Un método para generar pulmonar Neutrofilia Usando aerosol lipopolisacárido

Resumen

Se describe un método para inducir la inflamación pulmonar neutrofílica por desafío para el lipopolisacárido de aerosol por nebulización, para modelar la lesión pulmonar aguda. Además, también se describen técnicas quirúrgicas básicas para la separación de pulmón, la intubación traqueal y lavado broncoalveolar.

Resumen

La lesión pulmonar aguda (ALI) es una enfermedad grave caracterizada por neutrofilia alveolar, con opciones de tratamiento limitadas y una elevada mortalidad. Los modelos experimentales de ALI son clave para mejorar nuestra comprensión de la patogénesis de la enfermedad. El lipopolisacárido (LPS) derivadas de bacterias gram positivas induce la inflamación neutrofílica en las vías respiratorias y parénquima pulmonar de los ratones. La administración pulmonar eficiente de compuestos tales como LPS es, sin embargo, difícil de lograr. En el método descrito aquí, la administración pulmonar en ratones se logra mediante desafío para aerosol Pseudomonas aeruginosa LPS. Disuelto LPS fue aerosol mediante un nebulizador conectado a aire comprimido. Los ratones fueron expuestos a un flujo continuo de LPS aerosol en una caja de plexiglás durante 10 min, seguido de 2 min acondicionado después se suspendió el aerosol. La intubación traqueal y posterior lavado broncoalveolar, seguido de una perfusión de formalina se realizaron siguiente, que permite la caracterización de la p estérilinflamación ulmonary. Aerosol LPS genera una inflamación pulmonar que se caracteriza por neutrofilia alveolar, detectado en el lavado broncoalveolar y por evaluación histológica. Esta técnica se puede configurar en un pequeño coste con unos aparatos, y requiere una formación mínima y experiencia. El sistema de exposición de este modo se puede realizar de forma rutinaria en un laboratorio, con el potencial de mejorar nuestra comprensión de la patología pulmonar.

Introducción

El lipopolisacárido (LPS) es un componente de la pared celular de las bacterias gram negativas ^1. Desafío a LPS es un modelo bien documentado de la lesión pulmonar aguda, un síndrome caracterizado por la inflamación neutrofílica aguda y edema ^2. Además, neutrofilia pulmonar es también una característica de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) ^3, y el desafío LPS en los seres humanos se ha utilizado para modelar las exacerbaciones de EPOC ^4. Así, los modelos experimentales de la exposición LPS son clínicamente relevantes y herramientas valiosas para entender la patología humana.

El o....

Protocolo

Los estudios con animales fueron aprobados por el comité de ética de bienestar animal Estocolmo norte. Los procedimientos experimentales se realizaron en cumplimiento de la legislación sueca.

1. Generación de un Aerosol LPS

1. Disolver 0,5 g purificado P. aeruginosa LPS en 50 ml de solución salina estéril con agitación suave y verificar la disolución. Diluir 1 ml disueltos LPS en 9 ml de solución salina estéril, a una concentración final de 1 mg / ml. Proteger de la luz con papel de aluminio y se almacena a -20 ° C.
2. Descongelar LPS solubilizados en la oscuridad a temperatura ambiente y mezclar bien inmediatament....

Resultados

Desafío a aerosol P. aeruginosa LPS por lo general produce una marcada respuesta inflamatoria en el lumen de las vías respiratorias y el espacio alveolar, que se caracteriza por el predominio de neutrófilos en ambos puntos temporales tempranos y tardíos.

Aerosol LPS induce neutrofilia pulmonar

Ratones C57BL / 6BY y BALB / c fueron expuestas a aerosol P. aeruginosa LPS o vehículo solo y neutrófilos se enumeran en BALF. El número total de células en .......

Discusión

Aerosol LPS genera una respuesta inflamatoria en las vías respiratorias, que se caracteriza por los neutrófilos en la submucosa epitelial, espacios que rodean las vías respiratorias conductoras, así como los espacios alveolares. Esto es, junto con el aumento del contenido de proteína total en BALF, indicativo de pérdida de plasma, representante de la patología de la lesión pulmonar aguda. Como LPS induce una inflamación estéril, la reacción es independiente de la respuesta inmune adaptativa, y hay limitaciones a la rele.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
LPS purificada de Pseudomonas aeruginosa	Sigma-Aldrich		Peligrosa. Se recomienda purificación. Puede utilizarse LPS purificada de otras bacterias.
Nebulizador Pari LC sprint star	PARI Respiratory Equipment Inc.	023G1250
Flujómetro de masa TSI 4040	TSI	4040	Puede utilizarse un producto alternativo del proveedor.
Tubo Tygon de Saint-Gobain de 15,9 mm	Sigma-Aldrich	Z685704	Marca recomendada.
Cajas de plexiglás con tapas extraíbles	Construcción personalizada	N/A	150 x 163 x 205 mm (un orificio de 2 mm en el lateral).
Respirador semimascarilla reutilizable 3M	3M	7503	Marca recomendada.
Filtros particulados avanzados 3M (P100)	3M	2291	Marca recomendada.
Tijeras	VWR	233-1104	Pueden utilizarse tijeras preferidas.
Pinzas	VWR	232-1313	Pueden utilizarse pinzas preferidas.
Tubo de polietileno Intramedic PE50	BD	427411	Marca recomendada.
Hilo de seda Perma-hand 2-0 de Ethicon	VWR	95056-992	Marca recomendada.
Aguja de calibre 26 ½			Existen proveedores alternativos.
Jeringa de 1 ml con punta deslizable, no estéril, de BD	BD	301205	Existen proveedores alternativos.
Jeringa Luer-Lok de 60 ml, no estéril, de polipropileno, de BD	BD	301035	Existen proveedores alternativos.
Hematoxilina-Eosina Fluka	Sigma-Aldrich	3972	Existen proveedores alternativos.
Solución de ürk	Merck Millipore	109277
Centrífuga de mesa			Existen fabricantes alternativos.
Citocentrífuga Cytospin 4	Thermo Scientific	A78300003	Puede utilizarse una centrífuga alternativa.
Kit de tinción HEMA-3 stat pack	Fisher Scientific	23-123-869	Existen kits de tinción alternativos.
Solución de formalina, tamponada neutra, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Existen proveedores alternativos.