Artículo de método

La comprensión temprana Organogenesis Usando una simplificado

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DOI:

10.3791/51526

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12 de enero de 2015

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1Developmental and Stem Cell Biology, Hospital for Sick Children, 2Children's Health Research Institute, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, University of Western Ontario, 4Neurosciences and Mental Health, Hospital for Sick Children, 5Department of Paediatrics, University of Western Ontario

En este artículo

Resumen

El embrión de Xenopus laevis sigue siendo excepcionalmente útil en el estudio del desarrollo temprano debido a su gran tamaño y facilidad de manipulación. Se proporciona un protocolo simplificado para el protocolo de hibridación in situ de montaje completo que se puede utilizar en la identificación de órganos específicos en este sistema modelo.

Resumen

La organogénesis es el estudio de cómo se especifican los órganos y luego adquieren su forma y funciones específicas durante el desarrollo. El embrión de Xenopuslaevis es muy útil para el estudio de la organogénesis porque su gran tamaño los hace muy adecuados para identificar órganos en las primeras etapas de la organogénesis. En este momento, el método principal utilizado para identificar un órgano o primordio específico es la hibridación in situ de montaje completo con sondas de ARN antisentido marcadas específicas de un gen que se expresa en el órgano de interés. Además, es relativamente fácil manipular genes o vías de señalización en Xenopus y la hibridación in situ permite analizar los cambios en la presencia o morfología de un órgano diana. La hibridación in situ de montaje completo es un protocolo de varios días con muchos pasos involucrados. Aquí proporcionamos un protocolo simplificado con un número reducido de pasos y reactivos utilizados que funciona bien para los ensayos de rutina. Los robots de hibridación in situ han facilitado enormemente el proceso y detallamos cómo y cuándo utilizamos esa tecnología en el proceso. Una vez que se completa una hibridación in situ, capturar la mejor imagen del resultado puede ser frustrante. Proporcionamos asesoramiento sobre cómo optimizar la obtención de imágenes de los resultados de hibridación in situ. Aunque el protocolo describe la evaluación de la organogénesis en Xenopus laevis, es casi seguro que el mismo protocolo básico puede adaptarse a Xenopus tropicalis y otros sistemas modelo.

Introducción

El patrón de expresión de un gen específico es una información importante para determinar el papel potencial de ese gen en el desarrollo de un órgano o tipo de célula específico. En pocas palabras, si no se expresa en el momento y lugar adecuados, es poco probable que juegue un papel clave. En Xenopus, como en la mayoría de los embriones tempranos, el ensayo más comúnmente utilizado para detectar la expresión de un gen es la hibridación in situ de montaje completo utilizando sondas de ARN antisentido marcadas. El uso de la tinción de anticuerpos para evaluar la expresión de un gen en Xenopus se está volviendo más común a medida que los investigadores descubren anticuerpos, generalmente generados contra proteínas de mamíferos, que reaccionan de manera cruzada al homólogo de Xenopus o generan sus propios 1-3. Sin embargo, la gran mayoría de los estudios sobre la organogénesis de Xenopus todavía utilizan sondas de ARN antisentido. Cuando se utilizan anticuerpos, cada anticuerpo individual a menudo requiere una optimización para la concentración de anticuerpos primarios o los protocolos de fijación. Por el contrario, el protocolo para hibridaciones in situ es esencialmente invariante para diferentes sondas. El concepto básico es relativamente simple y se ha establecido un excelente protocolo estándar 4. Nuestro protocolo es una versión simplificada del protocolo original 4 que sigue proporcionando una excelente detección de los patrones de expresión génica en el embrión temprano. Los embriones se fijan y luego se preparan para la hibridación cambiando las soluciones y las temperaturas de modo que permita la unión de alta rigurosidad de la sonda de ARN antisentido marcada a su ARNm objetivo. La sonda no unida se lava y los embriones se preparan para la unión de un anticuerpo contra la etiqueta de las sondas de ARN. A continuación, el exceso de anticuerpos se elimina y se utiliza una reacción de color enzimática para localizar el lugar al que se une la sonda de ARN en el embrión. En la actualidad hay una serie de líneas transgénicas de Xenopus que impulsan la expresión de proteínas fluorescentes en tejidos específicos y están disponibles en los centros de almacenamiento de Xenopus, como el National Xenopus Resource en Woods Hole. Si bien es muy útil para muchos experimentos que requieren examinar la organogénesis en embriones vivos, esta opción requiere un alojamiento separado para las líneas transgénicas.

