Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

הערכה של תפקוד כלי דם בחולים עם מחלת כליות כרונית

Published: June 16, 2014 doi: 10.3791/51478
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Division of Renal Diseases and Hypertension, University of Colorado, Denver, 2Department of Integrative Physiology, University of Colorado, Boulder

Summary

מידת חוסר תפקוד כלי דם ותורמים מנגנונים פיסיולוגיים ניתן להעריך בחולים עם מחלת כליות כרונית על ידי מדידת התרחבות עורק זרוע בתיווך זרימה, מהירות גל הדופק של אב העורקים, וביטוי חלבון תא האנדותל בכלי דם.

Abstract

חולים עם מחלת כליות כרונית (CKD) הגדילו באופן משמעותי את סיכון למחל לב וכלי דם (CVD) בהשוואה לאוכלוסייה הכללית, וזה מוסבר באופן חלקי בלבד על ידי גורמי סיכון CVD מסורתיים. תפקוד לקוי של כלי דם הוא גורם חשוב לא מסורתי סיכון, המתאפיין בחוסר תפקוד אנדותל כלי דם (שהוערך ביותר בכינויו התרחבות לקוי האנדותל תלוי [EDD]) והתקשות של העורקים אלסטיים הגדולים. בעוד טכניקות שונות קיימות כדי להעריך EDD ונוקשות עורק אלסטי גדולים, נפוץ ביותר הם התרחבות זרוע עורק בתיווך זרימה (BA FMD) ומהירות של אב העורקים גל דופק (aPWV), בהתאמה. שני צעדים אלה לא פולשנית של תפקוד לקוי של כלי דם הם מנבאים עצמאיים של אירועי לב וכלי דם בעתיד בחולים עם ובלי מחלת כליות. חולים עם מחלת כליות כרונית להדגים שני FMD BA לקוי, והגדילו את aPWV. בעוד המנגנונים שבאמצעותם המדויקים deve תפקוד כלי דםכורת במחלת הכליות כרונית הם הבינו באופן חלקי, סטרס חמצוני מוגבר וירידה שלאחר מכן בתחמוצת חנקן זמינות ביולוגית (NO) הם תורמים חשובים. שינויים תאיים בסטרס חמצוני יכולים להיות מוערכים על ידי איסוף תאי האנדותל של כלי דם מוריד antecubital ומדידת ביטוי חלבון של סמנים של סטרס חמצוני באמצעות immunofluorescence. אנו מספקים כאן דיון בשיטות אלה כדי למדוד FMD תואר ראשון, aPWV, וביטוי חלבון תא האנדותל בכלי דם.

Introduction

מחלת כליות כרונית (CKD) היא חשש עיקרי בריאות הציבור שהגיע לממדי מגפה, המשפיעים ~ 11.5% מהאוכלוסייה בארצות הברית לבדה 1. הסיכון למוות לב וכלי דם או אירוע לב וכלי דם בחולים עם מחלת כליות כרונית הוא גדל באופן משמעותי בהשוואה לאוכלוסייה הכללית 2-4. למרות שמטופלים עם מחלת כליות כרונית תערוכת שכיחות גבוהה של גורמי סיכון הקרדיווסקולריים מסורתיים, זה רק מסביר חלק משכיחותם המוגבר למחלות לב וכלי דם (CVD) 5. תפקוד לקוי של כלי דם הוא גורם חשוב לא מסורתי סיכון למחל לב זוכה להכרה מוגברת בתחום נפרולוגיה 6-9.

בעוד רבים שינויים צפויים לתרום להתפתחות של בעיות בתפקוד עורקים, בקרב אלה של הדאגה הגדולה ביותר הם הפיתוח של תפקוד האנדותל בכלי דם, שהוערך ביותר בכינויו התרחבות לקוי האנדותל תלוי (EDD), והתקשות של laעורקים אלסטיים rge 10. טכניקות שונות קיימות כדי להעריך EDD ונוקשות עורק אלסטי גדולים, אך הנפוץ ביותר הן התרחבות בתיווך זרימת עורק זרוע FMD תואר ראשון ומהירות של אב העורקים גל דופק (aPWV), בהתאמה. טכניקה הנפוצה נוספת כדי להעריך EDD מודדת את זרימת דם בזרוע בתגובה לסוכנים תרופתיים כגון אצטילכולין באמצעות plethysmography חסימה ורידית 11,12. עם זאת, במתודולוגיה זו דורשת צנתור של עורק הזרוע, שהוא יותר פולשנית מאשר FMD התואר הראשון ועשויים להיות התווית בחולים עם מחלת כליות כרונית. טכניקה חלופית כדי להעריך את קשיחות עורקים היא למדוד את העמידה המקומית עורקים (ההופכי של נוקשות) של העורק הראשי, אם כי זה לא כמו בשימוש או תוקף עם נקודות קצה קליניות כaPWV 13 באופן נרחב.

חולים עם מחלת כליות כרונית להדגים שני FMD BA לקוי 14-16 והגדיל את מהירות גל דופק אב העורקים APWV 13,17,18, עוד קודם לצורך בדיאליזה. חשוב לציין מנקודת מבט קלינית, שניהם של אמצעים אלה לא פולשנית של תפקוד לקוי של כלי דם הם מנבאים בלתי תלויים לאירועי לב וכלי דם בעתיד ובתמותה הן בחולים עם מחלת כליות כרונית 19-21, כמו גם באוכלוסיות אחרות 22-26. ניתן ליישם את הטכניקות הללו ללימוד אוכלוסיות שונות בסיכון של CVD, לרבות חולים עם מחלת כליות כרונית.

