Tratamiento de los osteoblastos primarios de ratón con ácido retinoico produce una población homogénea de células ramificadas que llevan características morfológicas y moleculares de los osteocitos. El método supera la dificultad de obtención y mantenimiento de osteocitos primarios en cultivo, y puede ser ventajoso para estudiar las células derivadas de los modelos transgénicos.
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Artículo de método
La aplicación de ácido retinoico para obtener cultivos de osteocitos principal del ratón osteoblastos
En este artículo
Resumen
Resumen
La necesidad de las culturas osteocitos es bien conocido por la comunidad de investigadores de hueso; aislamiento de osteocitos primaria es difícil y produce números bajos de células. Por lo tanto, el sistema celular más utilizado es la línea celular MLO-Y4-osteocitos similares.
El método aquí descrito se refiere al uso de ácido retinoico para generar una población homogénea de células ramificadas con características de osteocitos morfológicos y moleculares.
Después del aislamiento de los osteoblastos de bóveda craneal de ratón, se añade ácido trans-retinoico (ATRA) a medio celular, y seguimiento de células se lleva a cabo todos los días en un microscopio invertido. Primeros cambios morfológicos son detectables después de 2 días de tratamiento y la diferenciación se completa generalmente en 5 días, con el desarrollo progresivo de las dendritas, la pérdida de la capacidad de producir la matriz extracelular, la regulación por disminución de los marcadores de los osteoblastos y la regulación de las moléculas-osteocitos específico. contenido "> monitoreo de celda diaria es necesaria debido a la variabilidad inherente de las células primarias, y el protocolo se puede adaptar con una mínima variación de las células obtenidas a partir de diferentes cepas de ratón y aplicados a los modelos transgénicos.
El método es fácil de realizar y no requiere instrumentación especial, es altamente reproducible, y genera rápidamente una población de osteocitos maduros en ausencia completa de la matriz extracelular, permitiendo el uso de estas células para aplicaciones biológicas ilimitadas.
Introducción
Los osteocitos, el tipo de célula ósea más abundantes, son terminales diferenciadas, células altamente ramificadas profundamente ubicadas dentro del esqueleto. El cuerpo de la célula de osteocitos maduros están contenidas en las lagunas de hueso y tener diversas formas; osteocitos con cuerpos celulares alargados se encuentran en el hueso cortical, mientras que los osteocitos redondeadas son más frecuentes en el hueso trabecular 1. Dendritas ramificadas se extienden desde el cuerpo celular y residen en pequeños canales llamados canalículos, formando una intrincada red que hace múltiples contactos no sólo con otros osteocitos, sino también con otros tipos de....
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Protocolo
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la normativa vigente de Europa en cuanto a la protección de los animales utilizados para fines científicos y que fueron revisados y aprobados por el comité de ética de la Universidad de Milán y el Nacional.
1. Aislamiento de osteoblastos primarios
El método, con pequeñas modificaciones, sigue el procedimiento descrito por Dodig et al 14.
- Preparar la digestión de medio, mediante la adición de 0,1% de colagenasa P y 0,05% de tripsina (a partir de 2,5% de tripsina 10X, sin rojo de fenol) a medio HBSS....
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Resultados
Resultados Se obtuvieron De 5 a 10 experimentos independientes.
Morfología Celular
AA / GP tratados células primarias tienen características en su mayoría empedradas similar, característico de los osteoblastos maduros. Células ramificadas intercalados (como indican las flechas rojas en la Figura 1A) se pueden encontrar, lo que probablemente representan algunos osteocitos.
Con el tratamiento de ATRA, las células comienzan rá.......
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Discusión
En los últimos años la osteocitos se ha convertido en la celda más central en la médula. Avances de investigación están revelando progresivamente una serie de propiedades de osteocitos antes insospechados o no probados, que son de gran valor para el diseño de nuevos y mejores tratamientos para una variedad de enfermedades óseas. Sin embargo, la investigación de la biología osteocitos ha estado sufriendo de la disponibilidad limitada de modelos in vitro hasta el punto de que los osteoblastos se han utilizado com.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El financiamiento fue proporcionado por el "Progetto una concorso Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico 2009-2010" de MD, y Associazione Bambino Nefropatico ABN Onlus, Milano
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Colagenasa P | Roche Ciencia Aplicada | 11213857001 | |
| Tripsina | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Precalentamiento a 37 ° C antes |
| de usar Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Precalentar a 37 & grados; C antes |
| de usar FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Estreptomicina/Penicilina | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Ácido ascórbico | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Glicerol 2-fosfato sal disódica hidrato | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Proteger ATRA de la luz |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich | P6148 | Disolver en PBS y filtrar antes de usar. Trabaje siempre bajo una cubierta química. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Se puede añadir al anticuerpo secundario |
| Rojo de alizarina | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Verde Janus | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Ácido perclórico | Sigma-Aldrich | 176745 | Úselo con precaución (se recomienda protección para la piel y los ojos) |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Úselo con precaución (se recomienda proteger la piel y los ojos) |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Fluorsave | Calbiochem - Merck | 345789 | |
| Economy Pinzas #7, puntas de 0,40 x 0,5 mm | Pinzas World Precision Instruments | 501981 | |
| Economy #4, puntas de 0,40 x 0,45 mm | World Precision Instruments | 501978 | |
| Tijeras de disección, rectas, curvadas de 10 cm | World Precision Instruments | 14394 | |
| Tijeras quirúrgicas, 14 cm, rectas, S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| Matraces de cultivo | Corning | 430168 | |
| Placas de pozo | Corning | 3335 | |
| Cubreobjetos Thermanox | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| Microscopio | Zeiss Apotome | ||
| Espectrómetro | Safas Xenius |
Referencias
- Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. Towards quantitative 3D imaging of the osteocyte lacuno-canalicular network. Bone. 47 (5), 848-858 (2010).
- Cheng, F., Hulley, P. The osteocyte--a novel endocrine regulator of body phosphate homeostasis. Maturitas.
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Reimpresiones y permisos