La hibridación in situ puede delinear claramente dónde se formarán órganos específicos o tipos de células en el embrión temprano (Figura 1). La técnica es notablemente sensible dado que se puede detectar la expresión génica en un pequeño número de células en un solo embrión 5. Sin embargo, la hibridación in situ utilizando la intensidad de la tinción colorimétrica no se considera cuantificable porque la reacción de color no es lineal. A pesar de la dificultad para cuantificar la intensidad de la tinción, los cambios en la expresión suelen ser bastante notables; particularmente cuando la hibridación in situ muestra aumentos o disminuciones cuantificables en el tamaño de los dominios de expresión 6,7.

Las claras ventajas de la hibridación in situ de montaje completo la convierten en un ensayo crítico en el estudio del desarrollo temprano. Sin embargo, requiere mucho tiempo y muchos pasos a lo largo de varios días. Este protocolo es una versión simplificada del protocolo estándar que elimina varios pasos sin reducir la calidad del resultado in situ. La simplificación también elimina las fuentes de variabilidad, lo que facilita la resolución de problemas si una hibridación in situ no es óptima. En concreto, hemos eliminado el uso de tratamientos con proteinasa K y ARNasa del embrión, dos pasos que pueden depender de la calidad del reactivo y que también pueden reducir la intensidad de la señal si se exageran. El protocolo también proporciona cierto grado de ahorro de costos debido a la eliminación del uso de varios reactivos. Por último, este protocolo también proporciona algunas pautas sencillas para mejorar la captura de imágenes de los resultados de la hibridación in situ. Aunque este protocolo está optimizado para el trabajo en embriones de Xenopus, es probable que al menos algunas de las simplificaciones sean aplicables al trabajo de hibridación in situ en otros sistemas embrionarios.

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Protocolo

1. Preparación de embriones

  1. Si no se hace rutinariamente como parte del cultivo de embriones, de-jalea los embriones utilizando 2,5% de cisteína, pH 8,0 antes de la fijación 8. Aunque no es absolutamente necesario, es útil a continuación, quitar manualmente el sobre fertilización antes de la fijación utilizando unas pinzas finas.
    1. Utilice pipetas Pasteur de vidrio para transferir los embriones. La pipeta no es lo suficientemente amplia como para transferir los embriones a fin de utilizar una pluma de diamante para cortar la pipeta de vidrio en un punto lo suficientemente amplia como para recoger un embrión. Eliminar los bordes afilados de las pipetas después del corte pasando rápidamente la punta de corte a través de la llama de un mechero Bunsen para fundir los bordes afilados.
      NOTA: El cuidado necesita ser tomado, como el vidrio puede todavía ser lo suficientemente caliente como para causar quemaduras a pesar de que parece haber enfriado mediante inspección visual.
  2. Realizar la fijación de embriones en etapas. En primer lugar, preparar viales de vidrio para su uso en la fijación del embrión. Utilice estos viales para todos los pasos incluidos definitivaalmacenamiento. Utilice viales que son claras con una buena junta de teflón en la tapa, lo que permite el seguimiento de los embriones durante todos los pasos del proceso. Etiquetar los viales con información experimental apropiado usando un marcador permanente y luego cubrir la etiqueta con cinta adhesiva transparente, ya que incluso marcador permanente se perderá en el curso del procedimiento debido a la utilización de alcoholes y otros disolventes.
    1. Utilice Mempfa para fijar los embriones. Hacer un stock de 8% de paraformaldehído en lotes de 50-100 ml a la vez. Utilice aproximadamente el 75% de la H 2 O y se requiere calor a 50-60 ° C, la cual es necesaria para obtener el paraformaldehído en solución.
      NOTA: Esta solución es ligeramente diferente que el MEMFA utiliza en las versiones protocolo publicado de edad en que se utiliza paraformaldehído en lugar de formaldehído.
    2. Añadir 2-3 gotas de NaOH 10N o hasta que el pH es de aproximadamente 7,5 (papel de pH uso para comprobar pH). El paraformaldehido es muy tóxico, por lo tanto, generar la solución madre en una campana de humos. Una vez que el párrafoformaldehído está en disolución, filtrar la solución a través de papel Whatman en un recipiente fresco y añadir H2O hasta el volumen final. Si es necesario, almacenar la solución de paraformaldehído al 4 ° C durante 1-2 semanas.
    3. Montar los componentes restantes de la solución de fijación Mempfa (Tabla 1). Asegúrese de que la concentración final de trabajo de paraformaldehído es del 4%. Guarde todos los componentes de la solución de fijación a 4 ° C como las acciones.
    4. Con una pipeta de cristal tallado, fijar los embriones mediante la adición de los embriones a los viales de vidrio etiquetados que se han llenado con los aproximadamente 3.4 ml de solución Mempfa (Tabla 1). Evite fijar más de 20 a 30 embriones por vial. Añadir los embriones con un mínimo de transferencia de líquido del medio de embrión. Fijar embriones en solución Mempfa durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
    5. Para estructuras endodermo finales de realizar el en situs en aislado manualmente la tripa y endodermo derivados 9,10, Lo que permite una buena penetración de la sonda y también evita la tinción de la cavidad.
    6. Guarde una solución de metanol al 100% a -20 ° C. Después de la fijación de paraformaldehído, sustituir la solución Mempfa con aproximadamente 4 ml de la -20 ° C, 100% de metanol durante el almacenamiento de los embriones.
    7. Agitar los viales después de la adición del metanol para evitar que los embriones se pegue a la de vidrio o de otros embriones. También, asegúrese de que los viales se cierran herméticamente porque el metanol puede evaporarse en el congelador con el tiempo si suelta.
      NOTA: Los embriones se puede almacenar durante al menos un año, y probablemente más largo, en el metanol antes de la tinción sin pérdida de la calidad de hibridación in situ.

