Aip1p Dinámica se alteran por la R256H Mutación de actina

Resumen

Mutaciones que causan enfermedades en actina pueden alterar la función del citoesqueleto. La dinámica del citoesqueleto son cuantificados a través de imágenes de las proteínas marcadas con fluorescencia utilizando microscopía de fluorescencia total interna. Como un ejemplo, la proteína del citoesqueleto, Aip1p, ha alterado la localización y el movimiento en las células que expresan la isoforma de actina mutante, R256H.

Resumen

Las mutaciones en actina causar una variedad de enfermedades humanas debido a los cambios moleculares específicos que a menudo alteran la función del citoesqueleto. En este estudio, las imágenes de marcado con fluorescencia proteínas utilizando fluorescencia interna total (TIRF) microscopía se utiliza para visualizar y cuantificar los cambios en la dinámica del citoesqueleto. Microscopía TIRF y el uso de etiquetas fluorescentes también permite para la cuantificación de los cambios en la dinámica del citoesqueleto causadas por mutaciones en actina. Usando esta técnica, la cuantificación de la función del citoesqueleto en células vivas complementa valiosamente en estudios in vitro de función de la proteína. Como un ejemplo, las mutaciones de sentido erróneo que afectan a la actina residuo R256 se han identificado en tres isoformas de actina humanos sugieren que este aminoácido desempeña un papel importante en la regulación de las interacciones. Los efectos de la mutación R256H actina en los movimientos del citoesqueleto se estudiaron utilizando el modelo de levadura. La proteína, AIP1, que se conoce para ayudar a la cofilina en despolimerización de la actina, eraetiquetados con la proteína fluorescente verde (GFP) en el extremo N-terminal y seguimiento in vivo utilizando microscopía TIRF. La velocidad de movimiento Aip1p en tanto de tipo salvaje y cepas mutantes se cuantificó. En células que expresan actina mutante R256H, Aip1p de movimiento está restringida y la tasa de movimiento es casi la mitad de la velocidad medida en las células de tipo salvaje (0,88 ± 0,30 m / seg en células R256H en comparación con 1,60 ± 0,42 m / seg en células de tipo salvaje, p <0,005).

Introducción

La actina es la proteína dominante que comprende el citoesqueleto y participa en los procesos celulares críticos incluyendo la división celular, el movimiento de orgánulos, la motilidad celular, la contracción, y la señalización. Durante la última década, las mutaciones causantes de la enfermedad en la actina se han descubierto en cada una de las seis isoformas de actina humanos que conducen a una serie de trastornos, desde miopatías a la enfermedad arterial coronaria ^1-7. Los procesos por los que las mutaciones de actina conducen a la enfermedad siguen se han dilucidado. El modelo de levadura sigue siendo el estándar de oro para estudiar los efectos bioqu....

Protocolo

1. La clonación en el plásmido PB1996

1. Crear y activar los cebadores de ADN de una compañía de fabricación de oligonucleótidos que flanquean la secuencia diana y contiene sitios de restricción únicos en el plásmido parental seleccionado. NOTA: En este caso, los cebadores fueron diseñados para amplificar los pares de bases 400 en el extremo 5 'de la secuencia AIP1. El sitio de restricción XhoI fue incorporado en el cebador de aproximadamente 20 pares de bases antes de la secuencia AIP1, y XmaI se incluyó aproximadamente 20 pb después de la secuencia AIP1 objetivo. El plásmido utilizado para la clonación fue PB1996, que contiene una etiqueta 3XGFP para la....

Resultados

Un método para la imagen se presenta la dinámica de las proteínas del citoesqueleto en la célula. La proteína de unión a la actina, Aip1p, fue etiquetado con GFP. El diseño para el plásmido que codifica el producto etiquetado se muestra en la Figura 1. El plásmido se transformó en las células de levadura. Expresión de la Aip1p marcado con fluorescencia permite la visualización del comportamiento de la proteína en la célula. Aip1p normalmente se localiza en los parches de actina en los sitios de la endoc.......

Discusión

Una estrategia eficaz para visualizar la dinámica del citoesqueleto y la utilidad en las investigaciones sobre mutaciones patógenas se ha descrito aquí. Modalidades avanzadas de imagen han creado nuevas oportunidades para comprender el movimiento intracelular de proteínas cerca de la membrana celular. Microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) es una técnica sensible para los estudios funcionales en las células vivas. TIRF utiliza un láser de excitación en ángulo que crea un campo evanescente debido .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agarosa	rpi	9012-36-6
Azul de bromofenol	Amresco	115-39-9
BSA	NEB	B9001S
Change-IT Mutación múltiple Kit de mutación dirigida	al sitio USB Corporation 4166059
CutSmart Buffer	NEB B7204S
ADN, monocatenario de testículos de salmón	Sigma	9007-49-2
EDTA pH 7.4	Sigma	93302
Bromuro de etidio	Invitrogen	15585-011	¡Advertencia! Irritación dañina
Kit de ADN fúngico/bacteriano	Symo Research	D6005
HpaI	NEB	R0105S
litio	AlfaAesar	6108-17-4
Escalera de baja masa de ADN	Invitrogen	10068-013
NE Buffer #4	NEB	B7004S
Platinum PCR SuperMix High Fidelity	Invitrogen	12532-016
Kit Miniprep	Qiagen	27106	Cualquier kit funcionará
Kit de Ligadura Rápida	NEB	M2200S
Azida sódica	Sigma	26628-22-8
PBS	Invitrogen	10010-023
PEG	Amresco	25322-68-3
Tris Base Ultrapure	rpi	77-86-1
Wizard SV Gel y sistema de limpieza de PCR	Promega	1/6/2015
XhoI	NEB	R0146S
XmaI	NEB	R0180S
YPD medios	LabExpress	3011-URA
Media	LabExpress	3010
PCR Machine	Invitrogen 4359659		Cualquier máquina de PCR funcionará
Microscopio TIRF	Olympus IX81
Hamamatsu Cámara ORCA-R	Hamamatsu

dirigida Acetato de