Artículo de método

Una enzima de restricción método basado clonación para evaluar la In vitro Capacidad de replicación del VIH-1 subtipo C Gag-MJ4 quiméricos virus

DOI:

10.3791/51506

⸱

31 de agosto de 2014

 ,  , 
1Emory Vaccine Center at Yerkes National Primate Research Center, Emory University, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La patogénesis del VIH-1 se define tanto por las características virales como por los factores genéticos del huésped. Aquí describimos un método robusto que permite mediciones reproducibles para evaluar el impacto de la variación de la secuencia del gen gag en la capacidad de replicación in vitro del virus.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El efecto protector de muchos alelos HLA de clase I sobre la patogénesis del VIH-1 y la progresión de la enfermedad se atribuye, en parte, a su capacidad para dirigirse a partes conservadas del genoma del VIH-1 que escapan con dificultad. Los cambios en la secuencia atribuidos a la presión inmunitaria celular surgen en todo el genoma durante la infección y, si se encuentran dentro de regiones conservadas del genoma, como Gag, pueden afectar la capacidad del virus para replicarse in vitro. La transmisión de polimorfismos ligados a HLA en Gag a receptores no compatibles con HLA se ha asociado con cargas virales de punto de ajuste reducidas. Nuestra hipótesis puede deberse a una capacidad de replicación reducida del virus. Aquí presentamos un método novedoso para evaluar la replicación in vitro del VIH-1 influenciada por el gen gag aislado de puntos de tiempo agudos de zambianos infectados por el subtipo C. Este método utiliza la clonación basada en enzimas de restricción para insertar el gen gag en una columna vertebral proviral del VIH-1 de subtipo C común, MJ4. Esto lo hace más apropiado para el estudio de secuencias de subtipo C que los métodos anteriores basados en recombinación que han evaluado la replicación in vitro de secuencias gag-pro derivadas crónicamente. Sin embargo, el protocolo podría modificarse fácilmente para estudios de virus de otros subtipos. Además, este protocolo detalla un método robusto y reproducible para evaluar la capacidad de replicación de los virus quiméricos Gag-MJ4 en una línea de células T basada en CEM. Este método se utilizó para el estudio de los virus quiméricos Gag-MJ4 derivados de 149 zambianos infectados agudamente por el subtipo C, y ha permitido la identificación de residuos en Gag que afectan a la replicación. Más importante aún, la implementación de esta técnica ha facilitado una comprensión más profunda de cómo la replicación viral define los parámetros de la patogénesis temprana del VIH-1, como la carga viral de punto de ajuste y la disminución longitudinal de las células T CD4+.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Determinar el host y características virales que influyen en el VIH-1 patogénesis y progresión de la enfermedad es de suma importancia para el diseño racional de vacunas. La respuesta inmune celular es un componente clave de la respuesta inmune humana a la infección VIH-1. Los linfocitos T citotóxicos (CTL) son necesarios para el control inicial de la viremia aguda, y permiten al ordenador establecer un estado de equilibrio (set point) de la carga viral 1,2. Experimental agotamiento de estas células efectoras se traduce en la pérdida de control viral 3,4. A pesar de esto, escapan mutaciones surgen dentro del genoma viral que subvertir reconocimiento de CTL de las células infectadas viralmente 5-9.

Ciertos alelos HLA se han asociado con cargas virales más bajas y más lenta progresión de la enfermedad, incluido el B * 57, B * 27 B * 81 y 10-15. Parte de los beneficios de protección de los alelos HLA de clase I se puede atribuir al hecho de que se tengan en regiones funcionalmente limitados del genoma, tales como Gagy seleccionar para mutaciones de escape que disminuyen la capacidad del virus para replicarse in vitro 16-21. Aunque escape del sistema inmune celular es beneficioso para el virus en el contexto de la selección de HLA de clase I alelo, el efecto de estas mutaciones puede tener consecuencias diferenciales para el huésped tras la transmisión a un individuo HLA no coincidentes 22,23. Por lo tanto, la comprensión de los efectos de la transmisión mutaciones de escape HLA-asociada a la capacidad de replicación viral será importante para mejorar nuestra comprensión de los principios de VIH-1 patogénesis.

Si bien se ha avanzado mucho para identificar y caracterizar los defectos de la aptitud de mutaciones de escape individuales asociados a una clase de HLA I alelos 24-29, de origen natural aislados HIV-1 han huellas únicas y complejas de los polimorfismos asociados-HLA, probablemente derivado de la HLA presión inmune mediada de diferentes orígenes immunogenetic 30. En apanálisis de la mera existencia, Goepfert et al. mostró que una acumulación de mutaciones asociadas a HLA en las secuencias de la mordaza de transmisión derivados de 88 Zambianos infectadas de forma aguda se asoció con una reducción en la carga viral del punto de ajuste 31. Esto sugirió que la transmisión de mutaciones de escape nocivos, específicamente en Gag, a los destinatarios-HLA no coincidentes proporciona un beneficio clínico, y puede ser debido a la replicación viral atenuada. De cara al futuro, es imprescindible para estudiar cómo las combinaciones de los polimorfismos de la mordaza del complejo dentro de los aislamientos naturales trabajan en conjunto para definir las características del virus de transmisión, tales como la capacidad de replicación, y cómo la replicación temprana podría a su vez afectar el VIH-1 parámetros clínicos y de la última etapa patogénesis.

