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Artículo de método

Determinación de la actividad locomotora espontánea en

12.5K vistas

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DOI:

10.3791/51449

⸱

10 de abril de 2014

 ,  , 
1Genetics and Developmental Biology, School of Medicine, University of Connecticut Health Center

En este artículo

Resumen

Drosophila melanogaster, son útiles en el estudio de las manipulaciones genéticas o ambientales que afectan a comportamientos como la actividad locomotora espontánea. Aquí se describe un protocolo que utiliza monitores con rayos infrarrojos y software de análisis de datos para cuantificar la actividad locomotora espontánea.

Resumen

Drosophila melanogaster se ha utilizado como un organismo modelo excelente para estudiar manipulaciones ambientales y genéticos que afectan el comportamiento. Uno de estos es el comportamiento de la actividad locomotora espontánea. A continuación se describe el protocolo que utiliza monitores de población de Drosophila y un sistema de seguimiento que permite el monitoreo continuo de la actividad locomotora espontánea de moscas durante varios días a la vez. Este método es simple, fiable, y objetivo y se puede utilizar para examinar los efectos del envejecimiento, el sexo, cambios en el contenido calórico de los alimentos, además de los medicamentos, o las manipulaciones genéticas que imitan las enfermedades humanas.

Introducción

Moscas de la fruta, Drosophila melanogaster, se han utilizado como un organismo modelo útil para estudiar los mecanismos que subyacen a los comportamientos complejos, como el aprendizaje y la memoria, la interacción social, la agresión, el abuso de drogas, el sueño, la función sensorial, el cortejo y el apareamiento 1,2. Un comportamiento que se ha estudiado a través de múltiples protocolos es la actividad locomotora espontánea. Geotaxis negativo fue uno de los primeros métodos desarrollados para medir la actividad de Drosophila, y este protocolo consiste en medir el porcentaje de moscas que llegar a una cierta altura del vial después de moscas fueron sacudidos a la parte inferior de la 1,3 contenedor. Este método tiene ventajas de ser sencilla, de bajo costo, y ya que no requiere ningún equipo especial que se puede realizar en cualquier laboratorio. Se ha utilizado como una herramienta de selección valiosa para estudiar los efectos de diferentes manipulaciones genéticas sobre la movilidad de mosca 3. Sin embargo, es tiempo y trabajo and tiene la posibilidad de sesgo debido a la agitación variable de los viales y grabaciones humanos.

El método geotaxis negativo fue mejorado por el desarrollo del método iterativo de Rapid Negativo geotaxis (ANILLO) 4,5, que toma fotografías de los viales de la mosca después de las sacudidas de las moscas de la parte inferior. La ventaja de este protocolo es su sensibilidad y la posibilidad de probar un gran número de viales de la mosca en el mismo tiempo. Sin embargo, este protocolo aún tiene la posibilidad de error humano, y sólo mide geotaxis negativos. Otros laboratorios han utilizado la simple observación de los frascos de cultivo para determinar la actividad locomotora 6.

Recientemente se han desarrollado varios sistemas de grabación de vídeo para la medición de la actividad locomotora mosca. Un protocolo de vigilancia de vídeo ofrece tiempo para el ajuste antes de la grabación 7. El método descrito por Slawson et al. También utiliza un impulso de aire para detener el movement hasta el inicio de la grabación, que potencialmente podría ser un factor de estrés a los animales 7. Este método proporciona información sobre la velocidad media, velocidad máxima, pasar tiempo en movimiento, etc Otro sistema de seguimiento tridimensional mide la velocidad máxima de las moscas individuales durante ~ 0,2 segundos de libre despegue del vuelo 8. Un protocolo de vigilancia de vídeo en tres dimensiones utiliza moscas que expresan GFP y varias cámaras equipadas con filtros que permitan la detección de la fluorescencia para determinar la movilidad mosca 9. Moscas en este protocolo tienden a mostrar patrones de vuelo cilíndricos, que es potencialmente debido a la forma de la cultura Drosophila viales 10. Este método se mejoró mediante el uso de una cúpula que permite la medición de movimiento espontáneo de dos moscas 11. Un método de alto rendimiento que utiliza una cámara para monitorear automáticamente y cuantificar el comportamiento individual y social de Drosophila ha sido también descrito 12. Zou etal. desarrolló un sistema de monitoreo del comportamiento (BMS) que utiliza dos cámaras con ayuda de computadora para registrar el comportamiento de toda la vida y movimientos como el reposo, en movimiento, volar, comer, beber, o muerte de fruta tephritid individuo vuela 13. Varios otros sistemas de vídeo se han desarrollado para controlar la actividad de comportamiento mosca 14,15.

