Culturas alternativas para Pluripotentes Stem Cell Production, mantenimiento y análisis genético

Kevin G. Chen; Rebecca S. Hamilton; Pamela G. Robey; Barbara S. Mallon

doi:10.3791/51519

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Culturas alternativas para Pluripotentes Stem Cell Production, mantenimiento y análisis genético

12.2K vistas

⸱

DOI:

10.3791/51519

⸱

24 de julio de 2014

Kevin G. Chen¹ , Rebecca S. Hamilton¹ , Pamela G. Robey² , Barbara S. Mallon¹

¹NIH Stem Cell Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, ²Craniofacial and Skeletal Diseases Branch, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos protocolos de cultivo de células madre pluripotentes humanas (hPSC), basados en el crecimiento de células individuales disociadas de monocapa (NCM) de tipo no colonia. Este nuevo método, que utiliza inhibidores de la quinasa asociada a Rho o la isoforma de laminina 521 (LN-521), es adecuado para producir grandes cantidades de hPSC homogéneas, la manipulación genética y el descubrimiento de fármacos.

Resumen

Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) son muy prometedoras para la medicina regenerativa y las aplicaciones biofarmacéuticas. En la actualidad, el cultivo óptimo y la expansión eficiente de grandes cantidades de hPSC de grado clínico son cuestiones críticas en las terapias basadas en hPSC. Convencionalmente, las hPSC se propagan como colonias en sistemas de cultivo alimentados y sin alimentadores. Sin embargo, estos métodos tienen varias limitaciones importantes, como el bajo rendimiento celular y la generación de células heterogéneamente diferenciadas. Para mejorar los métodos actuales de cultivo de hPSC, recientemente hemos desarrollado un nuevo método, que se basa en el cultivo monocapa (NCM) de tipo no colonia de células individuales disociadas. Aquí, presentamos protocolos detallados de NCM basados en el inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK) Y-27632. También proporcionamos nueva información sobre el cultivo de NCM con diferentes moléculas pequeñas como Y-39983 (inhibidor de ROCK I), fenilbenzodioxano (inhibidor de ROCK II) y tiazovivina (un nuevo inhibidor de ROCK). Ampliamos aún más nuestro protocolo básico para cultivar hPSCs en proteínas extracelulares definidas, como la laminina isoforma 521 (LN-521) sin el uso de inhibidores de ROCK. Además, basándonos en NCM, hemos demostrado una transfección o transducción eficiente de ADN plasmídico, partículas lentivirales y microARN basados en oligonucleótidos en hPSC con el fin de modificar genéticamente estas células para análisis moleculares y descubrimiento de fármacos. Los métodos basados en NCM superan las principales deficiencias del cultivo de tipo colonia y, por lo tanto, pueden ser adecuados para producir grandes cantidades de hPSC homogéneas para futuras terapias clínicas, investigación con células madre y descubrimiento de fármacos.

Introducción

La capacidad de hPSCs para diferenciar hacia los tejidos adultos multilinaje ha abierto nuevas vías para el tratamiento de pacientes que sufren de enfermedades graves que involucran cardiovasculares, hepáticas, pancreáticas, y los sistemas neurológicos ^1-4. Varios tipos de células derivadas de hPSCs también proporcionarían plataformas móviles robustos para el modelado de la enfermedad, la ingeniería genética, la detección de drogas y ^1,4 pruebas toxicológicas. La cuestión clave que garantiza sus futuras aplicaciones clínicas y farmacológicas es la generación de un gran número de hPSCs de grado clínico a través de cultivo celular in vitro.