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Medición de la columna vertebral presináptica inhibición en ratones mediante la raíz dorsal de grabación Potencial

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DOI:

10.3791/51473

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29 de marzo de 2014

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1Hans Berger Department of Neurology, Jena University Hospital, Jena, Germany, 2Integrated Research and Treatment Center, Center for Sepsis Control and Care (CSCC), Jena University Hospital, Jena, Germany

En este artículo

Resumen

Inhibición presináptica GABAérgicas es un poderoso mecanismo inhibitorio en la médula espinal importante para el motor y la integración de la señal sensorial en las redes de la médula espinal. Subyacente despolarización aferente primaria se puede medir mediante el registro de los potenciales de la raíz dorsal (DRP). Aquí se demuestra un método de grabación en vivo de DRP en ratones.

Resumen

La inhibición presináptica es uno de los más poderosos mecanismos inhibitorios en la médula espinal. El mecanismo fisiológico subyacente es una despolarización de las fibras aferentes primarias mediada por sinapsis GABAérgicas axo-axonales (despolarización aferente primaria). La fuerza de la despolarización aferente primaria se puede medir mediante el registro de los potenciales de volumen-llevado a cabo en la raíz dorsal (potenciales de la raíz dorsal, DRP). Los cambios patológicos de la inhibición presináptica son cruciales en la central de procesamiento anormal de ciertas condiciones de dolor y, en algunos trastornos de la hiperexcitabilidad del motor. Aquí se describe un método de DRP grabación en vivo en ratones. Se explica la preparación de las raíces dorsales de la médula espinal en el animal anestesiado y el procedimiento de registro con electrodos de succión. Este método permite medir GABAérgica DRP y por lo tanto la estimación de la inhibición presináptica de la médula en el ratón vivo. En combinación con modelos de ratones transgénicos, la grabación puede DRP sírve como una herramienta poderosa para investigar la enfermedad asociada a la columna vertebral fisiopatología. In vivo la grabación tiene varias ventajas en comparación con las preparaciones in vivo de médula espinal aisladas ex, por ejemplo, la posibilidad de grabar o la manipulación de las redes supraespinales y la inducción de DRP por la estimulación de los nervios periféricos simultánea.

Introducción

La inhibición presináptica es uno de los más poderosos mecanismos inhibitorios en la médula espinal. Inhibe los potenciales postsinápticos excitatorios (EPSPS) en motoneuronas monosinápticamente excitados sin cambiar el potencial de la membrana postsináptica y la excitabilidad de las motoneuronas 1-3. Despolarización aferente primaria (EAP) inducida por la sinapsis GABAérgicas axo-axonal presináptica sobre las fibras sensoriales es el mecanismo subyacente 4-7 (véase también Figure1a). Estas sinapsis contienen GABA A y GABA-B (receptores GABA A y GABA B R R). La actividad de GABA A R conduce a un aumento en la conductancia de cloruro que provoca PAD debido a la distribución de iones local. Esta despolarización bloques de la propagación de potenciales de acción en los terminales de los axones y reduce su fuerza que conduce a una disminución de Ca 2 +-afluencia y la reducción de la liberación del transmisor. La activación de los receptores GABA B no hacet contribuyen a PAD, pero conduce a una reducción de la Ca 2 +-afluencia mejorando así la inhibición presináptica. Mientras que la activación de GABA A R parece estar implicado en la inhibición a corto plazo, el GABA B R están implicados en la modulación de largo plazo 8-10. Además de GABA, que representa la mayor parte de la PAD y la inhibición presináptica, otros sistemas transmisores también podrían modular y contribuir a este mecanismo de 11,12.