Brockman et al. Demostró por primera vez un vínculo entre la capacidad de replicación de secuencias-gag pro aislado durante la infección etapa crónica y la carga viral tanto en el subtipo C y las infecciones B32-35. El enfoque experimental se presenta en estos estudios, aunque apropiado para examinar la capacidad de replicación in vitro de secuencias derivadas de individuos con infección crónica, tiene varias advertencias y limitaciones técnicas que hacen que estudian el VIH-1 capacidad replicativa en el subtipo C individuos infectados de forma aguda difícil. Este método se basa en la recombinación de secuencias basadas población amplificados por PCR en el subtipo B NL4-3 provirus, que se deriva en parte de LAV, un laboratorio adaptado stock de virus 36. Generación de virus se realizó por co-transfección de una línea de células T CEM basada en 37 con amplicones de PCR y se digirió ADN NL4-3 delta pro-gag. Este método requiere la consecuencia de virus durante un período de semanas a meses, potencialmente sesgar la naturaleza del stock de virus recuperado en relación con las cuasiespecies virales in vivo, y por lo tanto alterar la medición de la capacidad de replicación in vitro. Este método is más apropiado para el estudio de los individuos infectados crónicamente, donde se selecciona de manera efectiva para el virus de la más alta capacidad replicativa, y donde la clonación de numerosos diferentes variantes virales a partir de un gran número de individuos infectados crónicamente es bastante mano de obra intensiva y por lo tanto no es factible. Sin embargo, dentro de un individuo infectado de forma aguda, hay generalmente uno y cincuenta y nueve variantes presentes, y eliminando así el riesgo de sesgo de la naturaleza del stock de virus recuperado, a través de presiones de selección in vitro, permite una evaluación más precisa de la capacidad de replicación in vitro. En segundo lugar, este método requiere la recombinación de secuencias gag-pro subtipo C en una columna vertebral derivada subtipo B, y podría introducir sesgos de incompatibilidad columna vertebral en el análisis. Debido a estas limitaciones, un gran número de secuencias deben ser analizados con el fin de superar las posibles sesgos introducidos.

Aquí describimos una apro experimental alternativoach apropiada para el estudio de secuencias derivadas del subtipo C individuos con infección aguda. Utilizamos una estrategia de clonación basada en la enzima de restricción para introducir el gen gag derivado de puntos de tiempo infección aguda de los individuos infectados por VIH-1 subtipo C en la cadena principal proviral subtipo C, MJ4. El uso de MJ4 como una red troncal común en el que para clonar genes gag es crucial para el análisis de subtipo C secuencias derivadas. MJ4 se deriva de un aislado primario 38, y por lo tanto sería menos probable que introducir un sesgo debido a la incompatibilidad subtipo entre la columna vertebral y el gen gag. Además, el enfoque de la utilización de la clonación restricción basada enzima permite la proviral construye a transfectar directamente en células 293T, y para la recuperación de un virus clonal de stock idéntica a la secuencia gag clonado.

El método presentado a continuación es un método de alto rendimiento para evaluar la capacidad de replicación del subtipo C derivada Gag-MJ4virus quiméricos. La transfección en células 293T es sencillo y recuperación de virus toma sólo tres días. In vitro la capacidad de replicación se ensayó en la misma línea de células T basado CEM-CCR5 creado por Brockman et al. 37, pero utilizando importantes modificaciones de protocolo necesaria para la replicación exitosa del subtipo C MJ4 virus quiméricos. El uso de una línea de células T apropiada en lugar de PBMC permite un gran número de virus quimérico MJ4 subtipo C de la prueba con alta reproducibilidad del ensayo. Por último, utilizando un ensayo radiomarcado de la transcriptasa inversa para la cuantificación de virus en el sobrenadante es más rentable que el uso de kits de ELISA de p24 disponibles comercialmente. También le da un rango dinámico más alto, lo cual era importante para la detección de los virus de mal y altamente replican dentro del mismo ensayo y para detectar diferencias sutiles en la replicación entre los aislados.

En conclusión, el método que aquí se presenta ha permitidoel estudio en profundidad de la capacidad de replicación de secuencias gag derivados de VIH-1 subtipo C infecta de forma aguda las personas de Zambia, y tal como está escrita, también podría ampliarse para estudiar otro subtipo C poblaciones infectadas. Se observó un alto grado de variación en las capacidades de replicación entre los diferentes aislados de la mordaza. Además, hemos sido capaces de demostrar una asociación estadística entre la capacidad de replicación del Gag transmitida y el punto de ajuste de la carga viral, así como con CD4 + descenso durante un período de tres años 39. Estos resultados destacan la importancia de estudiar las características virales cómo transmitidos, tales como la capacidad de replicación, interactúan con el sistema inmune del huésped para influir en la patogénesis durante la infección temprana y serán integrales para el desarrollo de intervenciones de vacunas eficaces, así como el tratamiento.

