El aislamiento de los pequeños RNAs no codificantes de suero humano

Resumen

Este protocolo describe un método para la extracción de ARN pequeños a partir de suero humano. Hemos utilizado este método para aislar los microARNs de suero de cáncer para su uso en arrays de ADN y PCR cuantitativa singleplex. El protocolo utiliza fenol y tiocianato de guanidina reactivos con modificaciones para producir ARN de alta calidad.

Resumen

El análisis de ARN y su expresión es una característica común en muchos laboratorios. De importancia es la aparición de pequeños RNAs como microARN, que se encuentran en células de mamífero. Estos pequeños RNAs son potentes reguladores de genes que controlan las vías vitales como el crecimiento, el desarrollo y la muerte y un gran interés se ha dirigido a su expresión en los fluidos corporales. Esto es debido a su desregulación en enfermedades humanas tales como el cáncer y su aplicación potencial como biomarcadores séricos. Sin embargo, el análisis de la expresión de los genes miARN en el suero puede ser problemático. En la mayoría de los casos, la cantidad de suero es limitante y el suero contiene bajas cantidades de ARN total, de los cuales los pequeños RNAs sólo constituyen 0,4-0,5% ^1. Así, el aislamiento de cantidades suficientes de ARN de calidad a partir de suero es un gran desafío para los investigadores en la actualidad. En este documento técnico, se demuestra un método que utiliza solamente 400 l de suero humano para obtener suficiente ARN, ya sea para los arrays de ADN o análisis qPCR. El unV entajas de este método son su simplicidad y la capacidad para producir ARN de alta calidad. No requiere de columnas especializadas para la purificación de ARN pequeños y utiliza reactivos generales y hardware que se encuentran en los laboratorios comunes. Nuestro método utiliza un gel de bloqueo de fase para eliminar la contaminación de fenol mientras que al mismo tiempo produciendo ARN de alta calidad. También introducimos un paso adicional para quitar aún más todos los contaminantes durante la etapa de aislamiento. Este protocolo es muy eficaz en el aislamiento de los rendimientos de ARN total de hasta 100 ng / l de suero, pero también se puede adaptar para otros tejidos biológicos.

Introducción

En los últimos años, ha habido un creciente impulso para descubrir nuevos biomarcadores para la detección precoz de enfermedades humanas. Mucha atención se ha centrado en el uso de pequeños RNAs como microRNAs ² (miRNAs o MIR) como marcadores potenciales. Estos pequeños RNAs se encuentran en los fluidos corporales tales como suero y los estudios han mostrado que son resistentes a la degradación y son estables en un intervalo de diferentes condiciones ambientales ^3. Teniendo en cuenta estas características, suero o circulan miRNAs son el marcador ideal ^{4, 5.} Actualmente hay dos enfoques principales para el aislamiento de ARN pequeño de los fluidos biológicos. El primer enfoque utiliza tecnología basada en columnas para atar y eluir los pequeños RNAs ^6, mientras que el segundo enfoque utiliza el protocolo de larga data con fenol y tiocianato de guanidina reactivos ^7. Hemos desarrollado un protocolo simple, eficaz, libre de columnas para aislar ARN pequeños a partir de suero humano. El ARN aislado es inmediatamentetamente utilizable en aplicaciones posteriores, incluyendo arrays de oligonucleótidos de ADN y la secuencia de ARN.

Este protocolo fue desarrollado porque nos enfrentamos a varios problemas cuando se utilizan métodos basados ​​en fenol para aislar el ARN de suero. El enfoque tradicional Chomczynski se utiliza con frecuencia en la mayoría de laboratorios con una gama de reactivos disponibles de la mayoría de los proveedores comerciales. Sin embargo teniendo en cuenta su uso generalizado, las estrictas directrices no se han desarrollado para producir consistentemente ARN de alta calidad a partir de fluidos corporales, en sangre o suero particular.

Los problemas comunes asociados con el aislamiento de ARN a partir de suero incluyen los rendimientos de ARN bajos y la contaminación con los reactivos utilizados durante el aislamiento, en particular fenol. Nuestro enfoque elimina estos contaminantes fenol para proporcionar ARN de alta calidad para el análisis de aguas abajo tal como la PCR cuantitativa (qPCR) y la secuenciación de ARN. Hemos probado más este ARN en arrays miARN.

Protocolo

Nota: Las muestras de suero humano de pacientes sanos o pacientes con cáncer se obtuvieron con el consentimiento informado bajo protocolos éticos humanos aprobados desde el Royal Prince Alfred Hospital de Sydney (Número de protocolo X10-0016 y HREC/10/RPAH/24) y la Universidad de Tecnología, Sydney. Las muestras de suero se obtuvieron de los pacientes antes de la cirugía de diversos hospitales de Sydney y se colocan en almacenamiento a -80 ° C.