2. Preparación de la sonda

  1. Utilice 1-2 g de ADN plantilla para hacer las sondas marcadas con digoxigenina. Cut plásmido que contiene la secuencia de ADN apropiada en el extremo 5 'del gen de interés con un enzima de restricción adecuado para That vector para generar sondas antisentido.
    NOTA: El plásmido debe tener un sitio de unión de ARN polimerasa apropiada (por ejemplo, T7, T3, o SP6).
  2. Permitir que el ADN, el agua, mezclar y NTP tampón de polimerasa para calentar a temperatura ambiente antes de montar la reacción de síntesis de la sonda. Añadir los componentes de la reacción de síntesis de ARN a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en el orden que se enumeran en la Tabla 2. Ajustar el volumen de agua añadida para llevar el volumen total de la reacción de síntesis de la sonda a 20 l. Montar la reacción a temperatura ambiente ya que los componentes del tampón de la polimerasa pueden precipitar el ADN de la plantilla cuando se encuentra en altas concentraciones y frío.
  3. Se incuba la reacción de transcripción durante 2 horas a 37 ° C.
    NOTA: Las incubaciones de poco más de dos horas conduce a efectos adversos, pero también muestran poco aumenta el rendimiento. Si se incubaron durante una hora, el rendimiento se reducirá, pero todavía suficiente para hacer una buena sonda.
    1. A la espera de la reacción de transcripción a fin, hacer un gel de agarosa que se utilizará para probar la calidad de la sonda. Derretir 1 g de agarosa en 100 ml de tampón 1x TAE (ver Tabla 1) por calentamiento de la solución a la temperatura de ebullición. Retire la solución del calor cuando el polvo de agarosa se haya disuelto completamente.
    2. Añadir 2 l de bromuro de etidio solución madre (10 mg / ml) a aproximadamente 100 ml de gel de agarosa cuando la agarosa se ha enfriado a aproximadamente 60 ° C para permitir la visualización de ARN bajo luz ultravioleta (UV).
      NOTA: Esta solución de gel de agarosa se puede mantener en una incubadora a 60 °, de modo que los geles futuras se pueden verter sin derretirse repetido. Tenga cuidado en el manejo de bromuro de etidio debido a la toxicidad potencial.
  4. Añadir 1 l DNAsaI (RNasa libre de grado) a la reacción de transcripción después de la incubación de 2 horas y se incuba durante otros 10 min a 37 ° C para eliminar la plantilla de ADN.
  5. Retire 1 l de la mezcla de reacción acomprobar en la agarosa TAE-gel 1% y el resto (20 l) añadir 80 l de SDS al 1% en tampón TE (10 mM Tris pH 8,0, EDTA 1 mM), 10 l de 5M NH 4 de etilo y 220 l de etanol de frío. Vortex la mezcla vigorosamente y dejar de lado en hielo hasta que se conozcan los resultados de la verificación de la calidad del ARN.
    1. Ejecute los 1 l de ARN retirados antes de la precipitación en la agarosa-TAE gel 1%. Para facilitar la carga en el gel, añadir 4-5 l de agua y 1 l de colorante de carga estándar a la ARN. Ver el ARN en el gel usando un transiluminador de luz UV con el fin de comprobar la calidad de la sonda (véase la discusión).
  6. Precipitar el ARN restante que fue anulada por el hielo en el paso 2.5 al girar en una microcentrífuga a toda velocidad durante 10 a 15 minutos. Trasvasar el sobrenadante con una pipeta de vidrio estirado hacia fuera y dejar secar brevemente.
    1. Resuspender la sonda con 1 ml de tampón de hibridación de ARN (Tabla 1) en el tubo eppendorf. Vortex y briefly calentar el tubo a 37 ° C y agitar de nuevo. Transferir la solución de la sonda a un 15 ml tornillo tubo de poliestireno tapa y rellene hasta 7-10 ml con tampón de hibridación de RNA. Nota: La sonda puede diluirse más (una dilución adicional de 10 veces todavía puede trabajar) a menudo resulta en una baja de fondo, pero las reacciones de tinción también llevará más tiempo.

