Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN

Carina Monico; Gionata Belcastro; Francesco Vanzi; Francesco S. Pavone; Marco Capitanio

doi:10.3791/51446

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Artículo de método

Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN

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DOI:

10.3791/51446

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27 de agosto de 2014

Carina Monico¹^,² , Gionata Belcastro¹ , Francesco Vanzi¹^,³ , Francesco S. Pavone¹^,⁴^,⁵^,⁶ , Marco Capitanio¹^,⁴

¹LENS - European Laboratory for Non-linear Spectroscopy, University of Florence, ²Chemistry Research Laboratory, University of Oxford, ³Department of Biology, University of Florence, ⁴Department of Physics and Astronomy, University of Florence, ⁵National Institute of Optics-National Research Council, Italy, ⁶International Center of Computational Neurophotonics

En este artículo

Resumen

Aquí se describe la instrumentación y métodos para la detección de moléculas de proteína única etiquetados con fluorescencia que interaccionan con una sola molécula de ADN suspendido entre dos microesferas ópticamente atrapados.

Resumen

El artículo describe la combinación de pinzas ópticas y detección de fluorescencia de una sola molécula para el estudio de la interacción proteína-ADN. El método ofrece la oportunidad de investigar las interacciones que ocurren en solución (evitando así problemas debidos a superficies cercanas como en otros métodos de una sola molécula), controlando la extensión del ADN y rastreando la dinámica de interacción en función de los parámetros mecánicos y la secuencia de ADN. Se ilustran los métodos para establecer con éxito el atrapamiento óptico y la localización nanométrica de moléculas individuales. Ilustramos las condiciones experimentales que permiten el estudio de la interacción del represor de lactosa (lacI), marcado con Atto532, con una molécula de ADN que contiene secuencias diana específicas (operadores) para la unión de LacI. El método permite la observación de interacciones específicas en los operadores, así como la difusión unidimensional de la proteína durante el proceso de búsqueda de objetivos. El método es ampliamente aplicable al estudio de las interacciones proteína-ADN, pero también a los motores moleculares, donde es deseable el control de la tensión aplicada al polímero de la pista asociada (por ejemplo, actina o microtúbulos).

Introducción

Molécula individual (SM) técnicas han evolucionado mucho en los últimos treinta años para responder a la necesidad de superar algunas de las limitaciones de las mediciones de soluciones tradicionales, a granel ^1.3. La manipulación de las moléculas biológicas individuales ha creado la oportunidad para medir las propiedades mecánicas de los biopolímeros ⁴ y controlar los parámetros mecánicos de proteína-proteína ⁵ y proteína-DNA ^6,7. Detección de fluorescencia SM, por otro lado, representa una herramienta muy versátil para el estudio de actividad de la proteína in vitro e in vivo, dando lugar a la posibilida....