המנגנונים המדויקים שבו תפקוד לקוי של עורקים מתפתח במחלת הכליות כרונית הם הבינו באופן חלקי; עם זאת, זמינות ביולוגית תחמוצת חנקן מופחתת (NO) הוא תורם קריטי 27-30 ומנגנון משותף של שני EDD לקוי וקשיחות העורק מוגבר 10,31. במחלת הכליות כרונית, סטרס חמצוני מוגבר ותורם לירידה בזמינות הביולוגית NO 32-34. סטרס חמצונים מוגדר כזמינות ביולוגית מוגזמת של מיני חמצן תגובתי (ROS) ביחס להגנה נוגדת חמצון. גירויים פיסיולוגיים, including איתות דלקתית, לקדם מערכות אנזימי חמצון כדי לייצר ROS, כולל אניון סופראוקסיד (O 2 ● -) (לדוגמא, אנזים מונואמין NADPH חמצון). 35. ייצור של סופראוקסיד סופו של דבר מוביל למפחית את הזמינות הביולוגית של תחמוצת חנקן (NO).

פגומה אין זמינות ביולוגית עשויה בתורו תורמת להתפתחות של מחלת כליות כרונית, כמו בעיות בתפקוד האנדותל הוא מנבא בלתי תלוי של מחלת כליות כרונית אירוע 36. זה עולה בקנה אחד עם הנתונים של בעלי החיים מצביעים על כך שעיכוב אינס גורם יתר לחץ דם (מערכתי וגלומרולרי), איסכמיה גלומרולרי, טרשת פקעיות כליה, ולפציעתם tubulo-ביניים 37. ואכן, אין זמינות ביולוגית מופחת מופיעה הכרחית להתפתחות וההתקדמות של מחלת כליות ניסיונית המחקה מחלות אנושיות, מה שמרמז תפקיד מפתח לתפקוד האנדותל בCKD אדם 38,39.

סמנים של סטרס חמצוני כלי דם ניתן להעריך בvascular תאי האנדותל שנאספו מנושאי מחקר אנושיים, תוך שימוש בטכניקה שפותחה במקור על ידי קולומבו et al. 40 והותאמה אטמים ואח' 41-43. באמצעות 2 J-חוטים סטריליים, תאים שנאספו מוריד antecubital, התאושש, קבוע, ומאוחר יותר זוהה בודאות כתאי האנדותל ונותח לביטוי של חלבונים של עניין באמצעות immunofluorescence.

אנו מספקים כאן דיון של מתודולוגיה זו, שניתן להשתמש לתואר ראשון FMD מדד); ב) למדוד aPWV; ג) למדוד ביטוי חלבון תא האנדותל בכלי דם של סמנים של סטרס חמצונים. הדגש הוא על חולים עם מחלת כליות כרונית, שאינו דורש דיאליזה כרונית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר הקווים המנחים של המועצה לביקורת מרובה המוסדית קולורדו (COMIRB).

1. הכנה לבחינות למושב

  1. משתתפים צריכים לעקוב הגבלות אלו למדידות מדויקות ביותר: 12 שעה מהר ממזון וקפאין, 12 איפוק שעה מפעילות גופנית, 12 איפוק שעות מעישון, אם> 4 איפוק מתרופות רלוונטי, זמן מחצית החיים במידת האפשר (לא יכול להיות ריאלי ב אוכלוסייה כגון חולי CKD), ונשים לפני גיל המעבר צריכה להיבדק בימים 1-7 של המחזור החודשי כדי למזער את השפעות הורמונליות.
  2. הכן 500 מיליליטר של חיץ הניתוק על ידי הוספת 2 מיליליטר של 0.5 M חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA), 0.05 גרם של הפרין (180 יחידות USP / מ"ג), ו2.5 גרם של אלבומין בסרום שור ל476.8 מיליליטר של בופר פוספט (PBS) בשעה ה-pH של 7.4. זה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים.
  3. הפעל אולטרסאונד, מחשב, והמודינמית לא פולשניתתחנת עבודה (NIHem; ציוד נוקשות עורקים). לחבר את כבלי פלט אולטרסאונד לתיבת הדק R-גל המחשב.

2. איסוף ועיבוד של תאי אנדותל כלי הדם

  1. אחות או רופא מיומנים מבצעת את האיסוף (שלבים 2.2-2.5, 2.7) וחוקר אוסף ומעבד את החוטים (שלבים 2.6, 2.8-2.19)
  2. הכן את אתר antecubital עם אקטואלי חיטוי, להחיל חוסם עורק, אתר וריד, וcannulate עם קטטר G 18. הנח מתאם heplock בסוף הרביעי.
  3. לשים על כפפות סטריליות ולשים וילונות fenestrated סטרילי על האתר.
  4. מניחים 2 J-חוטים בווילאות. משוך את הקשת של "J" ליישר את צורת "J" משני החוטים.
  5. Uncap heplock ולהאכיל את J-חוט לתוך וריד כ 8 סנטימטר. לדחוף קדימה ואחורה מספר פעמים לפני הסרת החוט. הימנע דם ברוטו על החוט.
  6. השתמש במספרי תיל לחיתוך החוטים, כדי שיתאימוצינור חרוטי 50 מיליליטר המכיל ~ 30 מיליליטר של חיץ דיסוציאציה
  7. חזור על שלב 2.5 לחוט שני.
  8. חזור על שלב 2.6 לחוט שני. להחזיר צינור למעבדה רטובה.
  9. שלב את החוטים עם זוג המלקחיים ולהחזיק את החוטים בתוך הצינור, אך מעל לפתרון. עבור 10 דקות, השתמש pipetter ממונע כדי לאסוף את חיץ הניתוק שוב ושוב מצינור חרוטי 50 מיליליטר ולשחרר אותו, כך שהוא רץ במורד אורך החוטים כדי לשטוף ולרטוט חוטים, ואז להתנער מנוזלים עודפים מחוטים לתוך צינור.
  10. צנטריפוגה במשך 7 דקות ב XG 400 ו4 ° C.
  11. הכן את פתרון פורמלדהיד בצינור נייר מכוסה על ידי שילוב של 100 פתרון מיליליטר פורמלין + 900 מיליליטר PBS.
  12. לאט לאט להסיר את הצינור מצנטריפוגות, הפעל את משאבת הוואקום, למקם את קצה פיפטה בסוף צינור יניקה ולהשאיר ~ 400 מיליליטר בצינור, שאיבת אבק משאר מבלי להפריע גלולה.
  13. מכסה בנייר כסף ופתרון פורמלדהיד 1 מיליליטר פיפטה לתוךהצינור כדי לתקן את המדגם. אל resuspend. דגירה של 10 דקות בטמפרטורת חדר.
  14. הכן 8 שקופיות על ידי תיוג בנושא ומידע ביקור הלימוד וציור סגלגל בכל שקופית עם עט פאפ.
  15. הוסף 15 מיליליטר PBS, resuspend, ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב XG 400 ו4 ° C.
  16. חזור על שלב 2.15, להוסיף 12 מיליליטר PBS, resuspend, ו צנטריפוגות במשך 6 דקות ב XG 400 ו4 ° C.
  17. לאט לאט להסיר את הצינור מצנטריפוגות, הפעל את משאבת הוואקום, למקם את קצה פיפטה בסוף צינור יניקה ולהשאיר ~ 2 מיליליטר בצינור, שאיבת אבק משאר מבלי להפריע גלולה.
  18. Resuspend ופיפטה אופן שווה על פני 8 השקופיות באזורים הסגלגלים.
  19. מקום בחממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 שעות ולאחר מכן לאחסן ב-80 ° C עד מוכן לניתוח (דגימות תהיה בסדר במשך שנים רבות).