3. Hibridación in situ

  1. Tome los embriones que se almacenaron en -20 ° C metanol y se deja calentar a temperatura ambiente. Realice todo el procedimiento en los frascos de vidrio. Si diferentes embriones de un grupo van a ser examinado por diferentes sondas, mantenerlos en un solo vial hasta justo antes de añadir las sondas para reducir la variabilidad y el trabajo en el primer día.
    1. Rehidratar los embriones a través de una serie metanol como se indica en la Tabla 3 (véase la Tabla 1 para las recetas de lavado) en preparación para la adición de la sonda. Agite suavemente el embryos después de cada cambio para asegurarse de que no se adhiera a las paredes o entre sí, y el rock los embriones mediante el montaje de los viales en un nutator. Al transferir los líquidos, compruebe el interior de las tapas para asegurarse de que los embriones no han sido atrapados allí.
    2. Una vez en la solución de la sonda, hibridar los embriones durante la noche como se describe en la Tabla 3.
  2. Retire la solución de la sonda. Guarde la sonda utilizada mediante el almacenamiento en unos 15 ml tornillo tubo de poliestireno tapa, se indica la fecha y el número de veces que la sonda se ha utilizado, a -20 ° C.
    NOTA: La misma sonda se puede reutilizar muchas veces para su posterior hibridaciones in situ hasta que las reacciones colorimétricas comienzan a tomar un tiempo anormalmente largo para llegar a la intensidad deseada.
    1. Una vez que se quita la sonda, la preparación de los embriones para la tinción de anticuerpos contra la sonda a través de la serie de lavados descritas en la Tabla 4. Cambiar la temperatura según sea necesario (Tabla 4) por t moverél nutator, con viales de embriones adjuntos, directamente en hornos de hibridación que se establecen en la temperatura adecuada.
    2. Completar el volumen apropiado del MAB + HTS + BR + contra Dig-anticuerpo (Tabla 4) en el momento en que los embriones se incuban en el MAB + HTS + BR solución de bloqueo para que el anticuerpo se bloquea antes de añadir a la embriones. Hacer las soluciones de bloqueo fresco en el día de uso.
  3. Retirar la solución de anticuerpo y comenzar lavados como se indica en la Tabla 5 después de la incubación durante la noche con anticuerpo. Realizar al menos doce 30 min lavados con el fin de preparar para la tinción con el sustrato de fosfatasa alcalina y reducir el fondo tanto como sea posible. Utilice búfer MAB o solución OTC (Tabla 1) para los pasos de lavado.
    NOTA: la solución OTC es TTW que tiene 2 mg / ml de BSA.
    1. Sustituir la última solución de lavado con el sustrato de la fosfatasa alcalina púrpura BM. Realice los reac tinciónya sea en la temperatura ambiente o 37 ° C.
      NOTA: La tinción es más rápida a 37 ° C pero si se deja durante la noche, la tinción de fondo inaceptable a menudo puede ser el resultado. Las reacciones de tinción a menudo requieren tinción durante la noche y la temperatura ambiente es más seguro para esto.
    2. Si se requiere mayor tinción y la solución púrpura BM está adquiriendo un color azul, sustituir la solución de tinción con frescos BM púrpura y poner los tubos en 37 ° C. Si el ARNm diana es muy abundante, poner los embriones en la solución de tinción a 4 ° C durante la noche y luego pasar los embriones a temperatura ambiente o 37 ° C para permitir un mejor seguimiento de la reacción de tinción.
    3. Supervisar nuevas reacciones con cuidado, ya que el tiempo de resultado final varía considerablemente entre los diferentes ARN diana. Por coherencia, detener la reacción de tinción (véase 3.4) cuando no hay nuevos sitios de expresión que surge con incubación más largo. Es importante destacar que, si la hibridación in situ se utiliza como un ensayopara los experimentos que buscan en diferentes grupos de tratamiento, utilizar el mismo tiempo para reacciones de color entre el tratamiento y control de los embriones.
  4. Detener la reacción de tinción y preparar los embriones para el almacenamiento y grabación de imagen cambiando los líquidos tal como se indica en la Tabla 6. No balancee los embriones en esta etapa debido a la eliminación de la mancha puede ser visualizado como coloración violeta del metanol alrededor de los embriones.
    NOTA: A menudo los embriones tienen una tinción con azul de luz de la solución de tinción y el metanol frío puede eliminar al menos parcialmente que, aunque esto no es suficiente para eliminar el fondo pesado o tinción de la cavidad. Metanol frío se refiere a metanol que se mantiene en un congelador a -20ºC.
    1. Rehidratar los embriones y fijar la mancha con Mempfa (Tabla 6). Una vez fijada, retire el Mempfa y lavar los embriones con 25% de metanol.
    2. Retire el metanol 25% y añadir la solución de blanqueo si la eliminación de pigmento endógenose requiere. Tenga cuidado en el manejo de la solución de blanqueo, ya que puede causar quemaduras. Observe el blanqueo de cerca como sucede con relativa rapidez y el grado de blanqueo se puede variar para diferentes efectos (Figura 2).
    3. Deshidratar embriones a través de una serie de metanol al 100% de metanol durante el almacenamiento a largo plazo después de blanqueo, o transferir a PBS para el almacenamiento a corto plazo y la imagen posterior (ver Tabla 6).

