Una enzima de restricción método basado clonación para evaluar la In vitro Capacidad de replicación del VIH-1 subtipo C Gag-MJ4 quiméricos virus

Resumen

La patogénesis del VIH-1 se define tanto por las características virales como por los factores genéticos del huésped. Aquí describimos un método robusto que permite mediciones reproducibles para evaluar el impacto de la variación de la secuencia del gen gag en la capacidad de replicación in vitro del virus.

Resumen

El efecto protector de muchos alelos HLA de clase I sobre la patogénesis del VIH-1 y la progresión de la enfermedad se atribuye, en parte, a su capacidad para dirigirse a partes conservadas del genoma del VIH-1 que escapan con dificultad. Los cambios en la secuencia atribuidos a la presión inmunitaria celular surgen en todo el genoma durante la infección y, si se encuentran dentro de regiones conservadas del genoma, como Gag, pueden afectar la capacidad del virus para replicarse in vitro. La transmisión de polimorfismos ligados a HLA en Gag a receptores no compatibles con HLA se ha asociado con cargas virales de punto de ajuste reducidas. Nuestra hipótesis puede deberse a una capacidad de replicación reducida del virus. Aquí presentamos un método novedoso para evaluar la replicación in vitro del VIH-1 influenciada por el gen gag aislado de puntos de tiempo agudos de zambianos infectados por el subtipo C. Este método utiliza la clonación basada en enzimas de restricción para insertar el gen gag en una columna vertebral proviral del VIH-1 de subtipo C común, MJ4. Esto lo hace más apropiado para el estudio de secuencias de subtipo C que los métodos anteriores basados en recombinación que han evaluado la replicación in vitro de secuencias gag-pro derivadas crónicamente. Sin embargo, el protocolo podría modificarse fácilmente para estudios de virus de otros subtipos. Además, este protocolo detalla un método robusto y reproducible para evaluar la capacidad de replicación de los virus quiméricos Gag-MJ4 en una línea de células T basada en CEM. Este método se utilizó para el estudio de los virus quiméricos Gag-MJ4 derivados de 149 zambianos infectados agudamente por el subtipo C, y ha permitido la identificación de residuos en Gag que afectan a la replicación. Más importante aún, la implementación de esta técnica ha facilitado una comprensión más profunda de cómo la replicación viral define los parámetros de la patogénesis temprana del VIH-1, como la carga viral de punto de ajuste y la disminución longitudinal de las células T CD4+.

Introducción

Determinar el host y características virales que influyen en el VIH-1 patogénesis y progresión de la enfermedad es de suma importancia para el diseño racional de vacunas. La respuesta inmune celular es un componente clave de la respuesta inmune humana a la infección VIH-1. Los linfocitos T citotóxicos (CTL) son necesarios para el control inicial de la viremia aguda, y permiten al ordenador establecer un estado de equilibrio (set point) de la carga viral ^1,2. Experimental agotamiento de estas células efectoras se traduce en la pérdida de control viral ^3,4. A pesar de esto, escapan mutaciones surgen dentro del genoma viral que subvertir reconocimi....

Protocolo

1. amplificación del VIH-1 gag gene de Infected, Frozen Plasma

1. Extracto de ARN viral a partir de 140 l descongelado del VIH-1 en plasma infectado utilizando un kit de extracción.
   1. Cuando sea posible, proceder de inmediato a la síntesis de ADNc después de la extracción de RNA como ARN viral no congelada produce los mejores resultados de la amplificación. Si es posible, establezca mezcla maestra de PCR para la amplificación de primera ronda de ADN y se almacenan a 4 ° C antes de la extracción de ARN viral.
2. Transcribir inversa de ADNc a partir de ARN y amplificar productos de ADN de la primera ronda usando transcriptasa in....

Resultados

Para ejecutar correctamente este protocolo, lo que crea un plásmido proviral capaz de ensamblar completamente funcionales, infecciosas quimeras Gag-MJ4, el gran cuidado se debe tomar para generar los amplicones PCR apropiados. Determinación de si la PCR ha generado el amplicón de la mordaza de tamaño adecuado es crucial. Los productos deben estar dentro de 100 pares de bases (pb) de la amplificación de aproximadamente 1700 pb se muestra en la Figura 1A. La longitud exacta de este fragmento vari.......