3. הערכת FMD התואר הראשון וaPWV

  1. יש שינוי נושא המחקר לתוך מכנסיים קצרים חד פעמיות ויש לי שעותim / פרקדן השקר שלה בחדר שקט ואפלולי, אקלים מבוקר.
  2. הצב את המספר המתאים של א.ק.ג. לאולטרסאונד הספציפי ומכשיר קשיות עורקים (הליך זה משתמש לא פולשנית המודינמית Workstation [NIHem] כדי למדוד את הנוקשות עורקים, אשר דורשת 4 אלקטרודות), ושרוול למדידת לחץ דם על נושא.
  3. אחרי 20 דקות, מתחיל קריאות לחץ דם. לבצע לפחות 3, וחזור עד שמדידות הן בתוך 5 מ"מ כספית, מנוחה 2 דקות בין כל קריאה.
  4. בגין tonometry ידי מישוש את דופק עורק זרוע וצבת tonometer להקליט גל זרוע באמצעות התוכנה.
  5. חזור לעורקי רדיאלי, הירך וצוואר.
  6. למדוד את המרחק לכל אחד מהאתרים הללו מחריץ supersternal באמצעות סרט מדידה (זרוע, רדיאלי ותרדמה) ושליט מותאם אישית / קליפר (הירך).
  7. חישוב התרדמה-זרוע, עורק התרדמה-רדיאלי, ותרדמה-הירך (aPWV) באמצעות התוכנה.
  8. מקוםשרוול דם זרוע לחץ דיסטלי רק לתהליך olecranon ולהקליט לפחות 10 מחזורי לב של תמונות בסיסיות עורק זרוע אולטרסאונד ומדידות זרימת דם מהירות, עם תוכנת כלי דם מוגדרת לעורר מצב. זרוע מכאנית יכולה לשמש כדי לייצב את הבדיקה אולטרסאונד אם תרצה בכך.
  9. לנפח שרוול למדידת לחץ דם בזרוע 250 מ"מ כספית ולהתחיל טיימר. הדרך את המשתתף להישאר מאוד עדיין.
  10. בגין מהירויות הקלטה עם סט תוכנות כלי דם כדי לגרום למצב שבו שעון העצר קורא 4:45. טריגר לשחרר את השרוול בשעה 5:00 ולשנות את אולטרסאונד כדי להקליט B-מצב תמונות (קוטר) כאשר השעון קורא 05:10.
  11. להמשיך את ההקלטה עד שהשעון קורא 7:00.
  12. שיא לפחות 10 מחזורי לב של תמונות אולטרסאונד עורק זרוע בסיסיות עם תוכנת כלי דם מוגדרת לעורר מצב.
  13. קח את לחץ הדם של הנבדק. אם לחץ דם סיסטולי> 100 מ"מ כספית, הנח 0.4 מ"ג ניטרוגליצרין sublingual תחת הנושא &# 39; של לשון ולהתחיל טיימר, אלא אם לחולה יש הוראה נגד אחרת.
  14. להתחיל בהקלטת B-מצב (תמונות קוטר) כאשר השעון קורא 03:00 עם תוכנת כלי הדם מוגדרת לעורר מצב.
  15. לעצור את ההקלטה כאשר השעון קורא 8:00.
  16. לפקח על לחץ דם עד שהוא חוזר לנקודת התחלה

4. הכנת תאים האנושי טבור הווריד האנדותל (HUVEC) בקרת שקופיות

  1. לגדול HUVECs למעבר 5-6 ו ~ confluency 80%.
  2. Trypsinize עם 3 מיליליטר של טריפסין או כל מה שנדרש למנה / הבקבוק.
  3. לנטרל טריפסין באמצעות נפח שווה של תמיסת נטרול טריפסין.
  4. צנטריפוגה ב XG 200 ל~ 5 דקות ולהסיר טריפסין ופתרון נטרול על ידי ואקום.
  5. Resuspend ב~ 10 מיליליטר PBS לשטוף.
  6. צנטריפוגה ב XG 200 ~ 5 דקות. הסר PBS.
  7. הסר PBS ולתקן בשנת 1800 PBS + 200 פורמלדהיד μl μl.
  8. Resuspend ב PBS (~ 10 מיליליטר).
  9. צנטריפוגה ב XG 200 ~5 דקות. הסר PBS, resuspend בנפח מתאים להוסיף ~ 200 μl לכל שקופית.
  10. שקופיות חנות ב -80 ° C עד מוכן לניתוח (דגימות תהיה בסדר במשך שנים רבות).