4. Imaging embriones

  1. Una vez que un embrión se ha completado el proceso de tinción, imagen del embrión para que se captura la información en que se expresa el gen de interés para un público más amplio. Use 1% de agarosa como fondo para ver los embriones no despejadas.
    NOTA: La agarosa da un fondo azul / gris que contrasta con el embrión y el color azul de la reacción de tinción. También ayuda a difundir sombras molestas y reflexiones que desvían la atención del embrión.
    1. Añadir agarosa al agua y luego llevar a ebullición hasta que la agarosa se encuentra en solución y luego dejar enfriar a 50 antes de verter en la placa de Petri. Al igual que con la solución de gel TAE, almacenar la solución de agarosa en 55 ° C incubadora para múltiples usos. Verter la agarosa a una profundidad de aproximadamente 2 mm en la placa de Petri. Si es necesario, ajustar la profundidad de agarosa para producir un tono ligeramente diferente de la de fondo.
    2. Después de la rehidratación del almacenamiento en metanol a una solución acuosa (PBS o TTW), utilizando una serie de metanol, colocar los embriones en una placa de Petri con la base de agarosa (véase la Tabla 6). Mantenga la solución limpia y, si es necesario, utilizar el filtrado sencilla para eliminar pequeñas partículas que pueden perturbar el fondo limpio de buenas imágenes.
    3. Para la imagen de los embriones de los puntos de vista alternativos, como desde el lado ventral, cortan canales delgados en la agarosa para encajar el embrión utilizando unas pinzas finas y colocar los embriones en esos canales para la orientación (Figura 3 ). Tenga cuidado en la manipulación de los embriones, ya que se dañan fácilmente.
      NOTA: La mayoría de etapas tienen una posición característica que asumen cuando se coloca en solución. Por ejemplo, los embriones blástula etapas tienden a sentarse animales hacia arriba. Una vez que los embriones comienzan a alargarse, ponen de su lado.
  2. Utilice la fuente de luz de fibra óptica para iluminar el embrión a partir de un ángulo pequeño, la creación de sombras sobre el embrión que proporcionan profundidad a la imagen y ayudar a discernir estructuras superficiales. Debido a que el blanqueamiento puede eliminar pigmento que proporciona puntos de referencia útiles, utilizar sombreado para los embriones fuertemente blanqueados.
  3. Desactive los embriones a tinción imagen que es profundo dentro del embrión, como en la notocorda, pulmón, o regiones del cerebro, (Figura 4). Para lograr esto, poner los embriones a través de una serie metanol hasta en 100% de metanol.
    1. Después de la inmersión completa en metanol, transferir los embriones a una solución de una parte de alcohol bencílico y dos partes de bencilo sernzoate (BABB). Los embriones flotan inicialmente en la superficie, pero como el metanol se mezcla con el Babb, se hundirán en el BABB. Realice cada paso se trata de BABB en viales de vidrio o platos; BABB derretirá cualquier plástico o pintura.
    2. Una vez aclarado, ver los embriones con luz transmitida procedente de debajo del embrión. Ajustar la intensidad de la luz, así como el ángulo desde abajo para mejorar el contraste y proporcionar el mejor color.
    3. Al ver embriones despejadas plantean la placa de Petri de vidrio fuera de la base. Para ello, simplemente usando otros dos tapas de los recipientes de Petri para elevar de modo que la región de la placa con los embriones está elevada.
