Imaging semi-automatizado de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra

Resumen

Descrito aquí es un protocolo para la formación de imágenes semiautomático de la fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra.

Resumen

Embriones de pez cebra son una poderosa herramienta para el cribado a gran escala de las moléculas pequeñas. Pez cebra transgénico que expresan proteínas fluorescentes reportero se utilizan con frecuencia para identificar productos químicos que modulan la expresión génica. Pantallas químicas que ensayo de fluorescencia en el pez cebra en vivo a menudo dependen de un equipo costoso, especializado para el cribado de alto contenido. Se describe un procedimiento utilizando un microscopio de epifluorescencia estándar con una platina motorizada a la imagen automáticamente embriones de pez cebra y detectar la fluorescencia específica del tejido. El uso de pez cebra transgénico que reportan la actividad del receptor de estrógeno a través de la expresión de GFP, hemos desarrollado un procedimiento semi-automático para la detección de ligandos del receptor de estrógeno que activan el reportero en una manera específica de tejido. En este video se describen los procedimientos para poner en orden embriones de pez cebra a las 24-48 horas después de la fecundación (HPF) en una placa de 96 pocillos y la adición de pequeñas moléculas que se unen a receptores de estrógeno. En 72-96 HPF, las imágenes de cada pocillo detoda la placa se recogen de forma automática y la inspección manual de la fluorescencia específica del tejido. Este protocolo demuestra la capacidad para detectar los estrógenos que activan los receptores en las válvulas del corazón, pero no en el hígado.

Introducción

Pez cebra transgénico se han desarrollado que permite la visualización directa de la actividad en las vías de señalización, tales como factores de crecimiento de fibroblastos ^1, el ácido retinoico ² y ³ estrógenos, en embriones vivos. Estas herramientas permiten la detección de productos químicos que perturban las vías de señalización (ensayada como el cambio en la intensidad de fluorescencia) o para los productos químicos que modulan la señalización de una manera específica de tejido (el cambio en la localización de la fluorescencia) ^4. Captura de imagen automatizada aumenta el rendimiento de las pantallas químicas dramáti....

Protocolo

NOTA: Este protocolo fue aprobado por la Universidad de Alabama en Comité de Cuidado de Animales y el empleo Institucional Birmingham.

1. Cría de pez cebra y huevo Colecciones

1. Tres días antes de comenzar la exposición a sustancias químicas, montar tanques de cría con separadores a hombres y mujeres por separado. Rellene cada mitad del tanque con agua del sistema de acuicultura. El uso de una red, transferencia de TG (5xERE: GFP) peces ^c262/c262 a los tanques de cría, la colocación de 2 machos y 3 hembras en cada tanque separados por un divisor. Coloque una tapa en cada tanque y la etiqueta ....

Resultados

La Figura 1 muestra imágenes compuestas a partir de pocillos individuales de una placa de 96 pocillos. Cada imagen compuesta se compone de 59 imágenes individuales con 5% imagen de superposición. Tenga en cuenta que el pez cebra en vivo están orientadas aleatoriamente dentro de cada pocillo, sin embargo, son capaces de distinguir la fluorescencia en el corazón desde el hígado. Imágenes de campo claro son útiles como referencias para evaluar la orientación del pez cebra y visualizar anormalidades morfoló.......

Discusión

Este protocolo describe un método directo para automáticamente una imagen de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra. El protocolo fue desarrollado utilizando un Zeiss Axio Observer. Z1 con el software de Zen Azul 2011, sin embargo, la técnica se puede adaptar usando cualquier microscopio invertido con una platina motorizada y software de control de microscopio que puede realizar suelo de baldosas para crear imágenes compuestas. Equipar a un microscopio invertido con una platina motorizada puede pro.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pipetas de transferencia de plástico; diámetro ancho	Fisher	13-711-23
Pipetas de transferencia de plástico; punta fina	Fisher	13-711-26
Placas de 96 pocillos, redondas, de fondo plano	Fisher	21-377-203
Placas de 100 x 35 mm	Fisher	08-757-100D
Placas de 35 x 60 mm	Fisher	08-757-100B
Pinza fina Dumont #5	Fine Science Tools	11254-20	dimensiones de la punta 0,05 x 0,01 mm, para eliminar manualmente los coriones de los embriones
Metanosulfonato de tricaína	Sigma Aldrich	A5040-25G	ver el Libro de pez cebra para la receta (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)
1-fenil 2-tiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629-10G	Prepare 20 mM de caldo (100x) y úselo a 200 μ M en E3B
Zeiss Axio Observer Z1	Carl Zeiss		El protocolo requiere un microscopio de fluorescencia invertida con una platina motorizada
Objetivo de distancia de trabajo de 20x	Carl Zeiss		Utilizamos un objetivo con 0,4 NA y 8,4 mm de distancia de trabajo
Cámara digital Axiocam HRm	Carl Zeiss Software de control de
microscopio ZenBlue 2011	Carl Zeiss		El protocolo requiere un software de automatización y control de microscopía para permitir la captura de imágenes en mosaico utilizando una etapa motorizada
Azul de metileno	Sigma Aldrich	MB-1; 25 gramos	hacen una solución al 2% en agua de ósmosis inversa para usar en E3B (abajo)
E3B			60X E3 SOLUCIÓN: NaCl                                      - 17,2 gramos KCl                                            - 0,76 gramos CaCl2-2H2O        - 2,9 gramos MgSO4-7H2O  - 4,9 gramos o MgSO4 - 2,39 gramos Disolver en 1 litro de agua Milli-Q; almacenar en una botella estéril de 1 litro. 1X E3B SOLUCIÓN PARA PEZ CEBRA: 60X E3          150 ml 2% azul de metileno        100 μ l  Llevar a 9 litros con agua Milli-Q