5. צביעת תאי אנדותל כלי הדם

  1. קח שקופיות מתוך -80 מקפיא מעלות צלזיוס ולחכות 5 דקות בטמפרטורת חדר (בהליך זה הוא לאפיית 10 שקופיות, כולל שקופית אחת שליטת HUVEC).
  2. לנגב את עודפי מים עם משימה עדינה לנגב (לא לגעת במרכז השקופית).
  3. Re-מימה השקופיות על ידי הוספת PBS שינה לכל שקופית ולהשאיר אותם ל10 דקות.
  4. בעוד השקופיות עומדות, להכין 5% בסרום חמור ופתרונות אחרים.
    1. הכן 5% בסרום חמור על ידי הוספת 300 μl של סרום חמור ל5,700 μl של PBS שינו (לpH של 7.4) לתקופה של עד 10 שקופיות (להגדיל סכום זה ליותר).
    2. לדלל את הנוגדן הראשוני של העניין ב1,000 μl של סרום 5%. לדוגמא, nitrotyrosine וNADPHמונואמין (1:300 ו1:1,500) יכולים לשמש כסמנים של סטרס חמצונים.
    3. הכן AF568 המשני על ידי דילול 5 μl של AF568 ל -1,500 μll של סרום 5%.
    4. הכן VE cadherin על ידי דילול 2 μl של VE cadherin ל1,000 μl של סרום 5%.
    5. הכן AF488 על ידי דילול 5 μl של VE cadherin ל1,000 μl של סרום 5%.
    6. שמור AF568, VE cadherin וAF488 תחת נייר כסף בתהליך כולו ולאחר מכן למקם על נדנדה ב4 ° C מקרר בעת הכנת שקופיות.
  5. לאחר 10 דקות של התייבשות, מגלשות יבשות עם משימה עדינה לנגב.
  6. הוסף 5% בסרום חמור ל60 דקות ומניח חתיכת סרט פרפין פלסטיק מעל האזור המוקף בעיגול כדי להבטיח כיסוי של כימי מלא.
  7. מחק את סרט פרפין פלסטיק ומגלשות יבשות עם משימה עדינה לנגב. אין לשטוף. הוספת נוגדן ראשוני ל60 דקות ומניחים חתיכת סרט פרפין פלסטיק מעל האזור המוקף בעיגול כדי להבטיחכיסוי מלא של החומר הכימי.
  8. מחק את סרט פרפין פלסטיק, לשטוף עם PBS שינו מבקבוק להשפריץ ולספוג בעמודות שקופיות עבור 5 דקות. בעוד שקופיות שריה, להעביר אותם לחדר חשוך. לעבוד בחושך במשך כל השלבים הנותרים.
  9. מגלשות יבשים עם Kimwipes, להוסיף AF568 (נוגדנים משני) ל45 דקות ומניחה חתיכת סרט פרפין פלסטיק מעל האזור המוקף בעיגול כדי להבטיח כיסוי של כימי מלא. כסה מהאור.
  10. מחק את סרט פרפין פלסטיק במכל הפסולת הביולוגית המסוכן. יש לשטוף עם PBS שינו מבקבוק שפריץ, ולאחר מכן לטבול בטורים למשך 5 דקות.
  11. מגלשות יבשים עם Kimwipes, לאחר מכן להוסיף VE cadherin ל60 דקות ומניחים חתיכת סרט פרפין פלסטיק מעל האזור המוקף בעיגול כדי להבטיח כיסוי של כימי מלא. כסה מהאור.
  12. מחק את סרט פרפין פלסטיק במכל הפסולת הביולוגית המסוכן. יש לשטוף עם PBS שינו מבקבוק שפריץ, ולאחר מכן לטבול בטורים למשך 5 דקות.
  13. מגלשות יבשים עםמשימה עדינה לנגב, להוסיף AF488 ל30 דקות ומניח חתיכת סרט פרפין פלסטיק מעל האזור המוקף בעיגול כדי להבטיח כיסוי של כימי מלא. כסה מהאור.
  14. מחק את סרט פרפין פלסטיק במכל הפסולת הביולוגית המסוכן. יש לשטוף עם PBS שינו מבקבוק שפריץ, ולאחר מכן לטבול בטורים למשך 5 דקות.
  15. מגלשות יבשים עם משימה עדינה לנגב ולאפשר שקופיות להתייבש במשך 20 דקות. כסה מהאור.
  16. הוסף טיפה אחת בלבד של fluoroshield הרכבה בינונית עם 4 ', hydrochloride 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לכל שקופית ולכסות כל אחת עם להחליק את מכסה.
  17. הנח שקופיות ב4 ° C מקרר מכוסים בנייר כסף. הדמיה צריכה להסתיים בתוך 48 שעה.

