Factor de Crecimiento de electrospinning Liberar microesferas en Fibrosa andamios

Resumen

Este protocolo combina electrospinning y microesferas para desarrollar andamios de ingeniería tisular para dirigir neuronas. El factor de crecimiento nervioso se encapsuló dentro de microesferas de PLGA y se electrohiló en andamios fibrosos de ácido hialurónico (HA). La bioactividad proteica se probó sembrando los andamios con ganglios primarios de la raíz dorsal del pollito y cultivando durante 4-6 días.

Resumen

Este procedimiento describe un método para fabricar un sustrato multifacético para dirigir el crecimiento de las células nerviosas. Este sistema incorpora señales mecánicas, topográficas, adhesivas y químicas. Las propiedades mecánicas están controladas por el tipo de material utilizado para fabricar las fibras electrohiladas. En este protocolo utilizamos un 30% de ácido hialurónico (AH) metacrilado, que tiene un módulo de tracción de ~500 Pa, para producir un andamio fibroso suave. El electrogiro sobre un mandril giratorio produce fibras alineadas para crear una señal topográfica. La adhesión se logra recubriendo el andamio con fibronectina. El desafío principal que se aborda aquí es proporcionar una señal química a través de la profundidad del andamio durante períodos prolongados. Este procedimiento describe la fabricación de microesferas de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) que contienen factor de crecimiento nervioso (NGF) e impregnación directa del andamio con estas microesferas durante el proceso de electrohilado. Debido al duro entorno de producción, que incluye altas fuerzas de horma y cargas eléctricas, la viabilidad de la proteína se mide después de la producción. El sistema proporciona liberación de proteínas durante más de 60 días y se ha demostrado que promueve el crecimiento de las células nerviosas primarias.

Introducción

Uno de los retos actuales en la ingeniería de tejido neural es la creación de un conducto nervioso (NC) que imita la matriz extracelular, donde los nervios crecen naturalmente. La investigación ha demostrado que las células responden a varios factores en su entorno, incluyendo las señales químicas ^1-3 mecánica, topográficos, adhesivo y. Uno de los principales desafíos en este campo consiste en determinar la combinación adecuada de señales y la fabricación de un sistema que puede mantener las señales durante un período prolongado para apoyar el crecimiento celular ^4. Neuronas periféricas se sabe que prefieren un sustrato blando, ser dirigidos por....

Protocolo

1. agua / aceite / agua Doble Emulsión Microsphere Producción

1. En primer lugar preparar 2% y 0,5% w / v de las soluciones de alcohol polivinílico (PVA) en agua desionizada. Revuelva las soluciones a 50 ° C hasta que se aclare, esto puede tardar varias horas. Preparar una solución de 2% v / v de alcohol isopropílico en agua desionizada.
2. Preparar una solución acuosa de proteína hidrófila deseada. La siguiente tabla proporciona ejemplos de formulaciones.

Ta....

Resultados

Las microesferas 50 ± 14 micras de diámetro con una proteína de encapsulación más del 85% se han producido y electrospun en andamios consistentemente. Tamaño se determinó mediante la formación de imágenes de muestras de microesferas de tres lotes de producción separadas. Las imágenes en las que capturaron en un microscopio óptico y longitudes donde mide utilizando software laboratorio comercial. Figura 1 muestra un histograma de la distribución de tamaños. Tasa de encapsulación también se ensayó a parti.......

Discusión

Muchos estudios han demostrado que las células nerviosas pueden ser dirigidas por señales topográficas (alineación de la fibra) y señales químicas (factores de crecimiento) ^{1,2,10,11,35.} Electrospinning es un método fácil para crear fibras alineadas. Los factores de crecimiento estimulan el crecimiento del nervio, pero con el fin de incluirlos en los conductos de los nervios (NC), se requiere un método para la liberación sostenida. Para crear un sistema más robusto con ambas señales, estas dos señales se debe.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DAPI	Invitrogen	D1306
Irgacure 2959	BASF	24650-42-8	Proteger de la luz
PEO 900 kDa	Sigma-Aldrich	189456
Metacriloxetil tiocarbamoil rodamina B	Polysciences, Inc.	23591-100	Prepare la solución madre en
la bomba de jeringa	KD Scientific	KDS100
Fuente de alimentación	ES30P-5W		alto voltaje
	Triem Electric Motors, Inc	0132022-15	Debe conectarse a un mandril hecho a medida
Tacómetro	Red Almacén de herramientas	ESI-330	Úselo para monitorear la velocidad
del mandrilSistema de curado puntual UV Omnicure con adaptador de colimación	EXFO	S1000
Agujas	Fisher Scientific	14-825-16H
Cubreobjetos	Fisher Scientific	12-545-81
Alcohol polivinílico	Sigma-Aldrich	P8136-250G
Alcohol isoporopílico	Sigma-Aldrich	I9030-500mL
Albúmina sérica bovina (BSA)	Fisher Scientific	BP9703-100
BSA-FITC	Sigma-Aldrich	080M7400
β-Factor de crecimiento nervioso (NGF)	R& D Systems	1156-NG
65:35 Ácido poliláctico-glicólico (PLGA)	Sigma-Aldrich	1001554270
diclorometano	Sigma-Aldrich	34856-2L
Coomassie (Bradford) Ensayo de proteínas	Thermo Scientific	1856209
3-(trimetoxisilil)metacrilato de propilo	Sigma-Aldrich	1001558456
Fibronectina	Sigma-Aldrich	F2006
DMEM	Lonza	12-604F
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
PBS	Hyclone	SH30256.01
Glutamina	Fisher Scientific	G7513
Pen-Strep	Sigma-Aldrich	P4333
Paraformaldehído	Alfa Aesar	A11313

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