Los cambios patológicos en la inhibición presináptica parecen ser cruciales en varios estados de enfermedad, por ejemplo, la inflamación y el dolor neuropático periférico 13,14, así como el procesamiento anormal de dolor central 15, lesión de la médula espinal 16, y enfermedad del SNC con hiperexcitabilidad del motor mediada por la transmisión GABAérgica defectuoso 17, 18. Por lo tanto, la estimación de la inhibición presináptica la pena investigar las condiciones patológicas experimentales a nivel de la médula espinal en vivo . PAD da lugar a potenciales de volumen llevado a cabo proporcionando una medida directa de la inhibición presináptica en la médula espinal. Esas posibilidades se denominan potenciales de la raíz dorsal (DRP) y pueden ser medidos de las raíces dorsales de la médula espinal después de la estimulación de las raíces dorsales adyacentes 7.

Las primeras mediciones de DRP se han reportado en los gatos y ranas 19 y fueron intensamente estudiado en gatos por Eccles, Schmidt, y otros en la década de 1970 3,4,20,21. Mientras grabaciones in vivo de DRP en los gatos 22 y 23 ratas han sido ampliamente utilizados, las mediciones en los ratones se han realizado casi exclusivamente en preparaciones aisladas ex vivo de la médula espinal 15,24. Aquí, se describe un método para grabar DRP en ratones anestesiados in vivo que permite una medida directa de la inhibición presináptica en el organismo intacto.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales se mencionan en el siguiente protocolo fue aprobado por las autoridades del estado de Turingia (Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Reg.-Nr. 02-044/12).

1. Los preparativos para el Experimento

  1. La fabricación de electrodos de succión
    1. Tire una micropipeta utilizando un capilar de vidrio de borosilicato de serie con un extractor de micropipeta, por ejemplo, un electrodo de conexión estándar.
    2. Freno el electrodo a la punta diámetro de 0,5-1 mm (un poco más grande que el diámetro de las raíces dorsales) utilizando un archivo de diamante.
    3. Esmalte de calor de la punta para que no se dañe la raíz dorsal cuando es aspirado pulg Una antorcha de laboratorio estándar será adecuada.
    4. Monte el filamento de vidrio en un titular de electrodo conectado a una jeringa a través del cual puede aplicarse presión negativa.
  2. Preparación de las soluciones
    1. Inyección de anestesia para los ratones: Mezclar 0,75 ml de ketamina 10%, 0,24 ml de xilazina 2%º 5 ml de solución salina al 0,9%. 10 l / g de peso corporal (BW) de la solución se inyecta por vía intraperitoneal (IP).
    2. Líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa): Diluir en agua doblemente destilada las siguientes sales (en mM): NaCl 134; KCl 3; KH 2 PO 4 1,25; MgSO 4 • H 2 O 2, NaHCO3 25; CaCl2 2, D- glucosa 10. Añadir H 2 O 2 a una concentración final de 0,003%. Use la solución siempre recién preparado.
  3. Preparación de la configuración de la grabación (Figura 2)
    1. Conecte el amplificador a una interfaz de PC para la digitalización de datos.
    2. Utilice un programa basado en PC o un temporizador analógico para desencadenar un estimulador pulso cuadrado y adquisición de datos en el disco duro del PC.
    3. Utilice silverwires clorada conectados a las pinzas de soldadura de vidrio estándar como para estimulación y registro.
    4. Ensamblar tres manipuladores para la estimulación, la grabación y el electrodo de referencia, respectivamente en torno a un estéreomarco otactic para los ratones, de manera que todos los electrodos tienen acceso a la médula espinal preparado más adelante.
    5. Conecte los tubos y jeringas para los portaelectrodos ser manzana de aplicar presión negativa.

