Un método de bajo costo para el Análisis convulsiva actividad y movimiento en Drosophila

Resumen

Con una webcam y una combinación de programas de software libre y de bajo costo, los patrones locomotores en Drosophila melanogaster se pueden analizar para detectar diferencias en la velocidad, la distancia y el tiempo de las distintas actividades de motor.

Resumen

Sistemas de seguimiento de vídeo se han utilizado ampliamente para analizar el movimiento de Drosophila melanogaster y detectar diversas anomalías en el comportamiento de la locomotora. Aunque estos sistemas pueden proporcionar una gran cantidad de información sobre el comportamiento, el costo y la complejidad de estos sistemas pueden ser prohibitivo para muchos laboratorios. Hemos desarrollado un ensayo de bajo costo para medir el comportamiento de la locomotora y el movimiento de las crisis en D. melanogaster. El sistema utiliza una cámara web para capturar imágenes que se pueden procesar usando una combinación de software de bajo costo y libre para realizar un seguimiento de la distancia recorrida, la velocidad media de circulación y de la duración de movimiento durante un período de tiempo especificado. Para demostrar la utilidad de este sistema, se examinaron un grupo de D. melanogaster mutantes, los (BS) paralíticos Bang-sensibles, que son 3-10 veces más susceptibles a la actividad convulsiva (SLA) que tipo de moscas silvestres. El uso de este novedoso sistema, hemos sido capaces de detectar que el BS mutant insensata explosión (bss) presenta niveles más bajos de la locomoción exploratoria en un nuevo entorno de tipo salvaje moscas. Además, se utilizó el sistema para identificar que la metformina, que se utiliza comúnmente para tratar la diabetes de tipo II, reduce la intensidad de SLA en los mutantes BS.

Introducción

Dada su corta vida útil y las herramientas genéticas sólidos disponibles, Drosophila melanogaster es un excelente sistema modelo para la investigación de la etiología de diversas enfermedades y la fisiología subyacente de diversos procesos biológicos. En muchos casos, es ventajoso para medir los efectos que las manipulaciones de comportamiento, genéticos o farmacológicos tienen sobre la locomoción en estos organismos modelo ^1,2.

Hay una variedad de métodos que se utilizan comúnmente para medir el movimiento mosca en dos dimensiones ^3-7. Estos sistemas pueden apoyar el seguimiento de múltiples moscas simultáneamente y pueden medir la velocidad, el registro longitudes de trayectoria y registrar el porcentaje de tiempo que una mosca ha estado en movimiento. Se han utilizado para estudiar el movimiento en una variedad de contextos, incluyendo los efectos de los fármacos sobre la locomoción y la naturaleza dimorfismo sexual de la mosca movimiento ^6-9. El principal inconveniente de estos sistemas es el costo de los sistemas de seguimientoTEM o el software y la cámara correspondiente. En algunos casos, esto se puede ejecutar en los miles de dólares. El costo es una preocupación particular para un laboratorio que sólo sería necesario un uso limitado de un sistema de este tipo, por ejemplo, la cuantificación de los patrones locomotores de un mutante recién aislados.

Un método más simple pero menos robusto es utilizar sistemas que registrar el movimiento basa en cuántas veces una mosca cruza una trayectoria del haz de luz infrarroja que se coloca en el medio de un tubo cerrado ^10,11. Si bien este tipo de sistemas pueden dar información valiosa sobre los ciclos de movimiento y de sueño-vigilia, pueden sobre o bajo movimiento estimación porque no logran captar la trayectoria real de la mosca. Por ejemplo, las moscas que exhiben movimiento considerable en los extremos del tubo se registrarán tan bajo movimiento moscas aunque los métodos de alta resolución adicionales se han utilizado para tratar de sortear estas limitaciones ^12.

Más simple y más barato aún son dispositivos que miden geotaxi escaladas, el movimiento hacia arriba de las moscas, a través de un único tubo o una serie de tubos de ^2,13. Si bien estos sistemas son baratos y pueden identificar fácilmente los defectos geotaxis, no logran capturar muchos otros aspectos del movimiento que sean de interés para los investigadores.

Para muchos laboratorios, un sistema de análisis robusto de bajo costo que es fácil de configurar y operar sería una herramienta ventajosa para la caracterización de las diferencias de comportamiento en D. melanogaster cepas. Aquí se describe un ensayo que se puede establecer a partir de por menos de doscientos dólares y es capaz de dar información sobre la trayectoria, la velocidad y la duración del movimiento de la mosca. Para demostrar la eficacia del ensayo, se presentan datos que muestran que puede utilizarse para identificar; 1) un defecto del aparato locomotor en un Bang-sensibles (BS) mutante que es susceptible a ataques y 2) la capacidad de la metformina, la cual se utiliza comúnmente para tratar la diabetes de tipo II, para reducir la intensidad de la actividad convulsiva (SLA) in dos mutantes BS.