Discusión

Debido a la longitud y el carácter técnico de este protocolo, hay varios pasos que son fundamentales tanto para la construcción exitosa de plásmidos Gag-MJ4 quiméricos, así como para la cuantificación de la capacidad de replicación viral. Aunque la estrategia de clonación basado enzima de restricción para la introducción de genes gag extranjera en MJ4 descrito en este protocolo tiene numerosas ventajas sobre los métodos basados ​​en la recombinación utilizadas anteriormente, el protocolo puede ser técnicamente .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
de PCRstrong>
strongGOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDT	DNA	Custom Oligo	25 nmol, desalt estándar
VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDT	DNA	Custom Oligo	25 nmol, desalt estándar
GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDT	DNA	Custom Oligo	25 nmol, desalinización estándar
BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR	3'IDT DNA	Custom Oligo	25 nmol, desalt estándar
MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDT	DNA	Custom Oligo	25 nmol, desalt estándar
MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCCTTCTAGC 3'IDT	DNA	Custom Oligo	25 nmol, desalt estándar
BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'	IDT DNA	Custom Oligo	25 nmol, desalt estándar
GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDT	DNA	Custom Oligo	25 nmol, desalt estándar
For3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDT	DNA	Custom Oligo	25 nmol, desalar estándar
GagR6: 5' CTGTATCATCTCTCCTCCTG 3'IDT	DNA	Custom Oligo	25 nmol, desalt estándar
Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDT	DNA	Oligo personalizado	25 nmol, desalación estándar
Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3'IDT	DNA	Custom Oligo	25 nmol, desalinización estándar
CoolRack PCR 96 XT	Biocision	BCS-529
CoolRack M15	Biocision	BCS-125
Agua libre de nucleasas	Fisher	SH30538FS	Fabricado por Hyclone
QIAamp Viral RNA Mini Kit	Qiagen	52906
Simport PCR 8 Tiras, Azul (Tapa Plana)	Sistema
SuperScript III	Life Technologies/Invitrogen	12574035
Phusion Hot-start II ADN polimerasa	Fisher	F-549L
PCR Mezcla	Roche	4638956001
Agarosa, alta resistencia al gel	Fisher	50-213-128
TAE 10X	Life Technologies/Invitrogen	AM9869
Promega 1 kb Escalera de ADN	Fisher	PRG5711	Fabricado por Promega
Sybr Safe DNA Gel Stain, 10,000x	Life Technologies/Invitrogen	S33102
Wizard SV Gel y Sistema de limpieza para PCR	Promega	A9282
Hojas de afeitar de un solo filo	Fisher	12-640	Fabricado por Surgical Design
Thermocycler, PTC-200	MJ Research
Microbiology & Reactivos de clonación
LB, Miller	Fisher	BP1425-2
LB Broth, Lennox	Fisher	BP1427-2
Estéril 100 x 15 mm placas de Petri de poliestireno	Fisher	08-757-12
Ampicilina sal sódica	Sigma-Aldrich	A9518-5G
Falcon 14 ml Tubos de polipropileno de fondo redondo	BD Biosciences
Endonucleasa de restricción NgoMIV	Nueva Inglaterra BioLabs	R0564L
Endonucleasa de restricción de BclI	Nueva Inglaterra BioLabs	R0160L
Endonucleasa de restricción HpaI	Nueva Inglaterra BioLabs	R0105L
T4 ADN ligasa, 5 U/μ l	Roche	10799009001
células competentes JM109, >108 cfu/μ g	Promega	L2001
PureYield sistema de minipreparación de plásmido	Promega	A1222
Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator	Invitrogen	G6600
Microfuge 18 centrífuga	Beckman Coulter	367160
Cell Culture Reagents
Amphyl limpiador/desinfectante	Fisher	22-030-394
Fugene HD, 1 ml	VWR	PAE2311	Fabricado por Promega
Bromuro de hexadimetrina (Polybrene)	Sigma-Aldrich	H9268-5G
Placas Costar, 6 pocillos, planas	Fisher	07-200-83	Fabricado por Corning Life
Placas Costar, 24 pocillos, planas	Fisher	07-200-84	Fabricado por Corning Life
Placas Costar, 96 pocillos, redondas	Fisher	07-200-95	Fabricado por Corning Life
Frascos, Corning filter top/cuello inclinado, 75 cm2	Fisher	10-126-37
Frascos, Corning filter top/cuello inclinado, 150 cm2	Fisher	10-126-34	Fabricado por Corning Life
Tubos cónicos, 50 ml, tapón azul	Fisher	14-432-22	Fabricado por BD Biosciences
Tubos cónicos, 15 ml, tapón azul	Fisher	14-959-70C	Fabricado por BD Biosciences
Trypsin-EDTA	Fisher	MT25052CI	Fabricado por Mediatech
RPMI, 500 ml	Life Technologies/Invitrogen	11875-119
DMEM, 500 ml	Life Technologies/Invitrogen	11965-118
Penicilina/ Estreptomicina/Glutamina, 100x	Life Technologies/Invitrogen	10378-016
PBS con magnesio y calcio, 500 ml	Life Technologies/Invitrogen	14040-133
PBS sin magnesio y calcio	Life Technologies/Invitrogen	20012-050
Tubos Sarstedt, colores variados	Sarstedt	72.694.996
Bandejas de depósito para Multicanal, 55 ml	Fisher	13-681-501
DEAE-Dextrano	Fisher	NC9691007
Corning 96 pocillos transparente microplaca tratada con cultivo de tejidos con fondo en V	Fisher	07-200-96	Fabricado por Corning Life
HEPES, 1 M Solución tampón	Life Technologies/Invitrogen	15630-080
FBS, Definido, 500 ml	Fisher	SH30070 03
X-gal	VWR	PAV3941	Fabricado por Promega
Glutaraldehído, Grado II, 25% en H2O	Sigma-Aldrich	G6257-100ML
1 M Solución de cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich	M1028-100ML
Solución de formaldehído, para biología molecular, 36.5%	Sigma-Aldrich	F8775-500ML
Potasio hexacianoferrato (II) trihidrato	Sigma-Aldrich	P9387-100G
Hexacianoferrato de potasio(III)	Sigma-Aldrich	P8131-100G
Centrífuga Allegra X15-R	Beckman Coulter	392932
TC10 contador de células automatizado	Bio-Rad	1450001
VistaVision microscopio invertido	VWR
dTTP, [α-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi	Perkin-Elmer	NEG605H001MC
1 M Tris-Cl, pH 8.0	Life Technologies/Invitrogen 15568025		Debe ajustarse a pH 7.8 con KOH
2 M Cloruro de potasio (KCl)	Life Technologies/Invitrogen	AM9640G	Adjust a 1 M solución
0,5 M EDTA	Life Technologies/Invitrogen	15575-020
Nonidet P40	Roche	11333941103
Ácido poliadenilico (Poly rA) sal de potasio	Reactivo de Midland Co.	P-3001
Oligo d(T) imprimación	Life Technologies/Invitrogen	18418-012
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815-1G
SR, Pantalla de Fósforo de Super Resolución, Pequeña	Perkin-Elmer	7001485
Corning Costar Thermowell Modelo de placa de 96 pocillos (M) Policarbonato	Fisher	07-200-245	Fabricado por Corning Life
Cinta de sellado de aluminio de microplaca de 96 pocillos Corning, no estéril	Fisher	07-200-684	Fabricado por Corning Life
Papel de intercambio aniónico DE-81	Whatman	3658-915
Citrato trisódico dihidratado	Sigma-Aldrich	S1804-1KG
Cloruro de sodio	Fisher	S671-3
Cassette de autorradiografía	Fisher	FB-CA-810
Criba de almacenamiento ciclónico Packard