Aquí se describe un método para cuantificar la actividad de Drosophila que utiliza monitores de población. Estos monitores se encuentran en-y de temperatura incubadoras con control de humedad a 25 ° C en un ciclo de 12 horas de luz de día y noche. Cada monitor población tiene rayos infrarrojos colocados en anillos colocados en tres alturas diferentes. Cada vez que una mosca mueve a través de los anillos se interrumpe el haz de infrarrojos, que se registra por un microprocesador que, independientemente registros y los recuentos de la actividad de las moscas dentro del vial. Un microprocesador carga la actividad total en el vial a la computadora en InterVA definido por el usuarioLS que podría variar de 1 segundo a 60 minutos. El método descrito aquí proporciona el tiempo suficiente para que las moscas se adaptan al nuevo entorno y permite la medición simultánea de la actividad locomotora espontánea de un máximo de 120 poblaciones de moscas. Además, se describe la preparación de la comida, el mantenimiento volamos, la configuración de los monitores de la población de movilidad en incubadoras con temperatura controlada, y los factores potenciales que podrían afectar los resultados. Este método puede ser usado para estudiar cómo los diferentes modificaciones ambientales o genéticas afectan la actividad locomotora espontánea de las moscas.

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Protocolo

Nota: La cepa Canton-S es la línea de fondo de tipo salvaje estándar obtenida de la Bolsa Center Bloomington.

1. Preparación de Alimentos y Recetas para 1000 ml de Alimentos

Nota: En esta sección se describe el protocolo para la preparación de alimentos. Ollas grandes del metal se utilizan para preparar aproximadamente 18 L de alimento a la vez. El protocolo aquí descrito se redujo y utiliza 1,000 ml de H 2 O. La comida se trata en autoclave dos veces.

  1. Mezclar 113 g de sacarosa y 28 g de levadura de cerveza en 643 ml de agua. Agregar los ingredientes en un conjunto placa caliente a 25 ° C con una barra de agitación para mezclar lo largo de 15 minutos.
  2. Solución alimentos Autoclave en 20 min.
  3. Mezclar 49 g de harina de maíz y 8,1 g de agar en 268 ml de agua y añadir a la mezcla de alimentos en autoclave se describe en el paso 1.2. Mezclar bien con una cuchara grande o una batidora.
  4. Mezcla de alimentos Autoclave en otros 20 min.
  5. Coloque los alimentos en un plato y dejar enfriar con mezcla constante con una barra de agitación. Yof soluciones adicionales deben añadirse a los alimentos, como la mifepristona (RU486), mantenga la comida en un plato caliente establecido a 60 ° C y añadir una solución cuando la comida llega a la temperatura requerida.
  6. Disolver 2,4 g tegosept en 10,7 ml de EtOH al 100% y mantener en un plato frío con un agitador para disolver completamente y se mezcla durante aproximadamente 15 min.
  7. Añadir la solución tegosept a la alimentación cuando la temperatura de los alimentos es de 60 ° C y mezclar bien.
  8. Utilice una bomba o un dispensador de alimentos para verter sobre 10 ml de los alimentos en una amplia vial. Mediante el uso de un dispensador de alimentos que se puede verter alimentos simultáneamente en 100 viales de ancho, de plástico (1) de la bandeja a la vez.
  9. Cubrir los viales con Kimwipes y paño de queso y dejar los alimentos a temperatura ambiente durante 12 a 24 horas para que se enfríe. Mantenga los alimentos a 4 ° C y utilizar dentro de 3-4 semanas. Calentar los alimentos a temperatura ambiente antes de su uso para el trabajo con mosca.

2. Preparación de frascos de cristal

  1. Preparar los alimentos de acuerdo con el protocolo que aparece en el paso 1.
  2. Alícuota de 5 ml de la comida en cada uno, vial de vidrio estrecho, que es el tamaño correcto para los monitores de la población. Esta cantidad de alimentos debe ser lo suficientemente bajo como para estar por debajo del anillo más bajo del monitor población.
  3. Después de la comida se enfría a temperatura ambiente cubrir los viales con tapones de esponja y conservarse a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas. Debido a la cantidad de alimento en un vial es bastante baja, lo mejor es usar el alimento dentro de una semana o dos para evitar que se seque.
  4. Calentar los viales a temperatura ambiente antes de su uso.

