Lineal Amplificación Mediada por PCR - Localización de elementos genéticos y caracterización de ADN que flanquean Desconocido

Summary

Lineal-amplificación mediada (LAM)-PCR es un método desarrollado para identificar las posiciones exactas de los vectores de integración viral en el genoma. La técnica ha evolucionado a ser el método superior para estudiar la dinámica clonales en los pacientes de terapia génica, la bioseguridad de las tecnologías de nuevo vector, la diversidad de células T, los modelos de células madre de cáncer, etc

Abstract

La PCR mediada por amplificación lineal (LAM-PCR) se ha desarrollado para estudiar la hematopoyesis en células corregidas por genes de pacientes tratados mediante terapia génica con sistemas vectoriales integrados. Debido a la integración estable de los vectores retrovirales, los sitios de integración se pueden utilizar para estudiar el destino clonal de las células individuales y su progenie. La LAM-PCR proporcionó por primera vez evidencia de que la leucemia en pacientes tratados con terapia génica se originó a partir de la sobreexpresión inducida por provirus de un protooncogén vecino. La alta sensibilidad y especificidad de la LAM-PCR en comparación con los métodos existentes, como la PCR inversa y la PCR mediada por ligadura (LM), se logra mediante una etapa inicial de preamplificación (PCR lineal de 100 ciclos) utilizando cebadores específicos de vectores biotinilados que permiten realizar etapas de reacción posteriores en fase sólida (perlas magnéticas). La LAM-PCR es actualmente el método más sensible disponible para identificar el ADN desconocido que se encuentra en las proximidades del ADN conocido. Recientemente, se ha desarrollado una variante de LAM-PCR que elude la digestión de restricción, anulando así el sesgo de recuperación de los sitios de integración y permite un análisis exhaustivo de las ubicaciones de los provirus en los genomas del huésped. El siguiente protocolo explica paso a paso la amplificación de las secuencias 3' y 5' adyacentes al vector lentiviral integrado.

Introduction

Lineal-amplificación mediada por PCR (LAM-PCR) permite la identificación y caracterización de ADN que flanquea desconocida adyacente a ADN conocido de cualquier origen. Más específicamente, LAM-PCR se ha desarrollado para localizar los sitios de integración de vectores virales (IS) dentro del genoma del huésped ^1,2. Los elementos genéticos como retrovirus o transposones integrar su genoma en el genoma huésped en un (semi-) de forma aleatoria ^3-6. En muchos casos es decisivo para saber exactamente la posición en que estos vectores integrados. LAM-PCR se ha demostrado ser superior a las técnicas alternativas como la ligadura mediada por PCR ^7....

Protocol

1. Preparación del vinculador Cassettes (LC)

1. Mezclar 40 l de LC1 oligonucleótido (Tabla 1), 40 l de LC2 oligonucleótido (Tabla 1, con la enzima de restricción apropiada voladizo), 110 l de Tris-HCl (100 mM, pH 7,5), y 10 l 250 mM de MgCl _2.
2. Incubar a 95 ° C durante 5 minutos y dejar que la reacción se enfríe lentamente a temperatura ambiente. Añadir 300 l de H ₂ O y concentrarse dsLinker-ADN en un filtro de centrifugación. Añadir 80 l H ₂ O al eluato y alícuotas de 10 l de casete de engarce dispuesto en 0.2 tubos de PCR.

2. Preamplificación del gen....

Results

LAM-PCR resulta en la amplificación de las uniones genoma de vector con un tamaño de fragmento definido para cada unión. El tamaño de los fragmentos individuales de PCR depende de la distancia entre la ubicación de la ADN conocida en el genoma y el sitio de reconocimiento de enzima de restricción más cercano. Esto permite la visualización de la diversidad de uniones amplificados en muestras analizadas por electroforesis en gel, por ejemplo., Aunque sólo sea sola (monoclonales), varios (oligoclonales), o múltipl.......

Discussion

La técnica de LAM-PCR permite la identificación de secuencias de ADN desconocidas que flanquean una región de ADN conocida. Debido a la alta sensibilidad resultante de preamplificación de las uniones con cebadores específicos de hibridación en la secuencia de ADN conocida, es posible amplificar y detectar incluso uniones raras hasta el nivel de una sola célula. Contrariamente, en una situación policlonal LAM-PCR es capaz de amplificar miles de diferentes uniones en una sola reacción.

Sin emb.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Taq ADN polimerasa	Genaxxon Bioscience GmbH	M3001.5000	Se pueden utilizar polimerasas Taq
alternativas Tampón PCR	Qiagen	201203	recomienda el uso de este tampón
dNTP Mezcla	Genaxxon Bioscience GmbH	M3015.4020	o cualquier otro dNTP
Oligonucleótidos (cebadores)	MWG Biotech		HPLC purificado
Dynabeads M-280 Estreptavidina	Invitrogen	11206D
PBS	Gibco	14190-086	0.1% wt/vol BSA
6 M LiCl	Roth	3739.1	10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA
Tris-HCl, pH 7.5	USB Corporation	22637	o cualquier otro proveedor
EDTA	Applichem	A1103,0250	o cualquier otro proveedor
Klenow Polymerase,	Roche Diagnostics	10104523001
Mezcla de hexanucleótidos	Roche Diagnostics
Restrict, endonucleasa	NEB		o cualquier otro proveedor
	.Epicentre Biotechnologies	LK11025
CircLigase ssDNA Ligase Kit Epicentre	Biotechnologies	CL4111K
NaOH	Sigma-Aldrich	72068	o cualquier otro proveedor
Agarose LE	Roche Diagnostics	11685660001	o cualquier otro proveedor
Tampón TBE	Amresco	0658	o cualquier otro proveedor
Bromuro de etidio	Applichem	A2273,0005	El bromuro de etidio es mutagénico
100 bp DNA Ladder	Invitrogen	15628-050	o cualquier otra escalera de ADN
20 mM NaCl	Sigma-Aldrich	71393-1L	o cualquier otro proveedor
Magna-Sep Magnetic Particle Separator	Life Technologies	K158501	para usar con tubos de 1,5 ml
Separador de partículas magnético Magna-Sep	Life Technologies	K158696	para usar con placas de 96 pocillos
, Amicon Ultra-0.5, membrana Ultracel-30,	Millipore	UFC503096
PerfectBlue Gelsystem, Midi S	, PeqLab	40-1515	u otro sistema de electroforesis
Termociclador profesional 96	Biometra	050-551	u otro Termociclador para placas de 96 pocillos
Agitador orbital KS 260 basic	IKA	2980200	u otro agitador horizontal
PCR softtubes 0,2 ml	Biozym Scientific GmbH	711082	u otros tubos de PCR de 0,2 ml
Tubos de 1,5 ml	Eppendorf	12682	u otros tubos de 1,5 ml
Sistema de documentación de gel	PeqLab		o cualquier otro sistema de documentación de gel
Nanodrop ND-1000 espectrofotómetro	Thermo Scientific	ND-1000
Spreadex EL1200 gel prefabricado	Elchrom	Scientific 3497
Aparato de electroforesis en gel sumergido SEA 2000	Elchrom Scientific	2001E
2100 Bioanalizador de electroforesis	Agilent Technologies G2939AA