2. Comentarios generales de la experimentación animal y Preparación de los animales para el Procedimiento de grabación

  1. Lleve a cabo todos los experimentos con ratones de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado de Animales institucional y el uso respectivo. Lleve a cabo todas las cirugías y las grabaciones bajo anestesia profunda asegurando que el sufrimiento de los animales se reduce al mínimo.
  2. Anestesiar al animal mediante inyección ip de ketamina / xilazina (125 mg y 8 mg por g de peso corporal de ketamina y xilazina, respectivamente; 10 l / g de peso corporal de la solución preparada tal como se describe más arriba). Si es necesario durante las grabaciones a largo plazo, las inyecciones adicionales se pueden hacer ip o im
    Nota: repetitivas inyecciones im de 0,05-0,1 ml de solución de ketamina / xilazina en los muslos superiores han demostrado ser adecuadopara mantener al animal en la anestesia profunda hasta por 3 horas.
  3. Use ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
  4. Fijar la cabeza del animal en un marco estereotáctico y use una almohadilla eléctrica con sonda rectal y bucle reflejo de controlar la temperatura corporal de los animales durante el experimento. Fijación de la médula espinal en un marco estereotáxico no es necesario.
  5. Antes de empezar la preparación, comprobar la profundidad de la narcosis por reflejo de parpadeo y espasmos entre los dedos de los ratones. Los reflejos deben ser abolidas.
  6. Abra la piel a lo largo de la línea media por encima de la médula espinal desde el nivel superior torácica para reducir las zonas lumbar para obtener un campo operacional clara con un bisturí. No utilice tijeras para hacer incisiones en la piel. Perder con cuidado la piel del tejido subyacente. Durante las etapas posteriores mantienen la herida humedecida en un 0,9% de solución salina.
  7. Corte los tendones y el tejido conectivo en ambos lados de las vértebras de la zona lumbar a los niveles torácicos usando escalpelo y tijeras.
  8. Retire las apófisis espinosas y resto de tejido conectivo que rodea las vértebras usando una pequeña pinza.
  9. Romper con cuidado vértebras con la pinza a partir de los niveles lumbares (L4/L5) bajo un microscopio de disección. Empuja la punta de la pinza en el espacio entre las vértebras y la médula espinal y levantar piezas de hueso aparte. No hagáis daño a la dura y evitar la presión en la médula espinal. Ambos son críticos para el éxito. Mantener la médula espinal humedecido durante todo el procedimiento. Proceder a niveles de mediados de torácicos.

3. La separación de las raíces dorsales y DRP de grabación (Figura 2)

  1. Abra la duramadre con cuidado usando una aguja fina (30 G) con una punta doblada. Utilice LCRa para humedecer de ahora en adelante.
  2. Separar las raíces dorsales medida de lo posible utilizando el medidor y cortar dos raíces adyacentes como distal como sea posible. Vigorosa tirando de las raíces durante la separación afecta el éxito del experimento.
  3. Baje el electrodo de succión hasta el doRSAL raíces. Añadir como mucho LCRa a la médula espinal como sea posible porque el líquido ayuda a succionar en las raíces dorsales.
  4. Suck el extremo cortado de uno de la raíz dorsal en uno pipetas de vidrio mediante la aplicación de presión negativa a través de una jeringa. Si es necesario, mover la raíz dorsal en frente de la abertura de electrodo usando una aguja fina.
  5. Si la raíz dorsal se encuentra seca en el electrodo de succión, añadir un poco de LCRa a su punta mientras chupa con cuidado hasta que la pipeta está suficientemente llena de LCRa.
  6. Después de la raíz dorsal es aspirado, levante la punta del electrodo de la médula espinal. Tenga cuidado de que no "puente de agua" entre la punta de la pipeta y el cable de cortocircuito de la médula del electrodo de registro / estimulación.
  7. Repita los pasos 3.3 a 3.6 para una raíz adyacente ipsilateral.
  8. Coloque el electrodo de referencia lo más cerca posible a las raíces dorsales y mantenerlo humedecido mediante la aplicación de LCRa.
  9. Al establecer la configuración de la grabación, uno de raíz ya está elegido para la estimulación, laotro para la grabación. El incremento progresivo de tensión durante la grabación de la segunda raíz dorsal se realiza en el modo de pinza de corriente. Uno puede notar una desviación hacia abajo corto que es seguido por una larga duración de desviación lenta, hacia arriba que representa el DRP.
  10. Ajuste la tensión de estímulo para supramáxima niveles y grabar varios barridos (por lo menos 20 a 30 barridos / raíz dorsal a 0,1 Hz, filtro de entre 0,3 Hz-3 kHz).
  11. Registre trenes cortos de tres estímulos (100 Hz) para obtener información acerca de la suma que depende del tiempo de la DRP.
  12. Conmutador de grabación y el sitio de estimulación para las grabaciones contralaterales adicionales.
  13. Animales no están destinados a sobrevivir el procedimiento. Sacrificio de animales después de la última grabación mediante decapitación mientras estaba todavía bajo anestesia profunda (ketamina / xilazina, ver más arriba, paso 2.2).