3. Mantenimiento de las moscas de los padres

  1. Cultivar las moscas en frascos de plástico de ancho con comida estándar de laboratorio y mantener los viales en una cámara ambiental con control de temperatura húmeda a 25 ° C en un 12 hr luz / oscuridad ciclo. El período de luz del día comienza a las 6:00 am en este laboratorio.
  2. Por la mañana clara moscas adultas de los viales de la que se recogerán las moscas de los padres.
  3. Recoger flie recién ecloseds y separarlos por sexo en un bloc de CO 2 en un plazo de 8 horas después de la eclosión de asegurarse de que las moscas hembras son vírgenes. Las moscas comienzan a aparearse 8 horas después de la eclosión.
  4. Cuando los hombres y mujeres moscas vírgenes son entre 5 y 10 días de edad, se puso 10 machos y 10 hembras de moscas en un vial con comida estándar y algunos fragmentos de levadura activa en la parte superior.
    Nota: controlar la densidad de las larvas mediante el uso de el mismo número de moscas y mantenerlos en un vial durante dos días. La adición de levadura activa promueve la producción de huevos.
  5. Mantenga las moscas para aparearse y poner huevos en una cámara climática con temperatura controlada a 25 º C con un 12 hr luz / oscuridad ciclo durante 2 días. Configure 5-10 viales de moscas de los padres.
  6. Pase las moscas a un nuevo vial de plástico cada dos días y mantener los viales con los huevos en una incubadora a 25 ° C.

4. Colección de moscas experimentales

  1. Después de 9 días las moscas empiezan a Eclose de los viales donde el Parental moscas pusieron huevos (que se describen en el paso 3.6.). Claro y deseche las moscas que eclosed durante el primer día y devolver los viales a la incubadora. La mayoría de las moscas eclosed el día 1 son mujeres. Una población más sincronizada de moscas se Eclose el día 2.
  2. Dentro de 24 horas lugar moscas recién eclosed de CO 2 almohadillas y recoger 25 machos y 25 hembras de moscas por los viales con un pincel o una cuchara de metal. Mantenga moscas en CO 2 almohadillas por un corto período de tiempo para minimizar los efectos de CO 2. Anote el día de la eclosión en el vial. Ensamble al menos 5 viales replicadas para experimentación y para los grupos de control.
  3. Conservar los viales en cámaras ambientales de temperatura controlada a 25 º C con un 12 hr luz / oscuridad ciclo.
  4. Pase las moscas a un nuevo vial de plástico cada dos días utilizando un embudo.
  5. Edad de las moscas hasta que se alcance la edad deseada para la experimentación.

5. Configuración de los monitores de la Movilidad

  1. Coloque elpoblación supervisa en una incubadora de temperatura controlada.
  2. Conecte cada monitor mediante un cable telefónico de 4 hilos a la unidad de interfaz de la fuente de alimentación (Psiu) a través de divisores de 5 vías (multilínea), que se pueden conectar hasta 5 monitores individuales a una abertura en el Psiu. Véanse las Figuras 1A y 2B.
  3. Conecte el Psiu a una toma de alimentación de línea (100-240 V). Enchufe el conector de salida de fuente de alimentación en una de las tomas Psiu 2 de apareamiento. La luz verde adjunto se ilumina de color verde cuando está conectado correctamente.
  4. Conecte el Psiu al bus serie universal de hardware (USB). Conecte el cable USB entre el hardware USB con un Macintosh o un PC con Windows para la grabación de datos. Sería mejor tener un equipo dedicado únicamente para la recolección de datos, ya que la colección tiene una duración de día a la vez.
  5. Descargue el software USB (PSIUdrivers.zip). Software del controlador USB es utilizado por la interfaz de la fuente de alimentación y debe ser descargado sólo una vez. Se sintetiza unade enlace de datos entre el programa de la computadora y los monitores Psiu / actividad. Para un uso de la PC y un puerto COM para un Macintosh utiliza un puerto serie simple.
  6. Descargue el programa informático para Macintosh OSX (Intel) o para Windows PC programas (XP/Vista/7), siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante Notas 308.pdf.
  7. Inicie el programa de ordenador y configurar el programa haciendo clic en las Preferencias, luces o monitores. El programa se ejecutará hasta que el usuario selecciona "Salir" para detener el programa. Si el programa de ordenador o el ordenador se apaga los monitores seguirá contando interrupciones del haz, pero el recuento no se grabará hasta que se volvió a lanzar el programa. En ese caso, la primera lectura incluirá todos los cargos desde la última vez que el Psiu envía los datos a la computadora.
  8. Seleccione la ficha Preferencias y elija el puerto serie, Psiu para Macintosh y COM para el PC.
  9. Seleccione el intervalo de lectura que va desde segundos, minutos o una hora.
  10. Seleccione los monitores: Cada monitor cuenta con su número único que está dado por el fabricante. Seleccione la gama de monitores que se corresponde con los números dados a los monitores por el fabricante.
  11. El cuadro de luces: Asegúrese de que todos los monitores están conectados correctamente, que está marcado por una luz verde al lado del número de monitor en el software. Una luz roja indica que la conexión se pierde, y una caja de color negro indica que el sistema está apagado o mal configurado.