      NOTA: Esto tiene la ventaja de tomar la base fuera de foco y la eliminación de efectos de distracción de imperfecciones o manchas en la base del microscopio que puede interferir con la imagen.

5. Haga doble Hibridación in situ

  1. Con el fin de ver simultáneamente el patrón de expresión de two diferentes genes en un solo embrión, sintetizar dos sondas, una para cada uno de los diferentes genes. Sintetizar una sonda utilizando DIG-11-UTP como una etiqueta como se describe anteriormente. Diluir el producto de la reacción de transcripción de ARN en tampón de hibridación para producir una sonda más concentrado 3x que se utiliza para una sola hibridaciones in situ.
    1. Sintetizar la otra sonda de interés utilizando el mismo protocolo que para DIG etiquetados sondeó excepto que fluoresceína-12-UTP debe ser sustituido por DIG-11-UTP. Diluir el producto de la reacción de transcripción de ARN en tampón de hibridación para producir una sonda más concentrado 3x que se utiliza para una sola hibridaciones in situ.
    2. Mezclar las dos sondas concentradas en una relación 1: 1. Para obtener los mejores resultados, utilice la sonda marcada con fluoresceína para el gen que muestra la expresión más fuerte en el único en el protocolo de hibridación in situ.
  2. Utilice el mismo en el protocolo de hibridación in situ descrito por solo in situ </ Em> hibridaciones, excepto usar el doble de la sonda (sonda que contiene la mezcla de 1,5x concentrado de sondas marcadas con digoxigenina y marcados con fluoresceína) en el extremo de la primera día en lugar de en una sola sonda de hibridación in situ.
    1. Siga el protocolo de hibridación solo en el segundo día del doble en el protocolo de hibridación in situ, excepto fragmentos uso antifluoresceína-AP Fab en una dilución 1: 4000 en lugar de fragmentos anti-DIG-AP Fab. Lavar el exceso de anticuerpo a partir del embrión como en el único en el protocolo situ y llevar a cabo la primera reacción de color utilizando el sustrato BM-púrpura AP.
  3. Después de la primera reacción de color, inactivar el anticuerpo fluoresceína en glicina 0,1 M pH 2,0 durante 40 min seguidos por cinco de diez min lavados en MAB. Bloquear los embriones en el MAB + HTS + BR durante 90 min. Añadir el anticuerpo anti-DIG a una dilución 1: 2000 en el MAB + HTS + BR y se incuba a 4 ° C durante la noche.
    1. Al día siguiente, lavar los embriones XXoroughly en el MAB (12 lavados de 30 min) para eliminar el exceso de anticuerpo.
    2. Lavar los embriones durante 10 min en tampón de AP (Tabla 1) y luego teñir con BCIP (0,5 mg / ml en tampón de AP).
      NOTA: El combinado situ deberían dar una coloración azul-púrpura oscuro para la primera reacción de color y una reacción de color azul claro para el segundo (Figura 5).
    3. Detener la reacción de color final mediante la eliminación del tampón de AP y enjuagar tres veces con MAB. Fijar los embriones con Mempfa durante 10 min. Lave los embriones con 5 lavados rápidos en el MAB o OTC.
    4. Con esta combinación de colores, el uso de metanol en los tratamientos de tinción posterior ya no es posible, ya que elimina el color solo BCIP. Almacenar los embriones después de la tinción y fijación en PBS con 0,02% de azida de sodio. Intensidad de la tinción puede ser débil con doble en situs. Si esto es un problema, reducir los lavados a cuatro, cada uno de 2 hr duración.

