Summary
レチノイン酸によるマウスの主骨芽細胞の治療は、骨細胞の形態学的および分子的特徴をもつ分岐した細胞の均質な集団を生成します。この方法は、培養中の一次骨細胞を取得し、維持することの難しさを克服し、トランスジェニックモデル由来の細胞を研究することが有利である。
Abstract
骨細胞培養の必要性は、骨の研究者のコミュニティによく知られている。一次骨細胞の単離は困難であり、低細胞数を生成する。したがって、最も広く使用される細胞系は、骨細胞様MLO-Y4細胞株である。
ここで説明する方法は、形態学的および分子骨細胞の機能と分岐した細胞の均質な集団を生成するために、レチノイン酸の使用を意味する。
マウス頭蓋冠骨芽細胞からの単離後、全トランスレチノイン酸（ATRA）を細胞培地に添加され、セル監視を倒立顕微鏡下で毎日行われる。最初の形態学的変化は、治療の2日後に検出可能であり、差別化は、一般的に骨芽細胞マーカーのレギュレーションダウンとアップレギュレーション骨細胞特異的分子の細胞外マトリックスを産生する能力が失われ、樹状突起の漸進的発展に伴い、5日間で完了する。
コンテンツ ">毎日のセル監視が原因初代細胞の固有の変動性に必要とされており、プロトコルは、異なるマウス系統から得た細胞への最小限の変化に適応し、トランスジェニックモデルに適用することができる。この方法は、実行が容易であり、特別な器具類を必要とせず、それは非常に再現性があり、かつ急速に無制限の生物学的用途のためのこれらの細胞の使用を可能にする、細胞外マトリックスの完全な非存在下で成熟した骨細胞集団を生成する。
Introduction
骨細胞、最も豊富な骨細胞型は、深く骨格内に位置する高度に分岐した細胞は最終分化している。成熟した骨細胞の細胞体は、骨小腔に含まれており、多様な形状を有する;丸みを帯びた骨細胞は、骨梁1に、より頻繁であるのに対し、細長い細胞体と骨細胞は、皮質骨で発見されています。分枝樹状突起は、他の骨ではなく、他の骨の細胞型、骨髄、血管及び関連する周皮細胞を有するだけでなく、複数の連絡先を行う複雑なウェブを形成する、細管と呼ばれる小さなチャネルにおいて細胞体から延びて存在する。小腔と細管間質液中に含まれる介して、骨細胞はまた、最終的に循環系に接続されているので、それらはローカルでなく、イベントだけでなく、全身に影響を与えることができ、その逆もその挙動は、局所および全身の両方の変化によって調節することができる2。
ザ·骨細胞の研究は、最近、このような組織および細胞特異的なトランスジェニック動物の生成、強力な顕微鏡技術のハイスループット分子スクリーニング3,4の使用などのいくつかの技術的な進歩のおかげで勢いを得ている。しかしながら、これらの細胞の知識は、主に、in vitroモデルにおいて適切な相対的希少性のために、依然として不完全である。実際に、骨細胞が原因の深い位置の取得と文化の中で維持するためには、常に困難であった、そしてそのような分化した細胞の種類を特徴づける低レベルの増殖している。
それらは一般的に低い細胞収量を生産し、さらにいくつかの混入線維芽細胞は急速に骨08過増殖というリスクを運ぶのに年に沿って、多数の方法は、一次骨5-7を単離するために開発されてきた。この理由のために、 インビトロの実験作業の中で最も、十分に確立された骨細胞の細胞リットルでこれまで行われてきたINE MLO-Y4 9。
追加のin vitroでの方法論は、これらの細胞を研究する可能性を高めることができるし、骨細胞生物学と病態生理の解析を向上させることができます。主に採用される、そのような方法は、再現することが容易であるべきであり、細胞成熟に達するために、特別な器具類又は非常に長い時間を必要としない。初代細胞に該当する場合重要なことに、彼らはそれが可能なトランスジェニック動物を利用することであろう。我々は最近、レチノイン酸による骨芽細胞株MC3T3-E1のと初代骨芽細胞の治療は骨10の形態学的および分子的特徴をもつ分岐した細胞の均質な集団の開発につながる迅速な表現型変化を誘導することを説明した。
オールトランスレチノイン酸（ATRA）は、核レチノイン酸受容体（RARは）を結合することにより遺伝子転写を調節するビタミンAの活性代謝産物である。 RARは最終的に、レチノイン酸（RA）応答性標的遺伝子の11の変調をもたらす、レチノイドX受容体（RXRの）とヘテロダイマーとしてDNAに結合する。 ATRAは、例えば、神経細胞12および有足13のような他の分岐した細胞は、それらのうち、いくつかの細胞型の分化および成熟を 調節することが示されている。
ここで説明する方法は、一次骨芽細胞に対するATRAの加算に基づいています。効果的にするために、ATRAは、定義された密度で播種した細胞上の正確な成熟段階で添加されなければならない;我々の経験では、これらの条件は、骨芽細胞から骨細胞への表現型のスイッチを得るために重要である。
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Protocol
全ての動物実験は、科学的な目的のために使用される動物の保護に関する国内および欧州の現行の規制に従って行ったとミラノ大学の倫理委員会によって審査され、承認された。
初代骨芽細胞の1。分離
この方法では、わずかな修正を加えて、Dodig ら 14によって記載された手順に従います。
- 0.1％コラゲナーゼPおよび0.05％トリプシンHBSS培地に（2.5％トリプシン、10X、無フェノールレッドから開始）（ハンクス平衡塩溶液、無カルシウム、マグネシウム、またはフェノールレッド）を追加することで、メディアを消化準備します。