Protocolo

1. Preparación de un individuo Moscas de Ensayo Locomotion

1. Transferencia vuela golpeando suavemente en viales vacíos individuales y la tapa de los viales con un tapón de algodón. Permitir que las moscas se sienten sin molestias 20-30 min antes de la observación. Es importante no anestesiar a las moscas dentro de las horas antes de la observación del comportamiento como estudios anteriores han encontrado la exposición anestesia puede alterar el comportamiento en comparación con las moscas sin anestesiar ^14.
2. Golpear suavemente la marcha de la ampolla y coloque moscas individuales bajo un 5 cm de diámetro cubierta placa de Petri (5 mm de alto) con pequeñas aberturas para permitir el paso del aire. Iluminar desde abajo y observar las moscas usando una webcam montada encima de la placa de Petri.

2. Preparación de un individuo Moscas de Ensayo Seizure

1. Alimentación de dos días de edad convulsivos moscas sensibles cualquiera de los medios de levadura / harina de maíz / agar estándar o medios estándar mezclan directamente con las drogas. Por los datos presentados aquí, las moscas fueron alimentados con 1 gof medios estándar o 1 g de medios estándar mezclados con 25 mg de metformina.
2. Después de que las moscas han alimentado durante dos días en los medios de comunicación o los medios de comunicación, además de la droga, transferirlos mediante suaves golpecitos en viales vacíos individuales y tapar los frascos con un tapón de algodón. Permitir que las moscas se sienten en reposo durante 20 min antes de la observación. Es importante no anestesiar a las moscas dentro de las horas antes de la observación del comportamiento como estudios anteriores han encontrado la exposición anestesia puede alterar el comportamiento en comparación con las moscas sin anestesiar ^14.
3. Vortex viales individuales que contienen una sola mosca en un vórtice de laboratorio utilizando la configuración más alta durante 10 segundos. Coloque la mosca inmovilizada en una hoja blanca de papel en blanco justo debajo de una cámara web montada sobre el papel.

3. Grabación de vídeo

1. Registrar el movimiento o SLA usando el programa de software HandyAvi http://www.azcendant.com/download.htm . Este programa utiliza la cámara web paracapturar imágenes en base a la configuración de usuario.
2. Seleccione la opción de imágenes con lapso de tiempo bajo la pestaña Capture, Cuando se abra la ventana, seleccione la cámara web como dispositivo de captura. Para la mayoría de los experimentos el tamaño del fotograma de vídeo de 640 x 480 es adecuado.
3. Seleccione Intel IYUV codec para la compresión y escoja 0,1 seg / marco para el ensayo de convulsiones o elegir 0,1-0,5 seg / marco para el análisis de movimiento. En la ficha avanzada, seleccione Crear un archivo de imagen BMP. Para cada captura y seleccione una carpeta para el programa para almacenar las imágenes que toma (la pila de imágenes).
4. Coloque una mosca muerta en la hoja de papel. Haga clic en el cuadro de configuración de vídeo y ajustar la configuración en la ficha Configuración de dispositivo de modo que haya un fondo blanco brillante y un claro contraste con la marcha más oscuro.
5. Haga clic en el botón de inicio para comenzar la grabación. Una vez que el periodo de registro ha finalizado, haga clic en el botón de parada. La pila de imágenes debería estar ahora en la carpeta seleccionada. Nota: Antes de la grabación, seguro que al tratarder seleccionado para la pila de imágenes está vacía.