6. הדמיה וניתוח של תאי אנדותל כלי הדם

  1. הכן מיקרוסקופ הדמיה תאי האנדותל מוכתמים על פי מפרט של המיקרוסקופ הספציפי. טכנאי עיוור אחת צריך לנתח כל חלבון מסוים לעטלףch של תאים.
  2. סרוק את השקופיות באופן שיטתי. לזהות תאי אנדותל ידי מכתים חיובי עבור VE cadherin ולאשר יושרה גרעינית על ידי מכתים חיובי עבור DAPI.
  3. תמונה 30 תאים לכל שקופית לניתוח מאוחר יותר. חזור על פעולה עבור כל שקופית בתצווי המוכתם, כולל HUVEC.
  4. נתח את עוצמת הצביעה לנוגדן הראשוני של עניין באמצעות תוכנה איכותית.
  5. כדי למזער את ההשפעה של בלבול האפשרית של הבדלים בעוצמת צביעה בין פגישות צביעה שונות, ערכי דו"ח כיחס בין ביטוי חלבון בתאי האנדותל שנאספו לאותו ביטוי החלבון בHUVEC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FMD התואר הראשון הוא לכמת כשינוי השיא בקוטר של עורק הזרוע הבא hyperemia תגובתי. לפיכך, בקוטר במנוחה הוא בהשוואה לקוטר שלאחר תום תקופת חסימת שרוול למדידת לחץ דם 5 דקות (איור 1). לוח מראה תמונת אולטרסאונד נציג של עורק הזרוע, והלוח ב 'מציג גרף של שינוי R-הגל מגודרת בקוטר משחרור שרוול ל2 דקות שלאחר מכן, כפי שהתקבל באמצעות תוכנה זמינה באופן מסחרי. כשינוי הוא לעתים קרובות די מינימאלי (באיור 1 השינוי הוא 4.8%), הבדלים קטנים במדידה יכולים להשפיע באופן משמעותי על תוצאות. שימוש בתוכנת זיהוי קצה אוטומטי זמינה מסחרי מומלץ ביותר כדי למזער את ההטיה וטעייה פוטנציאלית במדידה 44,45. כתמריץ להתרחבות במהלך hyperemia תגובתי עשוי להיות שונה בין קבוצות או תנאים מושווים, שיעור גזירה צריך להיות מחושב באמצעות זרימת דם דופלרמהירויות, וFMD תואר ראשון צריכים להיות מותאמים להבדלים כשישימים 46,47.

aPWV מחושב עם קלט מינימאלי למפעיל על ידי רוב המערכות זמינות מסחרי, ובכלל זה NIHem השתמש במחקר שלנו. R-הגל של א.ק.ג. הוא לעומת "רגל" של צורת הגל באתר נתון והפרש הזמן מחושב (איור 2) לעורק הראשי (לוח א ') ועורק הירך (לוח ב'). מדידות המרחק משמשות בשילוב עם הבדלי הזמן לחישוב מהירות. aPWV מתייחס למהירות שבין העורק הראשי לעורק הירך (כלומר. לאורך אב העורקים).

ניתוח Immunofluorescent של תאי האנדותל בכלי דם יכול לספק ראיות סלולריות של הרמה סטרס חמצונים. כדי להסביר את הבדלים בעוצמת צביעה בין פגישות מכתים, רמת הקרינה של חלבון ניתנו לכל נושא הפרט (הר"י נציג GES מוצג באיור 3 לוח א ') הוא בהשוואה לקרינה של שקופית שליטת HUVEC (תמונות נציג שמוצגים באיור 3 לוח ב'). לפיכך, ניתן להשוות הבדלים בביטוי חלבון או בין קבוצות או על פני תנאים (לדוגמא, במהלך מחקר התערבות).

איור 1
קוטר עורק איור 1. נציג זרוע בסיסית שהושג במהלך ההערכה של התרחבות עורק זרוע בתיווך זרימה (BA FMD). א) בחולה עם מחלת כליות כרונית (CKD). ב ') שינוי R-גל מגודרת בקוטר משחרור שרוול ל2 דקות הבאות מוצג בצורה גרפית, כפי שהתקבל באמצעות תוכנה זמינה באופן מסחרי.target = "_blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. נציג תוצאות תדפיס מהערכת aPWV אצל חולה עם מחלת כליות כרונית. א) עיכוב זמן מR-הגל של א.ק.ג. לכף הרגל של עורק הצוואר, B) עיכוב זמן מR-הגל של א.ק.ג. למרגלות עורק הירך (tfoot), ועליהן את צורת גל התרדמה. שני הלוחות גם להראות את המרחקים שהוזנו מחריץ suprasternal לאתרים המתאימים (מיוצגים על ידי אות D; בסנטימטרים). ערך aPWV מחושב מוצג בלוח ב '(המיוצג על ידי PWV האותיות; בס"מ / השני). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. </ P>

איור 3
איור 3. נציג תמונות של ביטוי חלבון. א) DAPI (יושרה גרעינית; כחול), VE cadherin (זיהוי תא האנדותל חיובי; ירוקה) מונואמין NADPH אנזים חמצון (החלבון של עניין; אדומה) מהתאים שנאספו מחולה עם מחלת כליות כרונית ב ') ולתא האנדותל וריד טבור אנושי שקופית שליטה (HUVEC).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

קבלת תוצאות מדויקות לFMD התואר הראשון וaPWV דורשת רכישת תמונות אולטרסאונד באיכות גבוהה וצורות גל לחץ, בהתאמה. מרכזי לכך הוא הכשרה מתאימה והמשיכה ושימוש בכל טכניקה על ידי המפעיל 44. בנוסף, זה קריטי כדי לשלוט על כמה שמשתנים חיצוניים שעשויים להשפיע על התוצאות ככל האפשר על ידי תקנון מושב הבדיקות (למשל, מהירה לפני 12 שעות, חדר מבוקר אקלים, וכו ') 44,45. כאמור, השימוש בתוכנת R-גל מסחרי מגודרת רכישה ותוכנת קצה איתור מומלץ ביותר כדי למזער את ההטיה וטעייה פוטנציאלית במדידה 44,45. כאשר התואר הראשון FMD הנו פגום, זה יכול להיות גם בשל לקויי אין שחרור מהאנדותל או עקב היענות לקויה של שרירי חלק בכלי הדם לשוחרר NO. ניטרוגליצרין sublingual ניתן לשליטה לתגובה של החלקהשכבת שריר תא לתורם תחמוצת חנקן חיצוני, על מנת להגיע למסקנה כי ירידת ערך כלשהיא FMD התואר הראשון הוא ספציפית ליכולת של האנדותל של כלי הדם כדי לייצר תחמוצת חנקן 44,45.