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Resultados

El uso de sondas específicas de tejido puede proporcionar información relevante en cuanto a la situación del desarrollo de órganos específicos. En los siguientes ejemplos, la etapa del embrión se basa en la tabla de etapas Nieuwkoop y Faber 11. Si uno utiliza genes forman sondas expresadas después de la diferenciación, la troponina I cardiaca en etapa de 28 a 30, por ejemplo (Figura 1C), la presencia o el tamaño de un órgano diferenciado se pueden evaluar en cualquier diferenciación ...

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Discusión

La capacidad de utilizar la hibridación in situ para visualizar el patrón de expresión de genes específicos sigue siendo el método más comúnmente utilizado para identificar órganos específicos o tipos de células en el embrión de Xenopus. Esto es debido a varias ventajas ofrecidas por esta técnica. La expresión de un gen puede identificar estructuras específicas así antes de cualquier signo histológico de diferenciación como es el caso para la expresión nkx2.5 en los progenitores del corazón an...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos que divulgar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al CIHR por el apoyo de Steve Deimling y al Departamento de Pediatría de la Universidad de Western Ontario por el apoyo de Steve Deimling, Rami Halabi y Stephanie Grover. Este trabajo fue apoyado por el R2654A11 de subvenciones de NSERC y un suplemento del NSERC Discovery Accelerator

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Agitadores de tubos LabguakeVWR17-08-2011
Viales VWRVWR10-07-2012
L-cisteínaBioShopCYS342.500
Juego de trifosfato de ribonucleósidos, 100 mMRoche11277057001
Digoxigenina-11-UTPRoche11209256910
Inhibidor de rnasa (Rnase OUT)Invitrogen 10777-019
T7 ARN polimerasafermentasEPO111
T3 ARN polimerasafermentasEPO101
SP6 ARN polimerasafermentasEPO131
Dnase 1Invitrogen 18047-019
Suero de oveja  Wisent31150
Reactivo bloqueadorRoche11096176001
BM púrpura Ap SustratoRoche11442094001
Anti-Digoxigenina-Ap Fragmentos de FebRoche11093274910
MetanolVWRCAMX0485-7
NaClBioShop SOD002.10
SDSEM 7910
EDTABioShopEDT001.500
TrisBioShopTRS003.5
Tween-20EM 9480
MgSO4SigmaM-2643
MopasBioShopMOP001.250
EGTASigmaE-3889-25G
ParaformaldehídoBioShop PAR070.500 
Formamida  VWR       CAFX0420-4 
ARNRoche10109223001
Ácido maleico  VWR       CAMX0100-3
Citrato de sodio tri-ShopBioShopCIT001
Peróxido de hidrógeno (solución al 30%)EM HX0635-2
BSABioShopALB001.100
PVP-40ICN195451
Ficoll 400GE Healthcare17-0300-10
Alcohol BencílicoSigmaB-1042
Benzoato de BenciloSigmaB-6630
Agarosa ultrapura Invitrogen 16500-500

Referencias

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  2. Movassagh, M., Philpott, A. Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1. Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).
  3. Zhao, Y., et al. The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis. Mol Vis. 17, 768-778 (2011).
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  5. Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2. Differentiation. 76, 392-403 (2008).
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