Un método para generar pulmonar Neutrofilia Usando aerosol lipopolisacárido

Resumen

Se describe un método para inducir la inflamación pulmonar neutrofílica por desafío para el lipopolisacárido de aerosol por nebulización, para modelar la lesión pulmonar aguda. Además, también se describen técnicas quirúrgicas básicas para la separación de pulmón, la intubación traqueal y lavado broncoalveolar.

Resumen

La lesión pulmonar aguda (ALI) es una enfermedad grave caracterizada por neutrofilia alveolar, con opciones de tratamiento limitadas y una elevada mortalidad. Los modelos experimentales de ALI son clave para mejorar nuestra comprensión de la patogénesis de la enfermedad. El lipopolisacárido (LPS) derivadas de bacterias gram positivas induce la inflamación neutrofílica en las vías respiratorias y parénquima pulmonar de los ratones. La administración pulmonar eficiente de compuestos tales como LPS es, sin embargo, difícil de lograr. En el método descrito aquí, la administración pulmonar en ratones se logra mediante desafío para aerosol Pseudomonas aeruginosa LPS. Disuelto LPS fue aerosol mediante un nebulizador conectado a aire comprimido. Los ratones fueron expuestos a un flujo continuo de LPS aerosol en una caja de plexiglás durante 10 min, seguido de 2 min acondicionado después se suspendió el aerosol. La intubación traqueal y posterior lavado broncoalveolar, seguido de una perfusión de formalina se realizaron siguiente, que permite la caracterización de la p estérilinflamación ulmonary. Aerosol LPS genera una inflamación pulmonar que se caracteriza por neutrofilia alveolar, detectado en el lavado broncoalveolar y por evaluación histológica. Esta técnica se puede configurar en un pequeño coste con unos aparatos, y requiere una formación mínima y experiencia. El sistema de exposición de este modo se puede realizar de forma rutinaria en un laboratorio, con el potencial de mejorar nuestra comprensión de la patología pulmonar.

Introducción

El lipopolisacárido (LPS) es un componente de la pared celular de las bacterias gram negativas ^1. Desafío a LPS es un modelo bien documentado de la lesión pulmonar aguda, un síndrome caracterizado por la inflamación neutrofílica aguda y edema ^2. Además, neutrofilia pulmonar es también una característica de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) ^3, y el desafío LPS en los seres humanos se ha utilizado para modelar las exacerbaciones de EPOC ^4. Así, los modelos experimentales de la exposición LPS son clínicamente relevantes y herramientas valiosas para entender la patología humana.

El objetivo de la administración pulmonar de aerosol LPS descritas aquí es generar una respuesta inflamatoria neutrofílica en la realización y vías respiratorias, sin afectación sistémica. Varias técnicas de exposición a LPS se han descrito anteriormente. Inyección intra-venosa de LPS es la ruta más común de administración. Aunque esta técnica es fácilmente accesible, tél daño primario es al endotelio, con la destrucción secundaria del epitelio pulmonar después de la migración de neutrófilos al pulmón. Administración intra-venosa también induce la inflamación sistémica ^2, lo que puede complicar el cuadro clínico en modelos animales. La inflamación sistémica está en contraste no observado con la administración intra-traqueal. Esta técnica, sin embargo, es una labor intensiva y requiere anestésicos así como una considerable formación ^{5, 6.} Además, la deposición pulmonar por esta vía de administración depende de la respiración ^7. Por lo tanto, la deposición pulmonar se ve afectada por la profundidad de la anestesia necesaria para se pueden observar la administración traqueal intra y deposición variable en las vías respiratorias. En contraste, la administración pulmonar con LPS en aerosol requiere una formación mínima, y se puede lograr fácilmente en un gran número de animales con poca o ninguna variación entre individuos ^{5, 8.}Un estudio reciente confirma que la administración en aerosol es superior a la ruta intra-traqueal con respecto a la deposición, y que las dosis más relevantes de LPS induce la inflamación neutrofílica con este modelo ^8.

Estudios anteriores han demostrado que desafío para aerosol Pseudomonas aeruginosa LPS genera una respuesta inflamatoria marcada en el lumen de la vía aérea y parénquima pulmonar, incluyendo los espacios alveolares ^{9, 10.} La inflamación se caracteriza por el predominio de neutrófilos y la presencia de edema pulmonar, y por lo tanto se puede utilizar para hacer frente a la patogénesis de la lesión pulmonar aguda y adquirir un mayor conocimiento de los mecanismos que contribuyen a la patología de la enfermedad.

Protocolo

Los estudios con animales fueron aprobados por el comité de ética de bienestar animal Estocolmo norte. Los procedimientos experimentales se realizaron en cumplimiento de la legislación sueca.