6. Configuración del Experimento

  1. Retirar los viales de vidrio que contienen los alimentos de 4 ° C y dejar que ellos se calienta a temperatura ambiente.
  2. Moscas masculinas y femeninas separadas de la misma edad en CO 2 pad. Para los estudios de envejecimiento es posible comenzar estudios de movilidad a los 3 días de edad.
  3. Poner 10 hombres o 10 mujeres moscas en cada vial de vidrio que contiene la comida. Use al menos tres viales para cada línea experimental y el control de las moscas y para cada género.
  4. Mantenga la vials de su lado hasta que las moscas se recuperan de CO 2 para asegurar que las moscas no se atascan en el alimento. Moscas separados a eso de las 8:00 de la mañana y dejarlos durante aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente para recuperarse de CO 2.
  5. Colocar los viales en el interior de los monitores de población alojadas en las incubadoras.
  6. Deseche los datos recogidos en las primeras 24 horas después de que las moscas se ponen en la incubadora para permitir a adaptarse al nuevo entorno.
  7. Pasar las moscas después de 3 o 4 días a nuevos viales para evitar la desecación de la comida. Si las moscas son propensos a la muerte o la edad son 40 días o más, pase a las moscas después de 2 días y datos de uso recogidos para el día 2. Además, utilizan más de tres viales por grupo para asegurar réplicas adecuadas. Los datos de los viales con moscas muertas deben ser respetados y no se incluyeron en el análisis.

7. Ejecución de los monitores de la actividad y el cálculo de la actividad espontánea total

  1. Seleccione las preferencias - el intervalo de recopilación de datos <.br /> Nota: El programa informático permite la recolección de los datos en intervalos de entre 1 segundo y 60 minutos. Se han encontrado 10 y 30 períodos minuciosos para proporcionar información adecuada sobre la movilidad sin tener un número abrumador de los puntos de tiempo. En el período de tiempo seleccionado, el programa enviará el recuento total actual de cada monitor a la computadora y comienza a contar de nuevo desde cero. El programa de ordenador almacena los datos en una nueva carpeta creada por el sistema de datos de la computadora. Los datos recogidos en cada monitor se almacenan por separado, y los documentos de texto individuales se crean para cada vial. Los datos se recogen continuamente mientras opera el programa.
  2. Al final del experimento, escanear los datos con la FileScan110X para Macintosh OSX (Intel) o SystemMB108 programa de PC con Windows (XP/Vista/7) para.
    Nota: El programa Scan elimina las lecturas duplicadas y se asegura de que las grabaciones se han completado.
  3. Guarde los datos recogidos dentro de un plazo específico y período de días. Elige un nombre de experimental y copie los archivos de la carpeta de datos de la computadora para su análisis.
    Nota: En este momento, los intervalos de actividad se pueden cambiar y convertirse a otros diferentes. Serán los datos originales permanecen almacenados en la carpeta de datos de la computadora y pueden ser recuperados, siempre y cuando no se eliminan.