כמו המדידה היא מהירות, מדידות מדויקות של שניהם מרחק וזמן הן קריטיות. הפרוטוקול שתארנו מתבסס על המתודולוגיה במחקר Framingham Heart 24. שימוש במחוגה העלתה ולא סרט מדידה משפרת את דיוק מדידה של מרחק מחריץ suprasternal לעורק הירך על ידי לקיחת נתיב ישיר ולא מדידה פוטנציאלית על ההשמנה בטנית. "רגל" ברורה של צורת גל נקי היא הכרחית לחישוב של פרש השעות מR-הגל של א.ק.ג. לדחף באתר המדידה (ראה איור 2).

בעוד טכניקות חלופיות זמינות כדי להעריך גם את תפקוד האנדותל וarנוקשות terial, FMD התואר הראשון וaPWV שניהם הנפוצות במחקר קליני כי הם לא פולשנית ומבוססים היטב כתוצאות ביניים. בנוסף לכך, הם תוקף גם על פני אוכלוסיות שונות ונמצאים באופן עצמאי ניבוי של אירועי לב וכלי דם ותמותה 19-26. לכן, הם יכולים לשמש כנקודתי קצה פונדקאיות במחקרים קליניים להערכת היעילות להתערבות כדי להפחית את הסיכון למחל לב באוכלוסייה נתון, כגון חולים עם מחלת כליות כרונית. שינוי של שיטות אלו אינם נדרשים ללמוד באופן ספציפי בחולים עם מחלת כליות כרונית, בהשוואה לאוכלוסיות אחרות בסיכון של CVD.

עם זאת, יש מגבלות חשובות לשני FMD תואר ראשון וaPWV שדיון ראוי. FMD התואר הראשון מעריך את תפקוד האנדותל בכלי דם של עורק גדול צינור (עורק הזרוע), ובכך אינו מספק מדד של תפקוד אנדותל כלי הדם. טכניקה נפרדת באמצעות plethysm חסימה ורידיתography מתאים יותר כדי להעריך את האפשרות השנייה. עם זאת, במתודולוגיה זו דורשת צנתור של עורק הזרוע, שהוא יותר פולשנית מאשר FMD התואר הראשון ועשויים להיות התווית בחולים עם מחלת כליות כרונית. בנוסף, מדידה של FMD תואר ראשון דורשת הכשרה ארוכה וספציפית על מנת לבצע היטב. aPWV מספק מדד של קשיחות עורק אלסטי הגדולה, שעשויה להיות שונים מנוקשות מקומיות עורקים (כגון העורק הראשי). טכניקה חלופית כדי להעריך את קשיחות עורקים היא למדוד את העמידה המקומית עורקים (ההופכי של נוקשות) של העורק הראשי, אם כי זה לא כמו בשימוש או תוקף עם נקודות קצה קליניות כaPWV 13 באופן נרחב. בנוסף, התרומה של NO כגורם מכריע בנוקשות אב העורקים עשויה להשתנות ממיטת כלי דם 48. אחרון, יש בלבול פוטנציאלי לפרשנות של שני FMD תואר ראשון וaPWV שצריך להימדד וסטטיסטי מותאמים לצורך, כוללים ד בסיסיiameter ושיעור גזירה לFMD התואר הראשון 45, ואת קצב לב ואת לחץ דם לaPWV 49.

שיקול חשוב באוסף של תאי האנדותל בכלי דם הוא מזעור דם על J-החוטים ולאחר מכן בשקופיות, באופן שניתן לזהות את תאי האנדותל עם תאי דם אדומים מינימאליים החופפים בתמונות. זו יכולה להיות מושגת עם הכשרה לטכניקה נכונה, כמו גם שטיפה נאותה כשמתאוששת התאים. כאשר מנתחים את השקופיות, זה קריטי, כי הקרינה ניתן לכמת באופן אובייקטיבי והתמונות הן ברורות, ללא רקע או חפיפה הרבה עם תאים אחרים. אופטימיזציה של דילולים מכתימים וטכניקה לניתוח מיקרוסקופית לפני הניתוח של דגימות מחקר הן שלבים עיקריים. ראוי לציין, תשואת התא של טכניקה זו היא ~ 600 תאי האנדותל של כלי דם לאיסוף, כמות מספקת של mRNA הכולל היא זמינה למדוד ביטוי גנים, וכך להגביל את הבדיקה שלנו לimmunoflמכתים uorescent של חלבונים של עניין.

בנוסף לטכניקות שהוצגו להערכת סטרס חמצוני כלי דם, במחזור או סמני שתן יכול לשמש כדי להעריך סטרס חמצונים 12,50. עם זאת, הם עשויים להיות פחות משקפים את הרמה של סטרס חמצונים הספציפיים לרמה של האנדותל של כלי הדם. שימוש בסמנים אלה בשילוב עם הטכניקות שהוצגו עשויה לספק האינדיקציה הטובה ביותר של הרמה הכללית של סטרס חמצונים.