1. Generación de un Aerosol LPS

1. Disolver 0,5 g purificado P. aeruginosa LPS en 50 ml de solución salina estéril con agitación suave y verificar la disolución. Diluir 1 ml disueltos LPS en 9 ml de solución salina estéril, a una concentración final de 1 mg / ml. Proteger de la luz con papel de aluminio y se almacena a -20 ° C.
2. Descongelar LPS solubilizados en la oscuridad a temperatura ambiente y mezclar bien inmediatamente antes del uso.
3. En un nivel II campana de bioseguridad ventilado, insertar una entrada de rojo en un nebulizador, y conectar el nebulizador al aire ambiente presurizado a través de la tubería proporcionada por el (esquema de revisión la presentación de los dispositivos experimentales en la Figura 1) fabricante.
   PRECAUCIÓN: el equipo de protección personal adecuado, incluyendo una media pieza facial respirat reutilizableo con filtros de partículas, gafas, guantes y ropa de protección debe utilizarse durante el transcurso de la exposición.

Figura 1:. Presentación esquemática de los dispositivos experimentales utilizados para la generación de un aerosol La entrada del nebulizador está conectado a un suministro de aire. La salida del nebulizador se conecta primero a un medidor de flujo a través de un tubo de 15,9 mm y un filtro de aire, y el suministro de aire se ajusta a 5,0 L / m en 2 kbar de presión. La salida está al lado conectado a una caja de plexiglás equipado con tapas removibles y 5 agujeros mm para evitar la acumulación de presión.

4. Conectar la salida del nebulizador para un medidor de flujo de masa a través de un filtro de aire. Conectar el medidor de flujo de masa a un suministro eléctrico.
5. Ajuste el suministro de aire a 5 L / min, con una presión restante en 1,0-2,0 bar.
6. Retire el medidor de flujo de masa ydesconecte el suministro de aire.
7. Conectar la salida del nebulizador a un tubo de 15,9 mm, que se bifurca y se conecta a dos cajas de plexiglás con las dimensiones: 150 x 163 x 205 mm, equipados con tapas removibles. Cada caja debe tener un agujero de 5 mm en el lado opuesto a la entrada, para evitar la acumulación de presión.
8. Coloque un máximo de 5 ratones en cada caja de plexiglás y cerrar los párpados.
9. Abra el nebulizador y llenar el inserto con al menos 4 ml de LPS disuelto en solución salina o vehículo estéril solo (solución salina estéril; el volumen no debe superar los 8 ml). Vuelva a conectar la entrada de suministro de aire.
10. Permitir que el aerosol fluya hacia las cajas de plexiglás cerrados durante 10 min. Supervise a los animales de forma continua. Asegúrese de que el suministro de aire se mantiene firmemente asegurada a la entrada del nebulizador.
11. Desconecte el suministro de aire. Con los párpados cerrados, dejar que los animales permanecen en las cajas de plexiglás durante 2 min.
12. Abra las tapas y permitir el aerosol para dispersar, y devolver los animales a tél jaulas. Si los animales aparecen en húmedo, coloque las jaulas en una almohadilla térmica a baja temperatura, para evitar la hipotermia.
13. Supervise a los animales de forma continua durante los primeros 30 minutos, y posteriormente cada 2 h durante las primeras 6 horas. Los animales deben exhibir patrón respiratorio normal y la actividad durante y después del procedimiento de nebulización.

2. lavado broncoalveolar (BAL)

1. En el punto final experimental, profundamente anestesiar a los animales con isoflurano a efecto según lo recomendado por el personal veterinario de la institución. Apriete la pata posterior para verificar el reflejo de retirada para garantizar la suficiente profundidad de la anestesia para llevar a cabo una cirugía mayor. Pulverizar abajo de la piel de los animales con etanol al 70%.
2. Abra el abdomen con unas tijeras, y apartarán de la aorta para Exsanguinate animal. Coloque un pedazo de tejido sobre el abdomen para absorber la sangre.
3. Follwing eutanasia, utilice un solo corte anterior-posterior de las tijeras paraexponer el tórax. Levante la caja torácica por el extremo anterior del esternón y usar las tijeras para perforar el diafragma en el punto ventral más, sin cortar en cualquier lóbulo pulmonar. Abra la caja torácica haciendo dos cortes en la dirección antero-posterior (reuniones por debajo de la mandíbula).
4. Tire suavemente aparte de las costillas con unas pinzas, y cortar la tráquea por debajo de la laringe.
5. Levantar la tráquea con las pinzas y quitar los pulmones mediante la reducción de los ligamentos que conectan los lóbulos a la cavidad torácica, y tirando suavemente por el tejido adiposo y cardíaco.
6. Insertar un tubo de polietileno (diámetro interno: 0,58 mm; diámetro exterior: 0.965 mm) en la tráquea y asegurar el tubo con una cadena de hilo de seda.
7. Ate la multilobular (los cuatro lóbulos del pulmón derecho) con hilo de seda.
8. Inserte una aguja de calibre 23 en el tubo de polietileno e inyectar lentamente 250 l de PBS estéril fría en el lóbulo individual con una jeringa de 1 ml.
9. Golpee suavemente los pulmones30 veces y recoger el líquido a través de la jeringa. Repetir el procedimiento con 200 l de PBS (aproximadamente 300 l de PBS debería ser recuperado de la solo lóbulo del volumen total inyectado de 450 l).
10. Mantenga el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) en hielo, o enumerar las células BAL inmediatamente. Contar las células con un heamocytometer, utilizando la solución de Turk para teñir las células ^11. Calcular el número total de células multiplicando el número de células con el factor de dilución de la solución de tinción y el volumen dentro del campo de contado de la heamocytometer.
11. Preparar los recuentos de células diferenciales a partir de células citocentrifugadas como se describe en otra parte ^11.