- （手順はわずか1などのマウスに適用することができます）3〜4日齢のマウスを使用してください。
- 断頭により犠牲に。 70％エタノールでスプレーヘッド、氷上に保つ。ピンセット及び解剖/外科ハサミで皮膚や筋肉層を除去する。
- 優しく頭頂骨を削除し、2等分に矢状縫合に従うことによって、それらを分離する。骨は縫合糸および任意の接着性組織を含まず、手続きが完了するまでHBSS培地を含むウェルプレート内の個々の骨片を配置していることを確認してください。
- HBSSを捨て、各ウェルに37℃で15分間消化培地を追加
- 上清を捨てる。
- 再び37℃で15分間消化培地を追加
- このとき上清を保存し、α-MEM（最小必須培地）に入れて、10％FBS（ウシ胎児血清）および1％ストレプトマイシン/ペニシリンを補充。
- 繰り返します1.7と1.8倍を繰り返します。
- プール5分間425グラムで遠心分離して回収した画分3、スピン細胞、上清を捨て、細胞ペレットを再懸濁し、25cm 2のフラスコに転送するために補充したα-MEMの3ミリリットルを追加します。
- 破片および死細胞を除去するために24時間後に培地を変更します。
- グリコ50μg/ mlのアスコルビン酸（AA）および3mMの追加cerol 2 - リン酸二ナトリウム塩水和物（GP）α-MEM培地である。
- その後、一日おきに（α-MEMプラスAA / GP）培地を変更してください。
2。ATRAプロトコル
- 不活性化を防止する暗い部屋でATRA（オールトランス型レチノイン酸）ですべての実験を行っています。
- HBSS培地中の1Xトリプシン溶液を調製し、使用するまで37℃で維持する。
- フルエント細胞から培地を除去し、慎重にHBSSでそれらを洗ってください。
- 1ミリリットルのトリプシンを添加し、穏やかにすべての細胞は、トリプシンによって覆われることを可能にするために、フラスコを回転させ、37℃で3分間インキュベート
- 倒立顕微鏡下で細胞の実際の剥離を確認してください。
- トリプシンを不活性化するα-MEM培地の3ミリリットルを追加します。
- 細胞を回収し、425グラムで15分間遠心する。
- 新鮮な培地中で細胞ペレットを再懸濁する。
- 血球計数器の計数室の低下を置き、数分のために解決することを可能にし、CEを数えるLL番号。
- 10,000個の細胞のα-MEMプラスAA / GPと/ cm 2の密度で25cm 2のフラスコ内で場所細胞。細胞密度が細胞突起および細胞間の接点の最適な開発に関連していることに注意してください。出発密度より高く、10,000細胞/ cm 2の細胞プロセスの適切な発達を阻害するが、より低い細胞数は、細胞間の連絡先が存在しないため、時期尚早の細胞死をもたらす。
- 24時間毎に培地から5μmのATRAを追加します。
- 形態を評価するために日々のセルを監視：形態学的変化は、一般的に48時間後に観察される。場合は、最初の24〜48時間後に、細胞は、依然として上記の密度でreplate、増殖している。成熟した骨細胞の均質な集団は、4〜5日後に存在している。必要に応じて、12〜15日まで、任意の時点で細胞を使用する。
- 細胞は、（このようなカバースリップまたはウェルプレートのような）他の支持体上にメッキされている場合、上記の濃度が維持されていることを確認してくださいと使用するまで、ATRAごとに24時間を追加していく。実験の前に少なくとも24時間のための新しいサポートに付着する細胞を残す。
3。免疫染色
- 免疫染色のために、カバースリップ上の細胞をプレート（例えばバリー15を参照）確立された方法に従ってください。
- 例えば、間接的免疫蛍光のために、室温で30分間、次いで暗所で二次蛍光標識抗体と、加湿チャンバー内で室温で1時間一次抗体で順次インキュベートし、4％パラホルムアルデヒドまたは冷アセトン中で固定し、加湿チャンバー内。
- 核対比のために、DAPIまたは類似体を使用し、退色防止媒体にマウントします。
4。アリザリンレッド染色と抽出
- カバースリップ上の細胞をプレート。
- 10分間、70％エタノールでカバースリップを浸漬することによって細胞を固定。
- アリザリンレッド染色溶液（1 mg / ml、pH5.5）に数滴を有する細胞をカバー30分間。
- 水道水でカバースリップを洗ってください。マウントスライドガラス上グリセロールの降下と直立10Xと20X顕微鏡で倍率を用いて画像を取る。
- 上記の手順の後、水道水でスライドを浸漬することにより、カバースリップを回復する。
- ウェルプレートの各カバースリップを置く。
- 60％過塩素酸（量は細胞を完全にカバーするのに十分でなければなら）を追加し、穏やかに撹拌しながら4℃でO / Nのままにしておきます。
- 450 nmの波長で分光光度法により上清の光学濃度を読み取る。
- 細胞数の値を正規化するために、10分間、細胞調製物を覆うようにヤヌスグリーン（PBS中の0.2％溶液）を加える。
- 超純水で丁寧に洗ってください。
- 0.5NのHClを追加する（数量はすべてのセルをカバーするのに十分でなければなら）、数秒間、手でそっと振る。
- 分光光度計で615 nmの吸光度を読んでください。
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Representative Results
結果は5〜10の独立した実験から得られた。
細胞形態学