סיפקנו סקירה של שיטות שניתן להשתמש בהם כדי למדוד FMD תואר ראשון, aPWV, וביטוי חלבון תא האנדותל בכלי דם. טכניקות אלו מתאימה לא רק לחולים עם מחלת כליות כרונית, אלא גם באוכלוסיות אחרות בסיכון מוגבר למחלות לב וכלי דם. ביחד, הם מספקים תובנה תפקוד אנדותל כלי דם, נוקשות עורק אלסטי גדולות, ותורמים מנגנונים פיסיולוגיים, כוללים סטרס חמצונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מודים נינה Bispham לקבלת הסיוע הטכני שלה. עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקאי (12POST11920023), ו-NIH (K23DK088833, K23DK087859).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
J-wire St. Jude 404584 2 per collection
Disposable shorts (MediShorts) Quick Medical 4507
Non-invasive hemodynamic workstation (NIHem) Cardiovascualr Engineering N/A Includes custom ruler.  An alternate system is the Sphygmocor
Ultrasound G.E. Model: Vivid7 Dimension We use a G.E., but there are many companies and models
Vascular software (Vascular Imager)  Medical Imaging Applications N/A
R-wave trigger box Medical Imaging Applications N/A custom made
Rapid Cuff Inflation System Hokanson Model: Hokanson E20
Forearm blood pressure cuff Hokanson N/A custom cuff with 6.5 x 34 cm bladder 
HUVECs Invitrogren C-015-5C
Donkey serum Jackson 017-000-121
Pap pen Research Products International 195505
VE Cadherin Abcam ab33168
AF568 Life Technologies A11011 depends on specifications of microscpe 
AF488 Life Technologies A11034 depends on specifications of microscpe 
Nitrotyrosine antibody  Abcam ab7048
NADPH oxidase antibody Upstate 07-001
DAPI  Vector H-1200
Delicate task wipe (Kimwipe)  Fisher Scientific 06-666-A
Plastic paraffin film (parafilm)  Fisher Scientific 13-374-10
Confocal microscope  Olympus Model: FV1000 FCS/RICS many options exist 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levey, A. S., et al. A new equation to estimate glomerular filtration rate. Ann Intern Med. 150, 604-612 (2009).
  2. Foley, R. N., Parfrey, P. S., Sarnak, M. J. Epidemiology of cardiovascular disease in chronic renal disease. J Am Soc Nephrol. 9, (1998).
  3. Parfrey, P. S., Harnett, J. D. Cardiac disease in chronic uremia. Pathophysiology and clinical epidemiology. Asaio J. 40, 121-129 (1994).
  4. Schiffrin, E. L., Lipman, M. L., Mann, J. F. Chronic kidney disease: effects on the cardiovascular system. Circulation. 116, 85-97 (2007).
  5. Sarnak, M. J., et al. Cardiovascular disease risk factors in chronic renal insufficiency. Clin Nephrol. 57, 327-335 (2002).
  6. Kendrick, J., Chonchol, M. B. Nontraditional risk factors for cardiovascular disease in patients with chronic kidney disease. Nat Clin Pract Nephrol. 4, 672-681 (2008).
  7. Bellasi, A., Ferramosca, E., Ratti, C. Arterial stiffness in chronic kidney disease: the usefulness of a marker of vascular damage. Int J Nephrol. 2011, (2011).
  8. vander Zee, S., Baber, U., Elmariah, S., Winston, J., Fuster, V. Cardiovascular risk factors in patients with chronic kidney disease. Nat Rev Cardiol. 6, 580-589 (2009).
  9. Malyszko, J. Mechanism of endothelial dysfunction in chronic kidney disease. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 411, 1412-1420 (2010).
  10. Lakatta, E. G., Levy, D. Arterial and cardiac aging: major shareholders in cardiovascular disease enterprises: Part I: aging arteries: a "set up" for vascular disease. Circulation. 107, 139-146 (2003).
  11. Seals, D. R., Jablonski, K. L., Donato, A. J. Aging and vascular endothelial function in humans. Clin Sci (Lond). 120, 357-375 (2011).
  12. Jablonski, K. L., et al. Dietary sodium restriction reverses vascular endothelial dysfunction in middle-aged/older adults with moderately elevated systolic blood pressure. J Am Coll Cardiol. 61, 335-343 (2013).
  13. Briet, M., et al. Arterial stiffness and enlargement in mild-to-moderate chronic kidney disease. Kidney Int. 69, 350-357 (2006).
  14. Thambyrajah, J., et al. Abnormalities of endothelial function in patients with predialysis renal failure. Heart. 83, 205-209 (2000).
  15. Ghiadoni, L., et al. Effect of acute blood pressure reduction on endothelial function in the brachial artery of patients with essential hypertension. J Hypertens. 19, 547-551 (2001).
  16. Yilmaz, M. I., et al. The determinants of endothelial dysfunction in CKD: oxidative stress and asymmetric dimethylarginine. Am J Kidney Dis. 47, 42-50 (2006).
  17. Wang, M. C., Tsai, W. C., Chen, J. Y., Huang, J. J. Stepwise increase in arterial stiffness corresponding with the stages of chronic kidney disease. Am J Kidney Dis. 45, 494-501 (2005).
  18. Shinohara, K., et al. Arterial stiffness in predialysis patients with uremia. Kidney Int. 65, 936-943 (2004).
  19. Karras, A., et al. Large artery stiffening and remodeling are independently associated with all-cause mortality and cardiovascular events in chronic kidney disease. Hypertension. 60, 1451-1457 (2012).
  20. Pannier, B., Guerin, A. P., Marchais, S. J., Safar, M. E., London, G. M. Stiffness of capacitive and conduit arteries: prognostic significance for end-stage renal disease patients. Hypertension. 45, 592-596 (2005).
  21. Yilmaz, M. I., et al. Vascular health, systemic inflammation and progressive reduction in kidney function; clinical determinants and impact on cardiovascular outcomes. Neprhol Dial Transplant. 26, 3537-3543 (2011).
  22. Sutton-Tyrrell, K., et al. Elevated aortic pulse wave velocity, a marker of arterial stiffness, predicts cardiovascular events in well-functioning older adults. Circulation. 111, 3384-3390 (2005).