3. La formalina Fijación de tejido pulmonar para la evaluación histológica

1. Retire la multilobular y complemento de congelación en hielo seco. Almacenar a -80 ° C.
2. Montar una jeringa de 60 ml con el émbolo retirado en un soporte de apoyo de metal. Llene la jeringa con formol al 10% parala altura de 20 cm por encima de la mesa de laboratorio, que representan a 20 cm de presión constante.
3. Conectar la aguja de calibre 23 fijada a la tráquea a la jeringa 60 ml a través de un tubo de plástico con una válvula para controlar el flujo de formalina.
4. Insuflar el lóbulo pulmonar con formalina durante 5 min. Desconectar y retirar la aguja junto con el tubo de polietileno de la tráquea mientras tira del hilo de seda para cerrar la tráquea y retener la presión en el pulmón.
5. Sumerja el lóbulo pulmonar en formalina y fijar durante 24 horas a 4 ° C.
6. Lavar el tejido fijado tres veces durante al menos 20 min con etanol al 70%, y deshidratar a xileno a través de la siguiente régimen (1 hr cada uno):
   • 3x 70% de etanol
   • 3x 95% de etanol
   • 3x 100% de etanol
   • 3x xileno
   • 1x (líquido) de parafina
7. Incrustar el tejido se deshidrataron en parafina, se cortaron en secciones de 4-5 micras, y mancha con hematoxilina y eosina para permitir la evaluación histológica.

Resultados

Desafío a aerosol P. aeruginosa LPS por lo general produce una marcada respuesta inflamatoria en el lumen de las vías respiratorias y el espacio alveolar, que se caracteriza por el predominio de neutrófilos en ambos puntos temporales tempranos y tardíos.

Aerosol LPS induce neutrofilia pulmonar

Ratones C57BL / 6BY y BALB / c fueron expuestas a aerosol P. aeruginosa LPS o vehículo solo y neutrófilos se enumeran en BALF. El número total de células en ...

Discusión

Aerosol LPS genera una respuesta inflamatoria en las vías respiratorias, que se caracteriza por los neutrófilos en la submucosa epitelial, espacios que rodean las vías respiratorias conductoras, así como los espacios alveolares. Esto es, junto con el aumento del contenido de proteína total en BALF, indicativo de pérdida de plasma, representante de la patología de la lesión pulmonar aguda. Como LPS induce una inflamación estéril, la reacción es independiente de la respuesta inmune adaptativa, y hay limitaciones a la rele...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Purificado Pseudomonas aeruginosa LPS	Sigma-Aldrich		Dañino. Purificación recomendada. Se puede utilizar LPS purificado de otras bactrianas.
Pari LC nebulizador de estrella sprint	PARI Respiratory Equipment Inc.	023G1250
Caudalímetro másico TSI 4040	TSI	4040	Se puede utilizar un producto alternativo del proveedor.
Tubo Saint-Gobain 15.9 mm Tygon	Sigma-Aldrich	Z685704	Marca recomendada.
Cajas de plexiglás con tapas extraíbles	/A	a medida	150 x 163 x 205 mm (un agujero de 2 mm en el lateral).
3M Media Mascarilla Respirador Reutilizable	3M	7503	Marca recomendada.
Filtros de partículas avanzados de 3M (P100)	3M	2291	Marca recomendada.
Tijeras	VWR	233-1104	Se pueden utilizar las tijeras preferidas.
Pinzas	VWR	232-1313	Se pueden utilizar las pinzas preferidas.
Tubo de polietileno Intramedic PE50	BD	427411	marca recomendada.
Banda de rodadura de seda Ethicon 2-0 Perma-hand	VWR	95056-992	Marca recomendada.
26 ½ aguja			Existen proveedores alternativos.
Jeringa BD de 1 ml con punta deslizante, no estéril	BD	301205	Existen proveedores alternativos.
Jeringa BD Luer-Lok de 60 ml, no estéril, polipropileno	BD	301035	Existen proveedores alternativos.
Fluka Hematoxilina-Eosina	Sigma-Aldrich	3972	Existen proveedores alternativos.
Tü Solución de rk	Merck Millipore	109277
Centrífuga de sobremesa			Existen fabricantes alternativos.
Cytospin 4 citocentrífuga	Thermo Scientific	A78300003	puede utilizar una centrífuga alternativa.
Paquete de estadísticas HEMA-3	Fisher Scientific	23-123-869	Existen kits de tinción alternativos.
Solución de formalina, tamponada neutra, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Existen proveedores alternativos.