4. Análisis de Datos

  1. Transferencia de datos con el programa de análisis (por ejemplo, Sigma Plot, Igor Pro o MATLAB).
  2. Calcula el promedio huellas from 20-30 barridos.
  3. Tome la amplitud máxima de la desviación de tensión (a partir de la línea de base; DRP pico de amplitud) para su posterior análisis (Figura 3).
  4. Calcular la relación de la amplitud de pico de DRP después de tres pulsos y solo pulso para obtener una medida de la suma dependiente del tiempo de los potenciales posteriores.

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Resultados

Trazas de DRP típicos se muestran en la Figura 3. El artefacto de estimulación prominente es generalmente seguido por una breve desviación hacia abajo. A partir de entonces una larga duración deflexión ascendente lento, en representación de la DRP se distingue claramente. En un subgrupo de las grabaciones, los reflejos de la raíz dorsal son visibles como pequeños picos en la parte superior de la DRP. En los ratones normales de tipo salvaje, los reflejos de la raíz dorsal aparecen más a menudo cuando el ...

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Discusión

Extra-e intracelulares registros electrofisiológicos de la actividad neuronal y sináptica potenciales in vivo son el estado de las técnicas más avanzadas en la investigación de las funciones neuronales del sistema nervioso central y la fisiopatología. Integración espinal es fundamental para la función del motor, por ejemplo, el movimiento de las extremidades y de la percepción sensorial multimodal. Inhibición presináptica es un mecanismo fundamental en este proceso computacional asegurar respuestas ade...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Damos las gracias a Manfred Heckmann útil para los debates durante el establecimiento del método. Además, agradecemos a Claudia Sommer para la asistencia técnica y Frank Schubert para la producción del vídeo de la ayuda. El trabajo fue apoyado por el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF), Alemania, FKZ: 01EO1002 y el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (IZKF) del Hospital de la Universidad de Jena.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de vidrio (diámetro interior 1,16 mm)Science Products (Hofheim, Alemania)GB200F-10Otros tubos de vidrio también podrían ser adecuados
Solución de superfusión (estéril, NaCl al 0,9%)Braun Melsungen AG3570350
Rompun 2% (xilacina)Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Alemania)
Ketamina 10%Medistar GmbH (Ascheberg, Alemania)KETAMIN 10%
30 g Microaguja/ EstérilBraun Melsungen AG4656300
Sales para aCSFSigma-AldrichDiverse
S88 Dual Output SquarePulse Grass Technologies (Warwick, EE. UU.)S88X
SIU5 RF Unidad de aislamiento de transformadorGrass Technologies (Warwick, EE. UU.)SIU-V
InstruTECH LIH 8 + 8HEKA ( Lambrecht, Alemania)LIH 8+8 + Patchmaster software
Amplificador universalNPI (Tamm, Alemania)ELC-03X
Extractor de micropipetasSutter Instruments (Novato, EE. UU.)P-1000
Microscopio de disecciónOlympus (Tokio, Japón)
MicromanipuladorSutter Instruments (Novato, EE. UU.)MPC-200/MPC-325También es posible micromanipuladores mecánicos
Sistema de manta homeotérmicaStoelting (Wood Dale, EE. UU.)50300V
Soporte de electrodo de registro intracelular/extracelularHarvard Apparatus (Holliston, EE. UU.)641227

Referencias

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