  23. Tanaka, H., DeSouza, C. A., Seals, D. R. Absence of age-related increase in central arterial stiffness in physically active women. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 18, 127-132 (1998).
  24. Mitchell, G. F., et al. Arterial stiffness and cardiovascular events: the Framingham Heart Study. Circulation. 121, 505-511 (2010).
  25. Yeboah, J., Crouse, J. R., Hsu, F. C., Burke, G. L., Herrington, D. M. Brachial flow-mediated dilation predicts incident cardiovascular events in older adults: the Cardiovascular Health Study. Circulation. 115, 2390-2397 (2007).
  26. Shechter, M., et al. Long-term association of brachial artery flow-mediated vasodilation and cardiovascular events in middle-aged subjects with no apparent heart disease. Int J Cardiol. 134, 52-58 (2009).
  27. Baylis, C. Nitric oxide deficiency in chronic kidney disease. Am J Physiol Renal Physiol. 294, (2008).
  28. Wever, R., et al. Nitric oxide production is reduced in patients with chronic renal failure. Arterioscler Thromb Vasc. 19, 1168-1172 (1999).
  29. Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. J Am Soc Nephrol. 15, 1983-1992 (2004).
  30. Hasdan, G., et al. Endothelial dysfunction and hypertension in 5/6 nephrectomized rats are mediated by vascular superoxide. Kidney Int. 61, 586-590 (2002).
  31. Chue, C. D., Townend, J. N., Steeds, R. P., Ferro, C. J. Arterial stiffness in chronic kidney disease: causes and consequences. Heart. 96, 817-823 (2010).
  32. Dupont, J. J., Farquhar, W. B., Townsend, R. R., Edwards, D. G. Ascorbic acid or L-arginine improves cutaneous microvascular function in chronic kidney disease. J Appl Physiol. 111, (2011).
  33. Oberg, B. P., et al. Increased prevalence of oxidant stress and inflammation in patients with moderate to severe chronic kidney disease. Kidney Int. 65, 1009-1016 (2004).
  34. Cachofeiro, V., et al. Oxidative stress and inflammation, a link between chronic kidney disease and cardiovascular disease. Kidney Int Suppl. (111), (2008).
  35. Vila, E., Salaices, M. Cytokines and vascular reactivity in resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288, (2005).
  36. Perticone, F., et al. Endothelial dysfunction and subsequent decline in glomerular filtration rate in hypertensive patients. Circulation. 122, 379-384 (2010).
  37. Zatz, R., Baylis, C. Chronic nitric oxide inhibition model six years on. Hypertension. 32, 958-964 (1998).
  38. Nakagawa, T., Johnson, R. J. Endothelial nitric oxide synthase. Contrib Nephrol. 170, 93-101 (2011).
  39. Muller, V., Tain, Y. L., Croker, B., Baylis, C. Chronic nitric oxide deficiency and progression of kidney disease after renal mass reduction in the C57Bl6 mouse. Am J Nephrol. 32, 575-580 (2010).
  40. Colombo, P. C., et al. Biopsy coupled to quantitative immunofluorescence: a new method to study the human vascular endothelium. J Appl Physiol. 92, 1331-1338 (2002).
  41. Donato, A. J., Black, A. D., Jablonski, K. L., Gano, L. B., Seals, D. R. Aging is associated with greater nuclear NFkappaB, reduced IkappaBalpha, and increased expression of proinflammatory cytokines in vascular endothelial cells of healthy humans. Aging Cell. 7, 805-812 (2008).
  42. Donato, A. J., et al. Direct evidence of endothelial oxidative stress with aging in humans: relation to impaired endothelium-dependent dilation and upregulation of nuclear factor-kappaB. Circ Res. 100, 1659-1666 (2007).
  43. Jablonski, K. L., Chonchol, M., Pierce, G. L., Walker, A. E., Seals, D. R. 25-Hydroxyvitamin D deficiency is associated with inflammation-linked vascular endothelial dysfunction in middle-aged and older adults. Hypertension. 57, 63-69 (2011).
  44. Corretti, M. C., et al. Guidelines for the ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery: a report of the International Brachial Artery Reactivity Task Force. J Am Coll Cardiol. 39, 257-265 (2002).
  45. Harris, R. A., Nishiyama, S. K., Wray, D. W., Richardson, R. S. Ultrasound assessment of flow-mediated dilation. Hypertension. 55, 1075-1085 (2010).
  46. Donald, A. E., et al. Methodological approaches to optimize reproducibility and power in clinical studies of flow-mediated dilation. J Am Coll Cardiol. 51, 1959-1964 (2008).
  47. Widlansky, M. E. Shear stress and flow-mediated dilation: all shear responses are not created equally. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 296, (2009).
  48. Stewart, A. D., Millasseau, S. C., Kearney, M. T., Ritter, J. M., Chowienczyk, P. J. Effects of inhibition of basal nitric oxide synthesis on carotid-femoral pulse wave velocity and augmentation index in humans. Hypertension. 42, 915-918 (2003).
  49. Lantelme, P., Mestre, C., Lievre, M., Gressard, A., Milon, H. Heart rate: an important confounder of pulse wave velocity assessment. Hypertension. 39, 1083-1087 (2002).
  50. Jablonski, K. L., Seals, D. R., Eskurza, I., Monahan, K. D., Donato, A. J. High-dose ascorbic acid infusion abolishes chronic vasoconstriction and restores resting leg blood flow in healthy older men. J Appl Physiol. 103, 1715-1721 (2007).

Tags

רפואה גיליון 88 מחלת כליות כרונית בתאי האנדותל התרחבות בתיווך זרימה immunofluorescence סטרס חמצוני מהירות גל דופק
הערכה של תפקוד כלי דם בחולים עם מחלת כליות כרונית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jablonski, K. L., Decker, E.,… More

Jablonski, K. L., Decker, E., Perrenoud, L., Kendrick, J., Chonchol, M., Seals, D. R., Jalal, D. Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease. J. Vis. Exp. (88), e51478, doi:10.3791/51478 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter