Trauma cerebral aguda es una lesión grave que no tiene un tratamiento adecuado hasta la fecha. Multiphoton microscopía permite estudiar longitudinalmente el proceso de desarrollo trauma cerebral agudo y en la exploración de estrategias terapéuticas en los roedores. Dos modelos de trauma cerebral agudo estudiado con imágenes in vivo de dos fotones de cerebro se demuestran en este protocolo.
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Artículo de método
Trauma cerebral aguda en ratones seguido de Longitudinal dos fotones de imágenes
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Resumen
Resumen
Aunque el trauma cerebral aguda a menudo resulta de daño cabeza en diferentes accidentes y afecta a una fracción sustancial de la población, no existe un tratamiento eficaz para la que todavía. Limitaciones de modelos animales utilizados actualmente impiden la comprensión del mecanismo de patología. Multiphoton microscopía permite estudiar las células y los tejidos dentro de los cerebros animales intactos longitudinalmente en condiciones fisiológicas y patológicas. A continuación, describimos dos modelos de lesión cerebral aguda estudiados por medio de dos fotones de imágenes de la conducta de las células cerebrales en condiciones postraumáticas. Una región del cerebro seleccionado se lesiona con una aguja para producir un trauma de una anchura controlada y la profundidad en el parénquima cerebral. Nuestro método utiliza pinchazo estereotáxica con una aguja de jeringa, que se puede combinar con la aplicación del fármaco simultánea. Proponemos que este método se puede utilizar como una herramienta avanzada para estudiar los mecanismos celulares de consecuencias fisiopatológicas de trauma agudo en cerebro de los mamíferos
Introducción
Lesión cerebral aguda es un problema de salud pública con una alta incidencia de lesiones en accidentes automovilísticos, caídas o agresiones, y la alta prevalencia de la discapacidad crónica posterior. Enfoques terapéuticos para el tratamiento de la lesión cerebral permanecen totalmente sintomático, lo que limita la eficacia de la atención pre-hospitalaria, quirúrgica y crítica. Esto hace que el impacto social y económico de la lesión cerebral particularmente grave. Por una variedad de razones, la mayoría de los ensayos clínicos no han demostrado mejora en la recuperación después de la lesión cerebral utilizando nuevos enfoques terapéuticos.
Los modelos animales son cruciales para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas hacia una etapa en que la eficacia del medicamento se puede predecir en los pacientes con lesiones cerebrales. En la actualidad, existen varios modelos animales bien establecidos de trauma en la cabeza, incluyendo el impacto controlado cortical 1, lesión de percusión de fluido 2, la deformación cortical dinámico 3, peso-drop4, y la lesión foto 5. Un número de modelos experimentales se han utilizado para estudiar algunos aspectos morfológicos, moleculares y de comportamiento de la patología asociada con el trauma de cabeza. Sin embargo, ningún modelo animal único es un éxito completo en la validación de nuevas estrategias terapéuticas. Desarrollo de modelos confiables, reproducibles y controlados animales de lesión cerebral, es necesario evaluar los procesos patológicos complejos.
La nueva combinación de las últimas tecnologías de la imagen microscópica y reporteros fluorescentes genéticamente codificados ofrece una oportunidad sin precedentes para investigar todas las fases de la lesión cerebral, que incluyen la lesión primaria, extensión de la lesión primaria, lesión secundaria, y la regeneración. En particular, microscopía in vivo de dos fotones es una tecnología óptica no lineal único que permite la visualización en tiempo real de las estructuras celulares y subcelulares incluso en profundas capas corticales del cerebro de roedores. Varios tipos de células y OrgaNelles se pueden obtener imágenes de forma simultánea mediante la combinación de diferentes marcadores fluorescentes. El uso de esta potente herramienta, podemos visualizar cambios morfológicos y funcionales dinámicos en el cerebro que vive en condiciones postraumáticas. Las ventajas de la in vivo microscopía de dos fotones en el estudio de la lesión cerebral se demostraron recientemente por Kirov y colegas 6. Utilizando un modelo de contusión cortical focal leve, estos autores demostraron que la lesión aguda dendríticas en la corteza pericontusional es cerrada por la disminución en el flujo sanguíneo local. Por otra parte, demostraron que la corteza metabólicamente comprometido alrededor del sitio de contusión está dañado aún más por la despolarización de la difusión. Este daño secundario afecta circuitos sinápticos, haciendo que las consecuencias de la lesión cerebral traumática más severa.
Aquí, se propone el método de punción estereotáxica con una aguja de jeringa, que podría combinarse con la aplicación tópica del fármaco simultánea, como un modelo avanzado de cerebro locallesiones y como una herramienta para estudiar las consecuencias fisiopatológicas de trauma agudo en el cerebro de mamíferos in vivo.
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Protocolo
Todos los procedimientos que aquí se presentan se realizaron de acuerdo a la guía local para el cuidado de animales (La Ley finlandesa sobre Experimentación Animal 62/2006). Licencia Animal (ESAVI/2857/04.10.03/2012) se obtuvo de las autoridades locales (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Ratones adultos de 1-3 meses de edad, peso 24-38 g, se mantuvieron en jaulas individuales en las instalaciones de animales certificados de la Universidad y siempre con comida y agua ad libitum.
1. Lesión Cerebral Imaging través de una ventana craneal
- Anestesiar animales y la preparación del campo operatorio
- Anestesie ratones por inyección peritoneal de una mezcla de ketamina (Ketalar, 80 mg / kg) y xilazina (Rompun, 10 mg / kg) disuelto en esterilizada por filtración tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4. Compruebe los reflejos del ratón de forma regular (de cola y sonda pizca dedo del pie) para verificar la profundidad de la anestesia. Aumentar la dosis cuando sea apropiado, para mantener la anestesia adecuada, pero evitar Overdose.
- Mantener el animal a 37,0 ° C usando una almohadilla calefactora durante la operación quirúrgica, sesión de imágenes y primera hora después de la recuperación de la anestesia.
- Para proteger los ojos del ratón se seque, aplique lubricante ocular.
- Administrar dexametasona (veterinario Rapidexon, 2 mg / kg) por inyección subcutánea para reducir la inflamación y el edema cerebral.
- Administrar un analgésico (por ejemplo, ketoprofeno por vía intraperitoneal) hasta 30 minutos antes o inmediatamente después de la cirugía. Si el animal muestra algún síntoma de dolor, como la renuencia a moverse, comer o beber, o pérdida de peso, salivación, piloerección o respiratoria anormal sonidos después de la cirugía, repetir la inyección de analgésico.
- Afeitarse la cabeza del ratón 'con una máquina de afeitar (ver Materiales y Equipos). Evite dañar los bigotes.
- Tratar la piel sobre la cabeza del ratón con solución de etanol al 70% para limpiar el área afeitada.
- Con unas tijeras quirúrgicas (ver Materiales yEquipment) y las pinzas (ver Materiales y Equipos), cortaron la piel de la línea media entre las orejas de la frente.
- Raspar suavemente lejos el tejido conectivo unido al cráneo con una cuchilla microquirúrgica contundente.
- Deslice las fronteras de la piel hacia los lados y tire de barras para los oídos ligeramente en los orificios auditivos en el cráneo de la cabeza y la fijación de la piel.
- Limpie el cráneo con PBS estéril y tratar la zona de la cirugía en la cabeza del ratón con el 0,5% de digluconato de clorhexidina, luego seque la superficie del cráneo usando una combinación de hisopos de algodón estériles y aire comprimido.
- Imposición de la lesión pinchazo
- Coloque un pequeño animal instrumento estereotáxico con un titular de los animales (ver Materiales y Equipos).
- Ajustar la posición del microscopio binocular al lado del instrumento estereotáxico para centrarse en la superficie del cráneo del animal.
- Utilizando un microscopio binocular, localice el punto bregma en el cráneo.
- Identificar el region de interés utilizando las coordenadas estereotáxica.
NOTA: Evite las áreas de interés que se encuentran directamente sobre los vasos corticales superficiales. La destrucción de estas puede afectar fuertemente a la progresión trauma. - Coloque la aguja de 30 G por encima de la región elegida y marca el sitio de destino por el rascado la superficie del cráneo.
- Perforar el cráneo con todas las precauciones posibles para evitar la ampliación innecesaria de la superficie del hueso afectado. Use un taladro quirúrgico de alta velocidad (ver Materiales y Equipos) bajo el microscopio. Fresando si el líquido aparece en el área perforada.
- Toque la parte inferior del pozo perforado con la aguja.
- Sumergir la aguja sin problemas en el cerebro (tasa de inserción de 5-10 mm / min), a la profundidad de 0,5-2,0 mm de acuerdo con las coordenadas de la zona de aplicación de pinchazo.
- Retire la aguja inmediatamente después de llegar a la profundidad deseada (velocidad de retracción de 5-10 mm / min) y limpiar la sangre que aparece después del pinchazo con un pequeño tapón (see Los materiales y equipos).
- Realizar la microinyección de 100 M sulforrodamina 101 u otro compuesto de interés en el sitio de la lesión utilizando una bomba de microjeringa (WPI) y 10 l jeringa Hamilton de montar con pipeta de vidrio.
NOTA: Durante la preparación de la pipeta de vidrio de capilar de vidrio de borosilicato, afilar la punta de un diámetro de 10 a 20 micras. - Infundir 250-1.500 nl de la solución de inyección a una velocidad de 2-5 nl / seg.
NOTA: Deje la pipeta después de la final de la infusión durante al menos 5 min en el parénquima cerebral, luego retírela lentamente y con cuidado para evitar la solución de flujo de salida.
- Craneotomía para ventana craneal crónica
- Perforar el cráneo con mucho cuidado para hacer una ventana de círculo alrededor del sitio de la lesión. Utilice la ventana diámetro de 3-3,5 mm.
- Aplicar una gota de tampón de corteza (NaCl 125 mM, KCl 5 mM, glucosa 10 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 2 mM y 2 mM de MgSO4 en H2O destilada) para cubrir el wiNDOW.
- Coloque un cubreobjetos ronda (# 1.5 grosor) en la ventana del cráneo.
- Retire el exceso de buffer de la corteza alrededor del cubreobjetos.
- Selle los bordes del cubreobjetos con pegamento acrílico (ver Materiales y Equipos).
NOTA: Asegúrese de que el pegamento no se aplica a la superficie superior del cubreobjetos. Si el cristal de la cubierta está contaminada con cola, esperar hasta que el vidrio sea de forma estable pegado al cráneo y el pegamento en la superficie de vidrio se seca, a continuación, retire con cuidado el pegamento contaminando con un microcuchilla. - Espere 5 minutos a que el pegamento se seque.
- Con los tornillos altura de la barra del oído, ajuste la posición de la cabeza de manera que el soporte de metal puede ser colocado.
- Aplique una pequeña cantidad de pegamento acrílico en el anillo del soporte de acero (ver Materiales y Equipos).
- Pegue el anillo del soporte de acero para el cubreobjetos de vidrio con la maneta metal titular dirigido hacia atrás.
- Espere 5 minutos a que el pegamento se seque.
- Mix cemento dental (ver Materiales y equipos) con pegamento poliacrílico en una placa de 3,5 cm de Petri (o análogo) para lograr condiciones viscosos.
- Selle los bordes de la ventana craneal con la mezcla + cemento cola y cubrir la superficie expuesta del cráneo con la misma mezcla hasta la frontera de la piel.
- Espere 15 minutos para dejar que la mezcla de pegamento + cemento seque y luego retire las barras de oído.
- Realice microscópica de excitación (TPEM) de dos fotones para la región de interés y un área de control, ya que se describe en el Protocolo 3.
- Después de las imágenes, que el animal pueda recuperarse de la anestesia en una almohadilla eléctrica y mantenerla en una jaula individual bajo observación hasta la recuperación completa. Alimento húmedo se puede dar para facilitar la masticación y la hidratación.
2. Lesión Cerebral Imaging través del cráneo Diluido
- Anestesiar animales y la preparación del campo operatorio
- Anestesiar el ratón y prepararlo para la inducción traumacomo se describe en el paso 1.1.
- Cráneo adelgazamiento e imposición de la lesión pinchazo
- Coloque un pequeño animal instrumento estereotáxico con el titular de los animales (ver Materiales y equipos).
- Ajuste la posición de un microscopio binocular junto al instrumento estereotáxico para centrarse en la superficie del cráneo animal.
- Localice el punto bregma en el cráneo usando un microscopio binocular, identificar el área del cerebro en ser fotografiado en base a coordenadas estereotáxica y se marca por el rascado.
NOTA: La posición adelgazamiento cráneo no debe colocarse sobre o cerca suturas craneales, como la estabilidad del cráneo se ve comprometida en esas áreas. Por otra parte, los grandes vasos y las meninges, situados debajo de las suturas del cráneo corticales o meníngeos son susceptibles de causar los artefactos de imagen. - Coloque el soporte de metal recubierto con pegamento sobre el área de interés en el cráneo del animal, aplicar una ligera presión y esperar 5 minutos hasta que el soporte de metal está sólidamente pegadas al cráneo.
- Mezclar cemento dental (ver Materiales y equipos) con pegamento poliacrílico en una placa de 3,5 cm de Petri (o análogo) para lograr condiciones viscosos.
- Selle los bordes del soporte de metal con la mezcla + cemento cola y cubrir la superficie expuesta del cráneo con la misma mezcla hasta la frontera de la piel.