4. Análisis de datos mediante ImageJ

1. Imagen libre de ImageJ software de procesamiento de Open NIH, que se puede descargar de la siguiente http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html . Nota: Además de descargar el programa, el Multitracker plug-in debe ser descargado e instalado como se indica en http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html .
2. Importe la imagen de pila en ImageJ haciendo clic en la pestaña Archivo y seleccionando Importar → Secuencia de imágenes.
   1. Seleccione la carpeta que contiene la pila de imágenes, resalte una de las imágenes y seleccione Abrir. Un cuadro de diálogo Opciones de secuencia se abrirá. Haga clic en los nombres Ordenar y numéricamente a continuación, seleccione OK y la imagen de pila se cargará en ImageJ.
3. Umbral todas las imágenes para que cada uno consiste en un fondo blanco con ser la moscaconvertido a un punto negro. Para iniciar este proceso, convertir la imagen en un formato de 8 bits, seleccionando Tipo → 8 bits en la ficha Imagen.
   1. Haga clic en la ficha Imagen de nuevo y seleccione Ajustar → Umbral. Esto abrirá el cuadro de diálogo Umbral en el que el umbral punto de corte se puede ajustar.
   2. Escanear a través de las fotos para ver si hay puntos negros adicionales o si una rebanada carece de un punto negro. Si este es el caso, ajustar el umbral para aliviar el problema. Por lo general, el umbral no necesita ser ajustado como los valores predeterminados del programa a un valor adecuado.
      Nota: Cada diapositiva de la pila debe tener sólo un punto negro que representan la posición de la marcha.
   3. Seleccione Aplicar en el cuadro de diálogo Umbral y Convertir a Máscara cuadro de diálogo se abrirá. No haga clic en cualquiera de las opciones, pero basta con hacer clic en Aceptar para umbral de la pila de imágenes.
4. Después de un umbral a la pila de imágenes, seleccione la Multitracker plug-in en la pestaña Plugins paramedir el movimiento de la mosca en píxeles. Aparecerá el cuadro de diálogo Rastreador de objetos.
   1. Haga clic en cualquiera de las cuatro opciones que se ofrecen en el cuadro de diálogo y luego seleccione Aceptar. El plug-in Multitracker entonces adjuntar coordenadas para el punto negro en cada rebanada y enumérelos en la ventana de resultados, así como la longitud total del trayecto en píxeles. La ventana de Caminos da una representación gráfica de la trayectoria de la marcha tomó.
   2. Copie la lista x-e y-coordenadas de la ventana Resultados y pegar los datos en una hoja de cálculo Excel. Si cualquier diapositiva de la pila no tiene un punto negro en el mismo, el programa Multitracker se detendrá en esa diapositiva. Si esto ocurre, es necesario volver al paso 4.2 y re-umbral de la pila para asegurarse de que los registros de la mosca como un punto negro en la diapositiva en cuestión.
5. Con el fin de convertir el longitudes de trayecto de los píxeles a cm, tome una imagen separada de dos puntos que están separados uno cm de distancia en una hoja blanca de papel en blanco.
   1. Siga las anteriorespasos (3.1-4.4.2), para determinar la X, Y del píxel coordenadas de los dos puntos y utilizar esta información para determinar el número de píxeles correspondientes a un cm. Este factor de conversión se utiliza en el paso cinco para generar datos de movimiento en cm. Nota: Una vez hecho esto, es importante para mantener la cámara fija para todas las futuras grabaciones. Cada vez que la cámara se mueve o se ajusta, uno tiene que repetir este paso para convertir los píxeles a cm.
   2. La longitud del camino que se genera por el Multitracker plug-in sobreestima el movimiento debido a que pequeñas fluctuaciones en la posición del cuerpo y la intensidad de la luz / reflexión afectarán el tamaño y el centro del punto negro que se genera cuando un umbral a las imágenes. Este ruido se debe retirar con el fin de obtener una estimación precisa de movimiento mosca.

5. Análisis de datos mediante Excel

1. Eliminar el ruido de los datos registrados por la importación de la serie de coordenadas x, y generados por el pr MultitrackerOgram en Análisis Fly, un programa de Visual Basic de Excel creado por los autores. (El programa está disponible poniéndose en contacto con los autores.)
2. Haga clic en el botón Me Haga clic en y seleccione un valor umbral de corte. Seleccionar un valor umbral de 0,5 cm / seg para el análisis de SLA o seleccione un valor entre 0,1-0,3 cm / seg para el análisis de movimiento. Haga clic en Aceptar y el programa calculará la velocidad, el tiempo y la distancia de movimiento. Nota: El programa utiliza una ventana deslizante análisis para evaluar los datos secuenciales 0,5-1,0 contenedores seg y calcula la velocidad durante esa ventana. Cualquier cosa por encima del punto de corte definido por el usuario se trata como movimiento mosca.

Resultados

La técnica descrita aquí se ha utilizado previamente para analizar las diferencias en SLA en los mutantes de Drosophila BS ^1. Los resultados presentados aquí implican las cepas BS fácilmente conmocionado (EAS), la explosión sin sentido (bss), y por nocaut técnico (TKO). El locus eas codifica una quinasa implicada en la síntesis de etanolamina fosfatidiletanolamina ¹⁵ y el locus tko codifica una riboprotein mitocondrial ^16. La mutación BSS<...

Discusión

Al examinar locomotora o patrones de movimiento en Drosophila, es útil ser capaz de extraer información con respecto a la distancia recorrida, la velocidad de movimiento y el patrón de movimiento. Con el fin de extraer esta información, equipo costoso tradicionalmente se ha empleado que es a menudo prohibitivo para los pequeños laboratorios o laboratorios que deseen utilizar tales ensayos con moderación ^4,8,9.

El ensayo descrito aquí se puede utilizar para determinar la d...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
WebCam	Logitech	Pro900	Cualquier webcam de calidad será suficiente.
del software de time-lapse HandiAVI	Azcendant		puede encontrar en http://www.azcendant.com/
ImageJ	NIH		La última versión se puede encontrar en http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Multiracker Plug-In	NIH		La última versión se puede encontrar en http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html
Vortexer	VWR	Vortex Genie 2	La mayoría de los vórtices de tamaño estándar, como el Vortex Genie 2, serán suficientes.
Cubierta de placa de Petri de 5 cm	LabM Limited	D011	Las cubiertas de placa de Petri más pequeñas o más grandes se pueden utilizar para una arena en ensayo de movimiento.
Caja de luz	hecha		Construido a partir de material de desecho. La iluminación se utiliza para el ensayo de locomoción. Dependiendo de la iluminación de la habitación, es posible realizar el ensayo sin la caja de luz.