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Protocolo

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1. amplificación del VIH-1 gag gene de Infected, Frozen Plasma

  1. Extracto de ARN viral a partir de 140 l descongelado del VIH-1 en plasma infectado utilizando un kit de extracción.
    1. Cuando sea posible, proceder de inmediato a la síntesis de ADNc después de la extracción de RNA como ARN viral no congelada produce los mejores resultados de la amplificación. Si es posible, establezca mezcla maestra de PCR para la amplificación de primera ronda de ADN y se almacenan a 4 ° C antes de la extracción de ARN viral.
  2. Transcribir inversa de ADNc a partir de ARN y amplificar productos de ADN de la primera ronda usando transcriptasa inversa y una ADN polimerasa termoestable en un solo paso RT-PCR.
    1. Tome ARN de -80 ° C congelador (si la congelación era necesario) y deshielo brevemente a temperatura ambiente y luego coloque en el bloque frío. Transferencia de 5 l de ARN a cada tubo de PCR que contiene 45 l de mezcla maestra para dar un volumen final de 50 l. Colocar inmediatamente muestras de ARN restante en -80 ° C congelador.
    2. Después de enzima es unadded a la primera ronda de PCR Master Mix (Tabla 1A), alícuota de 45 l en cada tubo de pared delgada amplificación por PCR para el número de reacciones deseadas. Asegúrese de utilizar tubos de PCR con tapas individuales y no despojar tapas para garantizar la contaminación cruzada entre las muestras mínimas. Colocar tubos de PCR en un bloque frío para proteger el sensible enzima y ARN plantilla RT temperatura. Nota: Las muestras deben ser manejados por triplicado con el fin de probar adecuadamente las cuasiespecies virales. También es importante que se utilice un producto con una alta fidelidad de la enzima ADN polimerasa con el fin de reducir al mínimo la incorporación errónea introducido-PCR. Por favor, consulte la lista de reactivos para el producto recomendado.
    3. Después de plantilla de ARN ha sido añadido a todos los tubos de reacción, tubos de PCR para transferir un termociclador para la amplificación utilizando el programa ciclador se describe en la Tabla 1B. Nota: El producto de esta amplificación se puede utilizar en una segunda ronda de PCR anidada.
  3. Realizar un sí anidadocond-ronda de amplificación por PCR, usando 1 l de la primera ronda de amplificación por PCR (1,2) como la plantilla de ADN.
    1. Alícuota de 49 l de mezcla de segunda ronda de PCR maestro (Tabla 2A) a cada tubo de PCR de paredes finas para el número de reacciones deseadas. Transferencia de 1 l de la amplificación por PCR de primera ronda a cada tubo de reacción para dar un volumen final de 50 l. Nota: Esto servirá de ADN como molde para la amplificación de la segunda ronda. También es importante utilizar una ADN polimerasa con capacidades muy alta fidelidad y corrección de pruebas con el fin de reducir al mínimo la incorporación errónea introducido-PCR. Por favor, consulte la lista de reactivos para el producto recomendado.
    2. Traslado de segunda ronda mezcla de reacción PCR para termociclador y el programa de ejecución se describe en la Tabla 2B. Nota: Después de la finalización del programa, los productos de esta reacción se ejecutan en un gel de agarosa para confirmar la producción del producto.
  4. Añadir 3 l de tinte 5x carga en 5 & #181; l del volumen de reacción de segunda ronda 50 l y correr a 120 V en un gel de agarosa-TAE al 1% que contiene un ADN a las manchas UV fluorescente hasta que se resuelvan las bandas. Visualice 1,6 kb bandas sobre un iluminador de luz azul (véase la Figura 1A).
  5. Ejecute el volumen de reacción de 45 l que queda en un gel de agarosa-TAE al 1% que contiene una mancha de ADN, y extirpar las bandas apropiadas con una hoja de afeitar limpia.
    1. Extraer ADN de la porción de gel usando un kit de purificación de gel, eluir en agua libre de nucleasa, combinar tres reacciones positivas por individuo, y congelar el producto a -20 ° C para su uso posterior.

2. Preparación Amplicones mordaza para la clonación mediante la introducción de los sitios de restricción necesarios

  1. Amplificar la repetición terminal larga (LTR) / 5 parte de 'UTR del plásmido MJ4 (véase la Tabla 3).
  2. Visualice 1,3 kb productos de PCR en iluminador, sobre consumos específicos amplificados positivos, gel de purificar y congelar previamentedescrito (1.4,1.5; véase la Figura 1B).
  3. Crear fusionado amplicones gag MJ4 LTR través de "empalme de superposición-extensión" PCR (véase la Tabla 4).
  4. Visualice, impuestos especiales, purificar, y congelar los 3,2 kb amplicones como en 1.4,1.5 (ver Figura 1C).