- Espere 15 minutos para dejar que el cemento y la mezcla de pegamento se secan.
- Enjuague la región adelgazada cráneo y las partes circundantes del soporte metálico varias veces con PBS, de manera que los restos de pegamento no polimerizado son lavados.
NOTA: Es fundamental para garantizar el apego estable del cráneo para el titular. Esto permite que la estabilidad de la preparación durante la exploración. - Usando el modo de alta magnificación del microscopio binocular, eliminar las capas superiores del hueso del cráneo con una micro-perforación de alta velocidad para crear una zona adelgazada cráneo de ~ 0,5 a 1,5 mm de diámetro. Utilice aire comprimido durante la perforación para eliminar los restos de los huesos. Realice la perforación intermittentlY durante el procedimiento de adelgazamiento con el fin de evitar el sobrecalentamiento inducida por la fricción. Se enfría la broca utilizando la solución a temperatura ambiente y aplicar periódicamente tampón a la zona adelgazada para absorber el calor.
NOTA: Para evitar daños en la corteza, no perforar en grandes regiones (> 1,5 mm) hasta una capa fina (<50 micras).
NOTA: La estructura ósea del cráneo del roedor se compone de dos capas delgadas de hueso compacto separadas por una gruesa capa de hueso esponjoso. Cavidades diminutas de la forma del hueso y círculos concéntricos canalículos esponjosos, que contienen vasos sanguíneos. Utilice la microtaladro para eliminar tanto la capa de hueso compacto externo y la mayor parte de la capa esponjosa. La interrupción de los vasos sanguíneos dentro del hueso esponjoso puede causar sangrado. Utilice la hemostasia esponja de colágeno para detener el sangrado. - Utilice la generación de segundo armónico (SHG) de formación de imágenes para examinar si se ha eliminado la mayoría del hueso esponjoso. Tenga cuidado de evitar el adelgazamiento excesivo, asegúrese de que el hueso restante es thel parpadeo de 50 micras, en esta etapa de la preparación.
- Ponga una gota de tampón caliente (35-37 ° C) en la parte superior de la región adelgazada. Utilice una hoja de microcirugía o Micro Acabado Bur para eliminar más capas de hueso y formar un área lisa de ~ 700 m de diámetro con un grosor de hueso de ~ 20 micras. Durante este paso, es útil para realizar las imágenes SHG repetitivo y medir regularmente el espesor de los huesos.
- Realice imagen TPEM para la región de interés y un área de control.
- Ajustar la posición de la cabeza con los tornillos altura de la barra del oído de una manera tal que adelgaza región está posicionado estrictamente horizontal. Coloque la aguja por encima de la región adelgazada y asegúrese de que no hay grandes vasos debajo de la página de destino.
- Hacer una lesión por inmersión de la aguja en el cerebro, a la profundidad de 0,5-2,0 mm de superficie del cráneo adelgazada y de acuerdo con las coordenadas de la zona de aplicación de pinchazo.
- Retire la aguja y reprimir la hemorragia que aparece después de tque la lesión cerebral aguda con el tapón hemostático (ver Materiales y equipos). Espere hasta que se forman coágulos sanguíneos y la pulsación del vaso en el lugar de la lesión se detiene.
- Realizar la microinyección de 100 M sulforrodamina 101 u otro compuesto de interés en el sitio de la lesión, tal como se describe anteriormente en la Sección 1.2.10.
- Realice imagen TPEM para monitorear la progresión de lesiones y la recuperación como se describe en el Protocolo 3.
- Después de las imágenes, que el animal pueda recuperar la conciencia de la anestesia en una almohadilla térmica. No deje que el animal desatendido y devolverlo a su jaula sólo después de la recuperación física completa.
3. Imaging
- Colocar el animal bajo el microscopio por colocación del soporte del metal para el marco a la medida.
- Para imágenes, utilizar por ejemplo el FV1000MPE microscopio de dos fotones equipado con láser de Mai Tai DeepSee y XLPLN 25X 1,05 NA objetivo de inmersión en agua optimizado para in vivo de dos fotonesde formación de imágenes.
- Identificar el lugar de la lesión en el microscopio utilizando el modo de fluorescencia de campo amplio. Utilice filtros de paso largo para visualizar la vasculatura cerebral y seleccione el área de control de acuerdo con el patrón observado de los vasos sanguíneos.
- Para la imagen de la señal de generación de segundo armónico (SHG), ajustar el láser de femtosegundo para la longitud de onda de 800 nm y recogen la luz emitida mediante el filtro de derivación nm 380-410. Para imágenes de fluorescencia, utilice el filtro de paso de banda (515-560 nm) para recoger la luz emitida, y las siguientes longitudes de onda se utilizan para excitar la fluorescencia: GFP-860 nm, YFP-950 nm.