1. Pequeño aislamiento de ARN a partir de suero

El ARN total se preparó a partir de suero humano usando una versión modificada del protocolo de LS Tri-Reactivo RT.

1. Descongelar la muestra de suero congelado en hielo y luego transferir 400 l de suero recién descongelado en un tubo de microcentrífuga etiquetado.
2. Diluir el suero con 100 l de RNasa H ₂ O y libre de agregar proteinasa K a una concentración de 1 mg / ml.
3. Incubar a 37 ° C durante 20 minutos para permitir la digestión de la proteína por la proteinasa K.
4. To asegurar la completa solubilización, añadir 1,5 veces su volumen de Tri-Reactivo RT LS y 100 l de 4-bromoanisol.
5. Brevemente invertir el homogeneizado, realice pipeteo repetitivo durante 5 segundos y transferir a un tubo de 2 ml pesada cerradura de la fase etiquetada.
6. Haga girar el homogeneizado a 12.000 × g durante 20 min a 4 ° C.
7. Decantar cuidadosamente al menos 1 ml de la solución acuosa resultante en un tubo de ADN LoBind fresco. La interfase orgánica y debe ser atrapado debajo el gel blanco del tubo de cerradura de la fase.
8. Añadir 5,0 l de glucógeno (5 mg / ml) y 500 l de isopropanol al 100% a la solución acuosa, mezclar por inversión e incubar O / N a -20 ° C.
9. Después de O / N de incubación, centrífuga la muestra durante 20 min a 12.000 x g en una centrífuga de 4 ° C.
10. Descartar el sobrenadante claro y efectuar un lanzamiento "flash" durante 2 minutos a 16.000 xg en un 4 ° C centrífuga.
11. Retire con cuidado el sol clarolución que rodea el sedimento usando una pipeta.
12. Lavar el pellet con 1 ml de etanol al 70% y se centrifuga a 10.000 × g durante 10 min. Decantar la solución de lavado y repetir el paso de lavado.

2. ARN resuspensión en solución

1. Resuspender el precipitado en 10 l de RNasa H ₂ O libre, asegurando el sedimento se disolvió completamente. Para garantizar que el ARN se solubiliza completamente la muestra se puede calentar a 55 ° C durante 5 min. Durante este tiempo, la mezcla de la muestra con pipeteo repetido. Para un mayor rendimiento total de ARN, aunar dos preparaciones de ARN de la misma paciente.
2. Cuantificar el ARN se resuspendió utilizando un espectrofotómetro UV-Vis y evaluar la calidad del ARN utilizando un 2100 Bioanalyzer. Almacenar las muestras de ARN agrupados a -80 ° C para su uso en aplicaciones posteriores.

Resultados

La figura 1 representa un típico espectro UV / Vis de ARN aislado a partir de suero. A partir de este perfil notamos la contaminación de proteínas a 280 nm con fenol y contaminantes orgánicos tanto a 270 nm y 230 nm, respectivamente. Residuo guanidinio tiocianato También se observó a 260 nm. Para reducir los contaminantes, se realizaron una serie de pasos de optimización para el procedimiento de RT-LS estándar de Tri-reactivo. Añadimos 5 mg / ml de glucógeno para aumentar tanto el rendimiento total de A...

Discusión

La población de microRNAs constituye aproximadamente el 0,4 a 0,5% del total de ARN que se encuentra en el suero. Además también hay un alto contenido de proteína que se encuentra en el suero humano. Para mejorar ARN y reducir tanto la proteína y fenol contamina hemos modificado el enfoque tradicional Chomczynski ⁹ con la adición de varios pasos.

El ARN total se aisló a partir de suero utilizando el estándar de Tri-reactivo de RT-LS (Molecular Research Centre) sin embargo cuando s...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tri-Reactivo RT LS	Centro de Investigación Molecular, EE. UU.	TR 118
Libre de ARNasa H2O	GIBCO Invitrogen	10977-023
Proteinasa K	Finnzymes, Finlandia	EO0491
Tubo de bloqueo de fase pesada	5PRIME	2302830	2 ml de capacidad
Tubo DNA Lobind	Eppendorf	0030 108.078	1,5 ml capacidad
Glucógeno	Invitrogen, EE. UU	10814-010	5 mg/ml
Isopropanol de grado ARN	Sigma Aldrich, EE. UU.	I9516	100%
Centrífuga refrigerada	John Morris
Espectrofotómetro UV-Vis	Nanodrop Thermo Fisher Scientific, EE. UU.
Etanol de grado ARN	Sigma Aldrich, EE. UU	E7023	70%
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent, EE. UU.