3. Clonación Amplified Los genes gag en el MJ4, subtipo C, clon molecular infeccioso

  1. Digerir 1,5 g de plásmido MJ4 y 1,5 g de producto purificado LTR gag PCR con la endonucleasa de restricción BclI (sensible a la metilación) durante 1,5 horas a 50 ° C (véase la Tabla 5A).
  2. Añadir 1 l de NgoMIV a la reacción de digestión y se incuba a 37 ° C durante 1 hr.
  3. Añadir colorante de carga 5x a reacciones de digestión de restricción y lentamente el volumen total a electroforesis en un gel de agarosa-TAE al 1% que contiene una mancha de gel de ADN durante 1-2 horas a 100 V. Visualizar, el consumo, y purificar bandas indicadas anteriormente para la clonación como descRibed (ver Figura 2).
  4. Preparar reacciones de ligación utilizando purificada inserto gag LTR y el ADN vector MJ4 a 3: inserción 1 al cociente vector. Incubar reacciones de ligación durante la noche a 4 ° C (véase la Tabla 5B).
  5. Transformar bacterias JM109 competentes químicamente con productos de ligación y se extendió sobre placas de agar LB con 100 mg / ml de ampicilina y crecer a 30 ° C durante 22 + horas.
    1. Descongele JM109 células competentes en hielo durante 15 min. Etiquetar 1,5 ml tubos de microcentrífuga y se enfría en hielo.
    2. Alícuota 50-100 l de células JM109 para enfriados previamente 1,5 ml tubos de microcentrífuga. Añadir 2,5-5 l de reacción de ligación a células JM109, agitando suavemente el tubo para mezclar y volver inmediatamente a hielo. Se incuban las células competentes con producto de ligación en hielo durante 30 min.
    3. Heat shock 1,5 ml tubos de microcentrífuga que contenían células competentes JM109 y reacción de ligación en un bloque de calor C 42 ° durante 45 segundos y volver a hielo durante al menos 3 min.
    4. Añadir 50 l de medio SOC a cada tubo de microcentrífuga y la placa de toda la reacción de transformación a temperatura ambiente en placas de agar LB-suplementadas con 100 g / ml de ampicilina.
    5. Placas de transferencia a un 30 ° C incubadora y dejar durante 20 horas, o hasta que las colonias están configurados de forma clara.
  6. Escoja colonias aisladas y crecer en 4 ml de LB con 100 mg / ml de ampicilina a 30 ° C durante 22 + horas.
  7. Centrifugar los cultivos a 3.200 xg durante 15 min, verter el caldo, y extraer el ADN plásmido.
  8. Para confirmar la clonación de fidelidad, cortar el ADN miniprep con NgoMIV y enzimas de restricción HpaI en una doble digestión a 37 ° C durante 2 horas. Analizar el 1% de agarosa TAE-gel (véase la Tabla 5C).
  9. Secuencia de la región de inserción LTR-gag de cada plásmido utilizando los siguientes cebadores: GagInnerF1, GagF2, Rev1, Rev3 y GagR6 (Tabla 6) para confirmar la identidad de secuencia.
  10. Comparación de las secuencias clonadas obtenidas con las secuencias población derIVED del amplicón purificado inicial a partir de 1.5.1. Nota: Es importante evaluar en última instancia, la capacidad de replicación de dos clones independientes con el fin de garantizar que ningún fenotipos de replicación in vitro no se deben a errores troncales introducidas durante el proceso de clonación.