- Utilice software Fluoview para la adquisición de imágenes.
- Tienda Coordenadas cada ROI para imágenes repetitivas posterior. Imagen de la misma ROI con el tiempo, y ajustar las coordenadas cada vez para maximizar el solapamiento de imagen.
- Analizar las imágenes con el software apropiado (por ejemplo. ImageJ). Las reconstrucciones que se presentan aquí se realizaron utilizando el software Imaris.
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Resultados
Hemos optimizado dos procedimientos de operación: 1) la ventana craneal crónica y 2) adelgazamiento del cráneo, por imagen cerebral postraumático en ratones transgénicos. Vista esquemática de las preparaciones experimentales se presenta en la Figura 1. Pinchazo traumática por aguja de acero de 0,3 mm de diámetro exterior (30 g) se aplica a la pozo perforado (Figura 1A). Una preparación de ventana del cráneo con éxito permite obtener imágenes a profundidades de hasta 650 m por debajo de ...
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Discusión
Traumatismo cerebral es un acontecimiento imprevisible abrupto. Aquí, se describe el modelo animal que reproduce un espectro de cambios patológicos observados en pacientes humanos después de la lesión cerebral, tales como la neurodegeneración, la eliminación de las dendritas, edema cerebral, cicatriz glial, hemorragias en la corteza cerebral, junto con una hemorragia subaracnoidea focal y aumento de la permeabilidad de la barrera sangre-cerebro. Para estudiar la patogénesis primaria y secundaria, así como la recuperació...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Estamos profundamente agradecidos con el Dr. Frank Kirchhoff para proporcionar GFAP-EGFP y cepas de ratón CX3CR1-EGFP. El trabajo fue apoyado por becas del Centro de Movilidad Internacional de Finlandia, Tekes, finlandés Graduate School of Neuroscience (FGSN) y la Academia de Finlandia.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Pinzas tontas 2A-sa, 115 mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30 G ½ en aguja | BD | REF 304000 | |
| Recortadora de animales, máquina de afeitar | Aesculap | Isis GT420 | |
| Microscopio binocular | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Controlador de temperatura biológico con almohadilla térmica de acero inoxidable | Supertech | TMP-5b | |
| Cuchilla microquirúrgica roma | BD | REF 374769 | |
| Tubo de borosilicato con filamento | Sutter Instruments | BF120-69-10 | Para la producción de pipetas de vidrio |
| Carprofeno | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Digluconato de clorhexidina | Sigma | C9394 | |
| Cemento dental | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexametasona | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Taladros desechables | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco' s PBS 10x | Pinza Sigma | D1408 | |
| Dumont #5, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Extractor de microelectrodos Ealing | Ealing | 50-2013 | Extractor vertical para la producción de pipetas de vidrio |
| Pomada oftálmica | Novartis | Viscotears | |
| Control de taladro Foredom | Foredom FM3545 | ||
| Pieza | de mano de micromotor ForedomForedom | MH-145 | |
| Plataforma de anestesia gaseosa para ratones | Stoelting | 50264 | Montado en instrumento estereotáxico |
| Hemostasia Colágeno Esponja | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamina | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee láser | Spectra-Physics | ||
| Soporte metálico | Neurotar | ||
| Pinza de microapósito, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Microjeringa de llenado de capilares |
| Aceite mineral | Sigma | M8410 | |
| Microscopio de barrido láser multifotónico | Olympus FV1000MPE | ||
| Jeringa NanoFil 10 μ l | WPI | NANOFIL | Jeringa Hamilton |
| Hisopos no tejidos 5 x 5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Tampones quirúrgicos |
| Pegamento poliacrílico | Henkel | Loctite 401 | |
| Cubreobjetos de vidrio redondos | Ciencias de la Microscopía Electrónica 1,5 | ||
| espesor | |||
| Instrumento estereotáxico para pequeños animales | David Kopf Instruments | 900 | |
| Adaptador para ratón Stoelting y rata neonatal | Stoelting | 51625 | Montado sobre instrumento estereotáxico. |
| Tijeras de iris para estudiantes, rectas 11,5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamina 101 | Sondas moleculares | S-359 | |
| Bomba de microjeringa UMP3 y Micro 4 controlador de bomba de microjeringa | WPI | UMP3-1 | Microinyector y controlador |
| Xilacina | Bayer Health Care | Rompun vet |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