8. Análisis de Datos

  1. Copie los datos recogidos en los archivos de texto en columnas de las hojas de cálculo de Excel para el análisis de datos. Los datos recogidos por este software son en columnas, que contienen números que representan la actividad total en un solo monitor durante un período de tiempo seleccionado por el investigador.
    Nota: Los datos recogidos para cada monitor se encuentran en archivos de texto separados. Hay 32 columnas para cada monitor. Las primeras seis columnas están vacías y sólo contienen 0; tres siguientes contienen los datos recogidos en el anillo inferior, en el centro, y en el anillo superior. El resto de los canales se puede eliminar, ya que no contienen ningún dato. Cada anillo emite unasolo valor por unidad de tiempo. Ver captura de pantalla de los datos en bruto en la Figura 2.
  2. Calcular la actividad total dentro de un periodo de tiempo deseado para cada monitor que representa la suma de la actividad de recogida en tres alturas diferentes de los rayos infrarrojos.
    Nota: El período de tiempo puede variar desde varias horas, 24 horas o varios días.
  3. Determinar el promedio de actividad locomotora y de la desviación estándar entre los 3 monitores que representan 3 réplicas biológicas.
    Nota: Los datos pueden ser analizados para la significación estadística mediante el uso de una serie de pruebas. Prueba t de A Estudiantes de dos colas, un solo sentido el análisis de varianza (ANOVA) y una prueba post-hoc de Tukey HSD se podrían utilizar para determinar los efectos de varias manipulaciones ambientales o genéticos en 24 horas de actividad locomotora espontánea 16. Hay una serie de otros programas que se pueden utilizar y han sido publicadas con anterioridad 17.

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Resultados

La actividad locomotora espontánea en Drosophila depende del sexo mosca (Figura 3), el contenido calórico de los alimentos (Figura 3B) y el ciclo de luz / oscuridad. Una vez que la luz se apaga actividad de las moscas disminuye dramáticamente. Figura 3A ilustra las 24 horas de grabaciones de la actividad locomotora de las moscas macho y hembra. Un asterisco en el eje x marca el momento en que la luz se apaga y la transición a la oscuridad ciclo. F...

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Discusión

Actividad locomotora espontánea de las moscas está influenciada por muchos factores como la edad, antecedentes genéticos, y el género 2,13,18,19. Además, los factores ambientales tales como el contenido calórico de la comida, la temperatura del medio ambiente, adición de diferentes medicamentos, y ciclo de luz día / noche pueden afectar actividad de la mosca. Por ejemplo, las moscas macho de la misma edad tienen una mayor actividad física espontánea en comparación con las mujeres (Figura 1). ...

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Divulgaciones

No tenemos nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud (AG023088 a BR).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Sacarosa FCC grado alimenticio 100 lb,Fisher Scientific MP BiomedicalsICN90471380
Brewer' s LevaduraFisher Scientific MP BiomedicalsICN90331280
Drosophila Agar FinoSciMartDR-820-25F
Harina de maízFisher Scientific MP BiomedicalsICN90141125
Metil4-hidroxibenzoato de metal, tegoseptSigmaH5501-5KG
EtOHPharmco-AAPER111000200
Levadura seca activaFisher Scientific ICN10140001
Fly Tanque de CO2LabScientificBGSU-7
Microscopio estereoscópicoOlympusSZ40
Drosophila dióxido de carbono (CO2)AirgasUN1013
Pincel pequeño para empujar las moscas
Frasco de cáscara anchoFischer ScientificAS519
Buzztaps para viales de plástico anchosFischer ScientificAS275
Viales de vidrio (25 x 95 mm)Fischer Scientific Kimble 60931-8AS-574
Tapones de esponja para viales de vidrioSciMartDR-750
Drosophila Dispensador de alimentosApplied Scientific (Fischer Científico)AS780Q
DPM Drosophila Monitor de poblaciónTrikinetics Inc.
Fuente de alimentación de CC con cable de líneaTrikinetics Inc.
PSIU9 La unidad de interfaz de fuente de alimentaciónTrikinetics Inc.
Cables telefónicos y divisores de 5 víasTrikinetics Inc.
Hardware de bus serie universal (USB)Trikinetics Inc.
Macintosh o PC con Windows con puerto
Software de adquisición de datos DAMSystem308X para Macintoch OSX (Intel)www.trikinetics.com
Software de adquisición de datos DAMSystem308 para PC con Windows (XP/Vista/7)www.trikinetics.com
[header]
Software DAMFileScan108X para Macintosh
software DAMFileScan108X para PC con Windows (XP/Vista/7)www.trikinetics.com
software USB (PSIUdrivers.zip)www.trikinetics.com
DAMSystem Notes 308(http://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Notes%20308.pdf
UCBwww.trikinetics.com

Referencias

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