4. Generación y Titulación de replicación competentes Gag-MJ4 quiméricos virus

  1. Generar virus de replicación competente mediante la transfección de 1,5 g del ADN del plásmido miniprep MJ4 quimérico en células 293T usando una proporción de 4: 1 de Fugene HD como se describe por Prince et al 39.
  2. Titulación cosechado reservas de virus en las células TZM-bl, como se describe a continuación y en Prince et al 39.
    1. Placa TZM-bl células 24 h antes de la infección con el virus con el fin de tener un 30-40% monocapa de células confluentes en el día siguiente. Esto por lo general se puede lograr mediante la adición de 5 x 10 4 células en un volumen total de 800 l por pocillo en una placa de 24 pocillos.
    2. Después de la adición de células al pozo, mover suavemente la placa de 24 pocillos hacia adelante y atrás, a continuación, lado a lado con el fin de distribuir las células de manera eficiente. Nunca Swirl - esto se traducirá en las células que se acumulan en el centro de la placa.
    3. El día siguiente, preparar 1% de FBS en DMEM; esto se utiliza para diluir DEAE-dextrano y para diluir las reservas de virus. Stock DEAE-dextrano es 10 mg / ml o 125x, y una concentración final de 80 mg se desea / ml o 1x.
    4. Saque de virus a ensayar desde -80 ° C congelador y el lugar en un agitador para descongelar a temperatura ambiente.
    5. Usando una pipeta multicanal, diluir en serie reservas de virus en un cultivo tisular de fondo redondo tratados placa de 96 pocillos con tapa. Este es un protocolo de dilución de 3 veces. Ver Tabla 7 para el esquema de dilución.
    6. Retire el medio de placas de 24 pocillos de TZM bl sembradas utilizando un aspirador de vacío, asegurándose de no perturbar la monocapa celular. Sólo retire el medio de una placa de 24 pocillos en un momento de forma que las células hacenNo seque.
    7. Añadir 150 l de la 1x DEAE-dextrano + FBS al 1% en mezcla de DMEM a cada pocillo usando una pipeta de 1000 l. No utilice la pipeta de repetición, ya que esto altera la monocapa.
    8. Añadir 150 l de cada dilución de virus al pocillo apropiado. Añadir virus al centro del pozo y agitar suavemente para distribuir uniformemente virus a través de la monocapa de células. Se incuban las células infectadas durante 2 horas en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C y 5% de CO 2.
    9. Después de la incubación de 2 horas, añadir 0,5 ml de 10% de FBS en DMEM a cada pocillo y las placas volver a la incubadora durante 48 h adicionales.
    10. Después de 48 horas, las células deben ser 100% de confluencia. Debido MJ4 es un virus de replicación competente, habrá alguna muerte celular, pero esto es de esperar.
    11. Retire el medio de cada pocillo y añadir 400 l / pocillo de solución de fijación (véase la Tabla 8A para la receta). Fijar sólo un plato a la vez. Añadir solución de fijación utilizando una pipeta de 1.000 l, y deje reposar durante 5 minutos atemperatura ambiente.
    12. Retire la solución de fijación y lavar 3 veces con PBS con Ca 2 + / Mg 2 +. Utilice una botella con atomizador para agregar suavemente PBS al lado del pozo para evitar la interrupción de la monocapa. Después del tercer lavado, seque la placa seca sobre papel absorbente.
    13. Añadir 400 l / pocillo de solución de tinción (véase la Tabla 8B para la receta) a cada pocillo de la placa de 24 pocillos, y se incuban a 37 ° C durante al menos 2 horas. Tiempos de incubación más largos son aceptables, pero los tiempos de incubación deben mantenerse coherente entre los experimentos titulación.
    14. Lavar 2 veces con PBS con Ca 2 + / Mg 2 + y la puntuación de la infección, o añadir PBS y se almacena a 4 º C para la puntuación más tarde. Las placas pueden mantenerse a 4 ° C durante hasta cuatro días, siempre y cuando la monocapa se mantiene hidratada.
    15. Para puntuar para la infección, utilice un marcador permanente para dividir a los pocillos de la placa de 24 pocillos en cuadrantes. Contar todas las células de color azul dentro de un campo de visión, mediante una ampliación total de 200X, una vez encada uno de los cuatro cuadrantes de un pozo.
    16. Calcule unidades infecciosas por l de la siguiente manera: [(# células azules / 4) x 67] / (l virus añadido) = UI / l. Remítase a la Tabla 8C para el volumen en l de virus a cada pocillo. Promedio de varios pozos juntos; los números deben ser relativamente similar para una valoración precisa.

5 Preparación de Medios de Cultivo y Propagación de células GXR25 para vitro Ensayo de replicación en

  1. Preparar RPMI completo (cRPMI) para la propagación de las células GXR25. NOTA: Es muy importante para las células cultura GXR25 al menos 4 meses antes de los experimentos de replicación planificadas (véase el cuadro 9).
  2. Dividir celdas 1:10 dos veces por semana y mantener la densidad celular entre 1 × 10 5 2 x 10 6 células / ml.

