Artículo de método
Este procedimiento muestra cómo dirigirse a las interneuronas en el prosencéfalo del ratón en desarrollo mediante electroporación en el útero. Esta técnica fue particularmente eficiente para lograr la expresión génica selectiva en subtipos de interneuronas destinadas a las capas superficiales de la corteza.
El estudio del sistema nervioso (CNS) central de la maduración depende de la orientación genética de poblaciones neuronales. Sin embargo, la tarea de restringir la expresión de genes de interés para los subtipos neuronales específicas ha demostrado ser notablemente difícil debido a la escasez relativa de los elementos específicos del promotor. Interneuronas GABAérgicas constituyen una población neuronal con amplia diversidad genética y morfológica. De hecho, más de 11 subtipos diferentes de interneuronas GABAérgicas se han caracterizado en la corteza del ratón 1. Aquí presentamos un protocolo adaptado para la orientación selectiva de poblaciones GABAérgicas. Hemos logrado subtipo dirección selectiva de las interneuronas GABAérgicas utilizando el elemento potenciador de la transcripción homeobox factores Dlx5 y Dlx6, homólogos de la (DLL)-gen distal Drosophila menos 2,3, para conducir la expresión de genes específicos a través de la electroporación en el útero.
La mayor parte de las interneuronas GABAérgicas corticales se originan a partir de dos estructuras embrionarias transitorias nombradas las eminencias ganglionares medial y caudal (MGE y CGE, respectivamente) 4. Parvalbúmina y somatostatina expresar interneuronas se originan en el MGE mientras Calretinina (Cr), vasointestinal péptido (VIP) y Reelin (Re) que expresa interneuronas son originarios de la CGE. Estos subtipos de interneuronas pueden ser distinguidos por sus fechas de nacimiento. MGE subtipos derivados nacen entre el día embrionario 9.5 (E9.5) y E16.5 5,6. En contraste, las interneuronas CGE derivadas nacen de E12.5 E18.5 a través con s....
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Todos los animales fueron tratados de acuerdo con las normas y directrices del Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de la Escuela de Medicina de NYU.
Las cepas de ratón
Ratones hembra Swiss Webster proporcionadas por TACONIC se utilizaron para estos experimentos. Con el fin de centrarse específicamente en las interneuronas de la capa superficial, se utilizaron embriones E15.5.
Nota: El plásmido usado en este trabajo (Dlx5 / plásmido 6.eGFP 3 g / l) se generó usando técnicas de clonación estándar. El ADNc de EGFP se clonó en un / 6-Pmin-poliA plásmido ....
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Se adaptó la técnica de electroporación en el útero para lograr el tipo de célula orientación específica de las neuronas maduras. Para conducir la expresión de EGFP en interneuronas derivados de CGE, se utilizó el elemento potenciador Dlx5 / 6 y restringido nuestro inyecciones a E15.5, la etapa en que la mayoría de las interneuronas derivados de CGE se generan. Hemos llevado a cabo el análisis en P8 y P15 11 (Figuras 1 y 2). Se confirmó el origen ventral de .......
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Limitaciones de la Técnica
Si bien esta técnica permite la célula de análisis autónoma de procesos celulares, no es adecuado para el análisis de la población. Los electroporaciones son muy escasos con menos de mil células por electroporación cerebro. Como consecuencia, la técnica no se puede utilizar para evaluar las consecuencias de comportamiento derivados de la manipulación genética de las interneuronas derivados de CGE.
Mientras electroporaciones llevaron a c.......
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Los autores no tienen nada que revelar.
Estamos muy agradecidos a Lihong Yin para la asistencia técnica. NVD es un destinatario de un Premio al Investigador Joven NARSAD y también es apoyado por subvenciones del NIH (5 K99 MH095825-02). La investigación en el laboratorio Fishell es apoyado por el Instituto Nacional de Salud, Instituto Nacional de Salud Mental (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) y la Fundación Simons.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Electroporador con pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5 mm paletas electrodos | Protech International | CUY650P5 | |
| Almohadilla térmica | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Sistemas de Anestesia | Harvard Aparato 726425 | ||
| Tijeras de Operación Delicadas 4.75" Recta Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Trenza Negra de Seda 18" C-1 Caja 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Pinzas de Aplicación 5.5 " | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Tijeras de Abrazadera | Roboz | RC-4894 | |
| Pinzas de Sujeción | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Tubo capilar de vidrio | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm |
| ID Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Tecnologías de vida estériles PBS | 20012-027 |
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