AA / GPは初代細胞は主に玉石のような機能、成熟骨芽細胞の特性を持って処理した。散在枝状細胞は、（ 図1Aの赤い矢印で示すように）可能性がいくつかの骨を表す、見出すことができる。
ATRA処理によって、細胞が急速に一般的に2日後に観察される波及効果を、表示を開始。 図1（b）に示すように、分枝細胞は樹状突起を拡張するためのスペースが必要になります。 ATRAが進むとの処理としては、波及効果が次第に数と複雑さの増加、1Cおよび1Dフィギュア 。ローダミン標識ファロイジンによるフィラメント状アクチンのファロイジン染色は、 図2によって標識される細胞プロセスを強調している。
基質産生
<p個のクラス= "jove_content">主要な骨芽細胞上および細胞間で蓄積し、アリザリンレッド染色、 図3Aによって可視化することができる石灰化マトリックスを大量に産生する。骨細胞は、石灰化した細胞外マトリックスを生成し、ATRA-インキュベートした細胞、 図3Bの完全に陰性アリザリンレッド染色結果はありません。従って、アリザリンレッドのいずれか最小の量は、抽出手順、 図3C後に測定することができない。骨細胞マーカーおよび製品
スクレロスチンは、ATRAで処理した細胞によって発現される、 図4は、激しい免疫細胞質発現および細胞プロセスに沿った正のドットの存在を明らかにする。免疫蛍光法により、強力なFGF23陽性は細胞体または細胞突起に沿ってのいずれか、ATRAで処理した細胞は 、 図5で検出可能である。
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図1。光学顕微鏡。初代骨芽細胞は、AA / GP（A）（スケールバーは100μm）との5日間のインキュベーション後に支配的な直方体の外観を示しています。疎分岐した細胞は（A）（矢印）を同定することができる。 ATRA治療（B）（スケールバーは100μm）の2日後、細胞は、より細長い形状を表示し、デンドライトが明らかに検出されます。唯一の細胞は、樹状のATRAのインキュベーション（C）（スケールバーは100μm）の5日後に観察し、高倍率（D）（スケールバーは50μm）でより良好に検出可能であることができる。
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図2。アクチンフィラメントの染色。アクチンフィラメントはローダミンfalloidin染色によって識別されます。図3日間ATRAで処理した細胞から得られた代表的な結果を示している。既にこの時点で、繊維状アクチンは細胞プロセスを開発する主要な成分として現れる。スケールバー：50μmである。
図3。石灰化沈着。ATRA-インキュベートした細胞（B）（スケールバーは50μm）に否定的であるのに対し、アリザリンレッド染色を乱反射、AA / GP（A）（スケールバーは100μm）との5日間のインキュベーション後に骨芽細胞で観察される。深遠な違いは、SPECTで測定することができるroscopyアリザリン抽出（c）の後。
図4。スクレロスチン。スクレロスチン陽性は、細胞質にし、ATRA（スケールバーは50μm）とインキュベートした細胞の細胞突起に沿って検出されている。
図5。FGF23。FGF23の免疫染色は、ATRA処理細胞（スケールバーは50μm）に激しいです。
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Discussion
最後の年で骨細胞は、骨の中の最も中心的な細胞として浮上している。研究の進歩は、徐々に骨様々な疾患のための新規およびより良い治療を設計するために多大な価値が以前に実証されていない又は疑われていない骨細胞の特性の数を明らかにしている。しかしながら、骨細胞生物学の調査は骨細胞様細胞株MLO-Y4が利用可能になる前に骨芽細胞が長期にわたってサロゲート細胞として使用されているような程度にin vitroモデルの限られた利用可能に罹患されている。さらに最近では、条件的に不死化細胞株は、スクレロスチンとFGF23を表現後半骨細胞を分枝する分化させることができる、同じグループ16、紹介されました。これらの細胞株の極値問合せ下にないが、それは非常によく一次細胞は、よりin vivoでの状況に似ており、一次骨frを取得する可能性を提供することが知られている特定の分子経路についての機能的研究を行うためにトランスジェニック動物をOM。
単離及び第5,6、続いて、ラット及びマウスの骨17,7からニワトリの骨から得られた一次骨細胞の培養物は、非常に有用であるが、それらの単離は、手順ごとに少数の細胞のみを生成し、細胞純度が大幅に依存している個々の専門知識を。したがって、この方法は現在、研究室の限られた数によって使用される。
他の研究グループは、より生理的環境を構成しているが、その後の研究アプリケーションの障害である3次元の鉱化行列18,19、プログレッシブ埋め込 みによって骨芽細胞の分化を誘導することにより、成熟した骨細胞を取得しています。これは、マトリックスの石灰化20、並びに低酸素分圧21は 、骨細胞の成熟の生理的トリガーがあることは事実である。しかし、会ったhodologyこの二つの条件を回避することが実現可能性を高め、細胞の使用を拡張することができる。骨芽細胞を成熟させるレチノイン酸を添加することで構成されています私たちの提案した方法10は 、、、再現性の高いシンプルで、細胞トランスフェクション22を回避したり、高価な成長の使用は23因子 。
