Medidas de calorimetría de titulación isotérmica flujo de calor liberado o absorbido en las reacciones químicas. Este método se puede utilizar para cuantificar la enzima-catálisis. En este trabajo, el protocolo para la configuración instrumental, experimento en marcha, y el análisis de datos se describe generalmente, y se aplica a la caracterización de la hidrólisis enzimática de la urea por la ureasa jack bean.
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Artículo de método
Hot Catálisis Biológica: Calorimetría de titulación isotérmica para caracterizar las reacciones enzimáticas
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Resumen
Resumen
Calorimetría de titulación isotérmica (ITC) es una técnica bien descrito que mide el calor liberado o absorbido durante una reacción química, utilizando como una sonda intrínseca para caracterizar prácticamente todos los procesos químicos. Hoy en día, esta técnica se aplica ampliamente para determinar los parámetros termodinámicos de los equilibrios de unión biomoleculares. Además, el CCI se ha demostrado ser capaz de medir directamente la cinética y los parámetros termodinámicos (k gato, K M,? H) de las reacciones enzimáticas, a pesar de que esta aplicación es aún sin explotar. Como los cambios de calor se producen de forma espontánea durante la catálisis enzimática, el CCI no requiere ninguna modificación o etiquetado del sistema bajo análisis y se puede realizar en solución. Por otra parte, el método necesita poca cantidad de material. Estas propiedades hacen que el CCI una herramienta inestimable, poderosa y única para estudiar la cinética de enzimas en varias aplicaciones, tales como, por ejemplo, el descubrimiento de fármacos.
k gato y K M de la hidrólisis enzimática de la urea por Canavalia ensiformis (canavalia) ureasa. Se realiza Cálculo de la entalpía molar intrínseca (H int) de la reacción. Los valores así obtenidos son consistentes con los datos anteriores reportados en la literatura, lo que demuestra la fiabilidad de la metodología.
Introducción
La determinación cuantitativa de las reacciones bioquímicas proporciona información detallada sobre los procesos biológicos en la base de la vida. Calorimetría ofrece una metodología libre de marca para caracterizar cuantitativamente virtualmente cada reacción química en la solución. Esta técnica mide el calor liberado o absorbido con el tiempo, y por lo tanto es un sistema de detección universal y una metodología muy conveniente para cuantificar la cantidad de moléculas que reaccionan (es decir, la termodinámica de unión), así como para medir la velocidad de reacción (es decir, la cinética). En particular, Calorimetría de titulación isotérmica (ITC....
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Protocolo
1. Muestras Preparación
- Preparar 2 ml de solución de enzima y 0,5 ml de solución de sustrato para cada prueba experimental. Diluir las soluciones madre concentradas de enzima y sustrato en soluciones tampón que tiene composición idéntica a minimizar el calor de dilución y mezcla durante la adición de sustrato.
- Elija las condiciones de tampón que sean adecuados para evitar el cambio de pH durante el experimento. Por ejemplo, 20 mM de HEPES pH 7 es adecuado para mediciones a pH neutro.
NOTA: Si el intercambio de protones está involucrado, entalpías de protonación de los tampones utilizados deben ser considerados, ya que afectan el
- Elija las condiciones de tampón que sean adecuados para evitar el cambio de pH durante el experimento. Por ejemplo, 20 mM de HEPES pH 7 es adecuado para mediciones a pH neutro.
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Resultados
La ureasa (CE 3.5.1.5; amidohidrolasa de urea) es una enzima que contiene níquel de múltiples subunidades que se encuentra en Archea, bacterias, eucariotas y plantas unicelulares. Actos esta proteína en el último paso de la mineralización de nitrógeno orgánico, que catalizan la hidrólisis de urea a amoniaco y carbamato, que se descompone espontáneamente para dar una segunda molécula de amoniaco y bicarbonato (Ecuación 6) 12.
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Discusión
Importancia de las TIC para estudiar la actividad enzimática con respecto a los métodos existentes
Además de sus aplicaciones clásicas para estudiar los equilibrios de unión, calorimetría de titulación isotérmica proporciona un método fiable y rápido para caracterizar reacciones enzimáticas en solución utilizando el calor de reacción como una sonda, sin requerir la modificación del sistema o etiquetado. Los parámetros cinéticos k gato y K M.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
La Especialidad de fertilizantes Products Company (SFP) es reconocida por proporcionar los fondos necesarios para este estudio.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| HEPES | Sigma | H3375 | que se disuelve en agua y ajusta el pH con NaOH |
| TRIZMA-Base | Sigma T1503 | que se disuelve en agua y ajusta el pH con HCl | |
| Dihidrógeno fosfato de sodio | Riedel-de-Haen | 4270 | que se disuelve en agua |
| Fosfato de sodio dibásico | Riedel-de-Haen | 30427 | que se disuelve en agua |
| Urea | Sigma | U4128 | disolviéndose en agua a 40 &0 °C; C |
| Canavalia ensiformis ureasa (tipo C-3) | Sigma | U0251 | disuelto en 20 mM HEPES pH 7 y almacenado a -80 °C; C |
| VP-ITC en Origin 7.0 | MicroCal (GE Healthcare) | SYS13901 | instrumento |
| VPViewer2000 1.30.00 en | MicroCal (GE Healthcare) | suministrado con el instrumento |
Referencias
- Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 560-566 (2001).
- Ladbury, J. E. Application of isothermal titration calorimetr....
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Reimpresiones y permisos