6. En la replicación in vitro de Gag-MJ4 Quimeras en GXR25 (CEM-CCR5-GFP) Células

  1. El día antes de la iNFECCIÓN, las células entre 2-3 x 10 5 células / ml dividir a una concentración de manera que estén en crecimiento logarítmico en el día de la infección.
  2. En el día de la infección, retirar las reservas de virus de -80 ° C congelador y descongelación. Calcular el volumen de virus necesaria de cada población en base a la UI / l título de ensayo de células TZM-bl para infectar 5 x 10 5 GXR25 células a una multiplicidad de infección de 0,05, utilizando la fórmula:
    Volumen de virus para la infección (l) = 1 l / X IU x 0.05 x 500.000
    NOTA: Hemos elegido una MOI de 0,05, ya que esto resulta en una fase de crecimiento logarítmica para todos los virus que hemos probado. Es importante llevar a cabo experimentos iniciales con el fin de determinar la óptima para capturar MOI de crecimiento logarítmico para el virus a ensayar.
  3. Diluir virus en cRPMI a un volumen de 100 l (para alcanzar un 0,05 de MOI) y añadir en un pocillo de un cultivo de tejido de fondo en V tratados placa de 96 pocillos. Nota: Incluya una positicinco de control (WT MJ4 infectada) y un negativo (células infectadas simuladas) en cada conjunto de experimentos de replicación. Configure la placa de tal manera que todos los demás la columna está en blanco para limitar la contaminación cruzada entre los pozos. El control positivo es imperativo, ya que se utilizará más adelante como un estándar para normalizar las pistas de replicación, que son una medida de la tasa de replicación de réplicas experimentales.
  4. Contar las células GXR25 utilizando un contador de células automatizado. Calcular el número de células necesarias en total para todas las infecciones (5 x 10 5 Infecciones x #). Alícuota el volumen necesario en un 50 ml tubo cónico y de centrifugación para sedimentar las células. Siempre calcular el 25% más infecciones de lo necesario.
  5. Medios Aspirar cuidadosamente y volver a suspender en cRPMI a una concentración de 5 x 10 5 células / 100 mL.
  6. Células Pipetear en una cubeta estéril y mezclar bien. Usando una pipeta multicanal, añadir 100 l de células en cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contenía el virus diluido. Mix a fondo.
  7. Añadir 2 l de solución de 5 mg / ml (100x) de polibreno a cada pocillo y mezclar a fondo las células.
  8. Se incuba a 37 ° C en cultivo de tejidos incubadora con CO2 al 5% durante 3 horas.
  9. Con el fin de lavar las células infectadas, centrífuga placa de 96 pocillos de fondo en V para sedimentar las células. A continuación, retire con cuidado 150 ml de medio y reemplazar con fresco 150 ml de cRPMI sin alterar el sedimento celular. Repite 2 veces más (incluyendo centrifugación) para lavar suficientemente células.
  10. Después de la última centrifugación y adición de 150 l cRPMI, resuspender el sedimento celular con una pipeta multicanal y añadir toda la mezcla de células / virus (aproximadamente 200 l) de cada pocillo de forma independiente a 800 l de cRPMI en un pozo de un tejido de 24 pocillos placa de cultivo.
  11. Colocar la placa en 5% de CO 2 tejido cultura incubadora a 37 ° C.
  12. Cada dos días, retire 100 l de sobrenadante de la superficie de la cultura así y lo transfieren a una U de 96 pocillosplaca -fondo y almacenar congeladas a -80 ° C hasta realizar el ensayo de cuantificación de virus. NOTA: La disposición cuidadosa de los sobrenadantes en placas de 96 pocillos permitirá la transferencia de pipeta multicanal de sobrenadantes de cultivo durante la cuantificación a través de un virión de la transcriptasa inversa (RT) de ensayo radiomarcado. Cada plato debe contener muestras de un estándar de la infección con el fin de normalizar la variación inter-placa en el ensayo de lectura RT.
  13. Después de retirar cada muestra de 100 l, dividir celdas 1: 2 por las células se resuspenden a fondo y la eliminación de la mitad del volumen restante (450 l). Restaurar volumen original (1 ml) mediante la adición de 550 l de cRPMI fresco a cada pocillo.

7. Análisis de la transcriptasa inversa (RT) en sobrenadantes de cultivo de células

Protocolo adaptado de Ostrowski et al 40.

  1. Configure campana de seguridad biológica en una instalación BSL-3 para su uso con materiales radiactivos.
    1. Coloque papel absorbente en hood y reemplazar aspirador para aspirador designado para el uso radiactivo. Nota: Todos los residuos radiactivos debe deshacerse del mismo con arreglo a las normas de seguridad.
  2. Añadir 1-2 l de 10 mCi / ml de [α- 33 P] dTTP y 4 l de 1 M de ditiotreitol (DTT) a cada alícuota de 1 ml de mezcla maestra RT (ver Tabla 10 y Ostrowski et al. 40).
  3. Mezclar cuidadosamente cada tubo de 1.5 ml de la mezcla RT maestro, TDT, y [α- 33 P] dTTP con una pipeta 1.000 l y traslado a un canal estéril.
  4. Vierta 25 l de la etiqueta RT mezclan en cada pocillo de placas de 96 pocillos PCR de paredes finas. Nota: incluir espacio para un control positivo (infección MJ4 WT) y control negativo (infección simulada).
  5. Añadir 5 l de cada sobrenadante a la placa de PCR que contiene la mezcla maestra RT.
  6. Sellar la placa de PCR con cubierta de lámina adhesiva e incubar durante 2 horas a 37 ° C en un termociclador. Por razones de seguridad, rinpuntas de pipeta se con Amphyl y disponer de consejos en pequeño recipiente que contienen residuos Amphyl, que posteriormente serán desechadas con la basura radiactiva.
  7. Después de la incubación, hacer pequeños agujeros en la cubierta de aluminio usando un 200 l pipeta multicanal. Nota: Si las puntas de pipeta tocan líquido en el pozo, sustituyen las puntas antes de pasar a la siguiente columna o fila.
  8. Mix muestras 5x y la transferencia de 5 l de cada muestra de papel a la DE-81. Deje secar al aire 10 min.
  9. Blots Lavado 5x con 1x SSC (cloruro de sodio, citrato de sodio), y luego 2 veces con etanol al 90% a 5 min por lavado. Deje que se seque al aire.
    1. Coloque cada blot en un recipiente de lavado separado, tal como una caja de almacenamiento sandwich, añadir una cantidad suficiente de tampón de lavado (1x SSC o 90% de EtOH) para cubrir blot, y agitar durante 5 min.
    2. Retirar el tampón de lavado en un recipiente separado y repetir. Nota: Los 3 primeros lavados se consideran radiactivos y deben desecharse adecuadamente. Los últimos 2 lavados pueden ser eliminados con regularidad.
  10. Una vez seco, el cocheefully envolver blot en Saran Wrap y exponer a un phosphoscreen en un casete cerrado herméticamente durante la noche a temperatura ambiente.
  11. Analizar phosphoscreens con un PhosphorImager y cuantificar las transcripciones radiactivos.
  12. Dibuja un círculo alrededor de cada señal radiactiva usando software OptiQuant. Grafica los valores de unidad de luz digital (UCD) para generar curvas de replicación.
  13. Con el fin de generar puntuaciones capacidad de replicación, los valores de registro se DLU 10-transformado y las pendientes se calcularon utilizando el día 2, 4, y 6 puntos de tiempo. Pendientes de replicación se dividen por la pendiente de WT MJ4 con el fin de generar las puntuaciones de capacidad de replicación. Es importante normalizar basado en los valores MJ4 WT obtenidos a partir de la misma placa de RT para reducir la variabilidad intra-ensayo.

