido es crucial para calcular las cantidades de ADN que se utilizarán en las mezclas de transfección.
Placas de 96 micropocillos, fondo plano, blanco	Las placas Greiner Bio One	655098	White reducen la diafonía entre pocillos y maximizan la sensibilidad de la detección de luminiscencia. Los pozos de fondo claro permiten el monitoreo de la densidad de celdas. Las placas deben ser aptas para el cultivo celular. Si se utiliza un luminómetro de lectura superior, se debe quitar la tapa de la placa.
Lector de placas Infinite F200Pro con software de control	TECAN		Utilice los filtros 'Blue 1' y 'Green 1' para la medición de luminiscencia y los conjuntos de filtros y el espejo dicoico para GFP para la medición de fluorescencia. Cualquier lector de placas de lectura superior con capacidad para medir luminiscencia y fluorescencia de doble color es adecuado.
pLuc, pYFP, plásmido de control positivo	N/A	N/A	Plásmidos disponibles de los autores previa solicitud.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Plásmido de relleno para la equilización de masa de ADN en mezclas de transfección. Cualquier plásmido que carezca de un promotor eucariota sería adecuado.
Células HEK293	ECACC	85120602	Otras líneas celulares que transfectan con una eficiencia razonable pueden ser adecuadas.
DMEM, alto contenido de glucosa, con rojo fenol	Gibco	41966	Este es el medio utilizado para cultivar células HEK293. Cálido en 37 ° C Baño de agua antes de usar. Si utiliza una línea celular diferente, reemplace el medio de crecimiento descrito aquí con un medio específico de la línea celular.
DMEM, alto contenido de glucosa, sin rojo de fenol (medio de dilución de sustrato)	Gibco	21063	Este es el medio de dilución de sustrato utilizado para la dilución del sustrato de luciferasa (EnduRen) ya que no contiene rojo de fenol, lo que reduce la sensibilidad del ensayo. Contiene HEPES para mantener el pH correcto durante las mediciones de luminiscencia mientras las células están fuera de la incubadora de CO2. Cálido en 37 ° C Baño de agua antes de usar.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM se utiliza para la dilución del reactivo de transfección GeneJuice. Otros medios sin suero también serían adecuados. Calentar a temperatura ambiente antes de usar.
Suero fetal bovino	Gibco	10270	Para la suplementación de medios de cultivo celular a una concentración del 10% v/v.
Reactivo de transfección	GeneJuice Novagen	70967	Si se utiliza una línea celular distinta de HEK293, puede ser necesario ajustar la proporción de reactivo de transfección Genejuice en relación con el ADN en las mezclas de transfección. Se pueden utilizar otros reactivos de transfección. Si se utiliza un reactivo de transfección alternativo, puede ser necesario optimizar la cantidad de ADN utilizada en las mezclas de transfección según las instrucciones del fabricante.
DMSO	Sigma	D2650	Utilice DMSO estéril que sea adecuado para el cultivo de tejidos.
Sustrato de células vivas EnduRen	Promega	E6481	Reconstituir EnduRen a 34 mg/ml en DMSO. Tras la dilución de EnduRen en el medio de cultivo, puede formarse un precipitado. Esto no interferirá con el ensayo. Almacene EnduRen reconstituido a -20 ° C, y evite múltiples ciclos de congelación y descongelación. Asegúrese de que EnduRen reconstituido esté completamente descongelado antes de diluirlo en un medio de cultivo.