一連の予備実験では、我々は出発細胞数は、複数の樹状突起や細胞間の接点の重要なステップ、コンディショニング適切な形成であることが判明しました。低すぎる数字が細胞苦しみと死をもたらす、細胞間接着の損失をもたらすのに対して、高すぎるめっきセル密度は、複雑さおよび細胞プロセスの延長に影響を与える。
重要なのは、ATRAの投与量および細胞形態の毎日のモニタリングの調整は非常にために、ATRAに対する感度に影響を与えることができる初代細胞の固有の変動のため、推奨されている。これらの側面は、特に関連WHEになることができますnの方法は、トランスジェニックモデルに適用される。
樹状突起は、繊維状アクチンが豊富であるため、細胞プロセスの開発は、アクチン染色によってモニターすることができる。
それはよく骨石灰化マトリックスを産生しないことが知られており、アリザリンレッド染色を完全に否定するまで漸減によって示されるようにATRAのインキュベーションは、急速に、それを廃止する。一方、ATRAは最も顕著24スクレロスチン周知の骨細胞マーカーの発現を誘導し、FGF23、骨および25を取り扱う全身リン酸に関係する基本的な成長因子の産生を確実にする。従って、骨細胞におけるFGF23およびスクレロスチンの機能的役割を調査を目的としたさらなる研究は、これらの分子の内因性の産生によって促進されるであろう。
要約すると、我々は、レチノイン酸による治療は、一次頭蓋冠細胞から成熟した骨細胞の均一な集団を生成することを示す野生型およびトランスジェニック動物の両方から骨細胞の簡単かつ迅速な調製を可能refore。他の方法と比較して、我々のプロトコルは、いくつかの利点、主に単純なアプリケーションと高い再現性を提供するように思われる。骨細胞の成熟のプロセスは、5日間のフレームで発生するいくつかの工程を経てプロセスの広がり初期からの細胞の十分な数で研究することができる。さらなる利点として、成熟した骨細胞は、無制限の分子的および機能的アッセイの適用を可能にする、鉱化マトリックスを囲む完全な非存在下で得られる。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
資金はMDに「PROGETTO concorso伊IRCCS病院周辺マッジョーレ総合病院2009年から2010年」、およびAssociazioneバンビーノNefropatico ABN Onlus、ミラノから提供された
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase P | Roche Applied Science | 11213857001 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Pre-warm at 37 °C before use |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Streptomycin/Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Protect ATRA from light |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in PBS and filter before use. Always work under a chemical hood. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Can be added to the secondary antibody |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Janus Green | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 176745 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Fluorsave | Calbiochem - Merck | 345789 | |
| Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5 mm tips | World Precision Instruments | 501981 | |
| Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45 mm tips | World Precision Instruments | 501978 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm curved | World Precision Instruments | 14394 | |
| Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| Culture flasks | Corning | 430168 | |
| Well-plates | Corning | 3335 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| Microscope | Zeiss Apotome | ||
| Spectrometer | Safas Xenius |
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