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Resultados

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Para ejecutar correctamente este protocolo, lo que crea un plásmido proviral capaz de ensamblar completamente funcionales, infecciosas quimeras Gag-MJ4, el gran cuidado se debe tomar para generar los amplicones PCR apropiados. Determinación de si la PCR ha generado el amplicón de la mordaza de tamaño adecuado es crucial. Los productos deben estar dentro de 100 pares de bases (pb) de la amplificación de aproximadamente 1700 pb se muestra en la Figura 1A. La longitud exacta de este fragmento vari...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Debido a la longitud y el carácter técnico de este protocolo, hay varios pasos que son fundamentales tanto para la construcción exitosa de plásmidos Gag-MJ4 quiméricos, así como para la cuantificación de la capacidad de replicación viral. Aunque la estrategia de clonación basado enzima de restricción para la introducción de genes gag extranjera en MJ4 descrito en este protocolo tiene numerosas ventajas sobre los métodos basados ​​en la recombinación utilizadas anteriormente, el protocolo puede ser técnicamente ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los investigadores agradecen a todos los voluntarios de Zambia que participaron en este estudio y a todo el personal del Proyecto de Investigación del VIH Zambia Emory en Lusaka que hizo posible este estudio. Los investigadores desean agradecer a Jon Allen, Smita Chavan y Mackenzie Hurlston por la asistencia técnica y la gestión de las muestras. También nos gustaría agradecer al Dr. Mark Brockman por sus discusiones y su generosa donación de las células GXR25.

Este estudio fue financiado por R01 AI64060 y R37 AI51231 (EH) y la Iniciativa Internacional para la Vacuna contra el SIDA. Este trabajo fue posible en parte gracias al generoso apoyo del pueblo estadounidense a través de la Agencia de los Estados Unidos para el Desarrollo Internacional (USAID). Los contenidos son responsabilidad de los autores del estudio y no reflejan necesariamente las opiniones de USAID o del Gobierno de los Estados Unidos. Este trabajo también fue apoyado, en parte, por el Centro de Virología del Centro Emory para la Investigación del SIDA (Subvención P30 AI050409). DC y JP fueron apoyados en parte por Action Cycling Fellowships. Este trabajo fue financiado en parte por la beca base del Centro Nacional de Investigación de Primates de Yerkes (2P51RR000165-51). Este proyecto también fue financiado en parte por el Centro Nacional de Recursos de Investigación P51RR165 y actualmente cuenta con el apoyo de la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación/OD P51OD11132.

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Materiales

ensayo de cuantificación de transcriptasa inversa fuerte

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
de PCRstrong>
strongGOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, desalt estándar
VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, desalt estándar
GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, desalinización estándar
BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, desalt estándar
MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, desalt estándar
MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCCTTCTAGC 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, desalt estándar
BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, desalt estándar
GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, desalt estándar
For3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, desalar estándar
GagR6: 5' CTGTATCATCTCTCCTCCTG 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, desalt estándar
Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDTDNAOligo personalizado25 nmol, desalación estándar
Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, desalinización estándar
CoolRack PCR 96 XTBiocisionBCS-529
CoolRack M15BiocisionBCS-125
Agua libre de nucleasasFisherSH30538FSFabricado por Hyclone
QIAamp Viral RNA Mini KitQiagen52906
Simport PCR 8 Tiras, Azul (Tapa Plana)Sistema
SuperScript IIILife Technologies/Invitrogen12574035
Phusion Hot-start II ADN polimerasaFisherF-549L
PCR MezclaRoche4638956001
Agarosa, alta resistencia al gelFisher50-213-128
TAE 10XLife Technologies/InvitrogenAM9869
Promega 1 kb Escalera de ADNFisherPRG5711Fabricado por Promega
Sybr Safe DNA Gel Stain, 10,000xLife Technologies/InvitrogenS33102
Wizard SV Gel y Sistema de limpieza para PCRPromegaA9282
Hojas de afeitar de un solo filoFisher12-640Fabricado por Surgical Design
Thermocycler, PTC-200MJ Research
Microbiology & Reactivos de clonación
LB, MillerFisherBP1425-2
LB Broth, LennoxFisherBP1427-2
Estéril 100 x 15 mm placas de Petri de poliestirenoFisher08-757-12
Ampicilina sal sódicaSigma-AldrichA9518-5G
Falcon 14 ml Tubos de polipropileno de fondo redondoBD Biosciences
Endonucleasa de restricción NgoMIVNueva Inglaterra BioLabsR0564L
Endonucleasa de restricción de BclINueva Inglaterra BioLabsR0160L
Endonucleasa de restricción HpaINueva Inglaterra BioLabsR0105L
T4 ADN ligasa, 5 U/μ lRoche10799009001
células competentes JM109, >108 cfu/μ gPromegaL2001
PureYield sistema de minipreparación de plásmidoPromegaA1222
Safe Imager 2.0 Blue Light TransilluminatorInvitrogenG6600
Microfuge 18 centrífugaBeckman Coulter367160
Cell Culture Reagents
Amphyl limpiador/desinfectanteFisher22-030-394
Fugene HD, 1 mlVWRPAE2311Fabricado por Promega
Bromuro de hexadimetrina (Polybrene)Sigma-AldrichH9268-5G
Placas Costar, 6 pocillos, planasFisher07-200-83Fabricado por Corning Life
Placas Costar, 24 pocillos, planasFisher07-200-84Fabricado por Corning Life
Placas Costar, 96 pocillos, redondasFisher07-200-95Fabricado por Corning Life
Frascos, Corning filter top/cuello inclinado, 75 cm2Fisher10-126-37
Frascos, Corning filter top/cuello inclinado, 150 cm2Fisher10-126-34Fabricado por Corning Life
Tubos cónicos, 50 ml, tapón azulFisher14-432-22Fabricado por BD Biosciences
Tubos cónicos, 15 ml, tapón azulFisher14-959-70CFabricado por BD Biosciences
Trypsin-EDTAFisherMT25052CIFabricado por Mediatech
RPMI, 500 mlLife Technologies/Invitrogen11875-119
DMEM, 500 mlLife Technologies/Invitrogen11965-118
Penicilina/ Estreptomicina/Glutamina, 100xLife Technologies/Invitrogen10378-016
PBS con magnesio y calcio, 500 mlLife Technologies/Invitrogen14040-133
PBS sin magnesio y calcioLife Technologies/Invitrogen20012-050
Tubos Sarstedt, colores variadosSarstedt72.694.996
Bandejas de depósito para Multicanal, 55 mlFisher13-681-501
DEAE-DextranoFisherNC9691007
Corning 96 pocillos transparente microplaca tratada con cultivo de tejidos con fondo en VFisher07-200-96Fabricado por Corning Life
HEPES, 1 M Solución tampónLife Technologies/Invitrogen15630-080
FBS, Definido, 500 mlFisherSH30070 03
X-galVWRPAV3941Fabricado por Promega
Glutaraldehído, Grado II, 25% en H2OSigma-AldrichG6257-100ML
1 M Solución de cloruro de magnesioSigma-AldrichM1028-100ML
Solución de formaldehído, para biología molecular, 36.5%Sigma-AldrichF8775-500ML
Potasio hexacianoferrato (II) trihidratoSigma-AldrichP9387-100G
Hexacianoferrato de potasio(III)Sigma-AldrichP8131-100G
Centrífuga Allegra X15-RBeckman Coulter392932
TC10 contador de células automatizadoBio-Rad1450001
VistaVision microscopio invertidoVWR
dTTP, [α-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCiPerkin-ElmerNEG605H001MC
1 M Tris-Cl, pH 8.0Life Technologies/Invitrogen 15568025Debe ajustarse a pH 7.8 con KOH
2 M Cloruro de potasio (KCl)Life Technologies/InvitrogenAM9640GAdjust a 1 M solución
0,5 M EDTALife Technologies/Invitrogen15575-020
Nonidet P40Roche11333941103
Ácido poliadenilico (Poly rA) sal de potasio Reactivo de Midland Co.P-3001
Oligo d(T) imprimaciónLife Technologies/Invitrogen18418-012
Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815-1G
SR, Pantalla de Fósforo de Super Resolución, PequeñaPerkin-Elmer7001485
Corning Costar Thermowell Modelo de placa de 96 pocillos (M) PolicarbonatoFisher07-200-245Fabricado por Corning Life
Cinta de sellado de aluminio de microplaca de 96 pocillos Corning, no estérilFisher07-200-684Fabricado por Corning Life
Papel de intercambio aniónico DE-81Whatman3658-915
Citrato trisódico dihidratadoSigma-AldrichS1804-1KG
Cloruro de sodioFisherS671-3
Cassette de autorradiografíaFisherFB-CA-810
Criba de almacenamiento ciclónico Packard
de RT-PCR de un solo paso Daigger EF3647BX 352059<td colspan="4">

Referencias

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