Demostración de la activación proteolítica del canal de sodio epitelial (ENaC) mediante la combinación de mediciones de corriente con detección de fragmentos de escisión

Resumen

La activación proteolítica del canal de sodio epitelial (ENaC) heterólogamente expresada en oocitos de Xenopus laevis se pueden demostrar mediante la combinación de mediciones de corriente con un enfoque de biotinilación para investigar la aparición de productos de escisión de los canales iónicos en la superficie celular. Sitios de escisión funcionalmente importantes pueden ser identificados mediante el uso de mutagénesis dirigida al sitio.

Resumen

Los métodos descritos se pueden utilizar para investigar el efecto de las proteasas sobre los canales iónicos, receptores y otras proteínas de la membrana plasmática expresadas heterólogamente en los ovocitos de Xenopus laevis. En combinación con la mutagénesis dirigida al sitio, este enfoque proporciona una poderosa herramienta para identificar sitios de escisión funcionalmente relevantes. La activación proteolítica es un rasgo característico del canal epitelial de sodio sensible a la amilorida (ENaC). El paso final de activación implica la escisión de la subunidad γ del canal en una región crítica potencialmente dirigida por varias proteasas, incluidas la quimotripsina y la plasmina. Para determinar el efecto estimulador de estas serina proteasas sobre ENaC, se midió la corriente de célula entera sensible a la amilorida (ΔI_ami) dos veces en el mismo ovocito antes y después de la exposición a la proteasa utilizando la técnica de pinza de voltaje de dos electrodos. Paralelamente a los experimentos electrofisiológicos, se utilizó un enfoque de biotinilación para controlar la aparición de fragmentos de escisión de γENaC en la superficie celular. Utilizando los métodos descritos, se demostró que el curso temporal de la activación proteolítica de las corrientes de células enteras mediadas por ENaC se correlaciona con la aparición de un producto de escisión de γENaC en la superficie de la célula. Estos resultados sugieren un vínculo causal entre la escisión del canal y la activación del canal. Además, confirman el concepto de que se requiere un evento de escisión en γENaC como paso final en la activación del canal proteolítico. Los métodos descritos aquí pueden ser aplicables para abordar preguntas similares para otros tipos de canales iónicos o proteínas de membrana.

Introducción

Las proteasas son enzimas que están implicadas en diversas reacciones fisiológicas que van desde la degradación proteolítica bien conocida de proteínas, en el contexto de la digestión, a cascadas de proteasa altamente sofisticados que participan en vías de señalización reguladora complejos. Las proteasas se clasifican en siete grupos de acuerdo con su sitio activo catalítico: aspartato, asparagina, cisteína, ácido glutámico, metalo, serina, treonina y proteasas. Diferentes proteasas se dirigen a sitios de escisión distintos que no siempre son fáciles de predecir a partir de la estructura primaria de una proteína. La base de datos MEROPS ( http://merops.sanger.ac.uk/ ) proporciona información detallada sobre una amplia gama de proteasas y sus sitios de división preferenciales. Sitios de escisión funcionalmente relevantes pueden identificarse utilizando la mutagénesis dirigida al sitio.

Está bien establecido que el procesamiento proteolítico de ENAC es un importante mecanismo de activación de thLa particularidad ^1,2 canal iónico. Curiosamente, hay pruebas de que la función del ácido de detección de canal iónico 1a relacionada (ASIC1a) también puede ser modificado por proteasas ^3-5. En la actualidad sigue siendo una cuestión abierta si la escisión proteolítica canal juega un papel fisiológico importante en la regulación de la actividad de otros canales iónicos o transportadores. Sin embargo, está bien establecido que la escisión proteolítica activa un grupo de receptores acoplados a proteínas G, los receptores activados por proteasa (PAR) ^6. Varias proteasas de serina proteasas (por ejemplo, canal de activación (CAP1-3), quimotripsina, tripsina, furina, plasmina, elastasa de neutrófilos, y la calicreína) se han mostrado para activar proteolíticamente ENaC ^2. Además de las serina proteasas, otros grupos de proteasas pueden estar implicadas en la activación proteolítica de ENaC. De hecho, los últimos datos muestran que la metaloproteinasa meprin-β ⁷ y la proteasa cisteína catepsina ^S-8 también puede activate ENAC. Sin embargo, los (pato-proteasas) fisiológicamente relevantes para la activación de ENaC no se habían determinado y pueden diferir de un tejido a otro.

Las proteasas se conocen para escindir preferentemente en sitios particulares en la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, la quimotripsina de serina proteasa muestra un patrón de escisión específico de escisión después de la amino-ácido aromático residuos de fenilalanina y tirosina. En contraste, la proteasa de serina tripsina escinde preferencialmente después de la lisina residuos básicos o arginina. El uso de constructos γENaC humana mutantes generados mediante mutagénesis dirigida al sitio, los sitios de escisión funcionalmente relevantes en ENaC heteróloga expresadas en el sistema de expresión de oocitos podrían ser identificados ^8-13.

Mediante la inyección de ARNc de las tres subunidades ENaC (αβγ) en oocitos aislados, ENaC se puede expresar funcionalmente en estas células y la actividad de los canales presentes en la membrana plasmática puede ser medida porutilizando la técnica de fijación de voltaje de dos electrodos. Mediante el uso de la amilorida diurético, un inhibidor específico de ENaC, la mediada por ENaC componente de la corriente de células enteras sensible a amilorida _(ami Delta I) se puede separar de las corrientes de fuga no específicas o de las corrientes conducidas por otros canales iónicos. Por lo tanto, los valores de Delta I _ami reflejan la actividad general de ENaC y pueden ser determinadas por restar las corrientes de células enteras medidos en presencia de amilorida partir de las corrientes de células enteras correspondientes grabadas en ausencia de amilorida. Para probar si una proteasa tiene un efecto estimulante sobre el ENaC, Delta I _IAM se mide dos veces en el mismo oocito, es decir, antes y después de la incubación de los ovocitos en una solución que contiene proteasa. Un aumento de Delta I _IAM de la primera a la segunda medición indica la activación de ENaC proteolítica. La quimotripsina o tripsina son conocidas por estimular al máximo ENaC en el sistema de expresión de ovocitos ^2,14 y se pueden utilizar para confirm que la activación de ENaC proteolítica es detectable en un lote dado de ovocitos.

En paralelo a las mediciones de corriente de células enteras, se utilizó un enfoque de biotinilación ⁹ Para investigar si el aumento en Delta I _ami detectar tras la exposición de los ovocitos a las proteasas se correlaciona con la aparición de fragmentos de escisión de ENaC en la superficie celular. Las proteínas en la superficie celular se marcan con biotina y se pueden separar de las proteínas intracelulares mediante la unión de las proteínas biotiniladas a perlas de agarosa marcadas con neutravidina. Las proteínas biotiniladas pueden ser analizados por Western blot. fragmentos de escisión γENaC en la superficie celular se pueden detectar usando un anticuerpo específico dirigido contra un epítopo en el extremo C-terminal de la γENaC. Para identificar un sitio de escisión funcionalmente relevante (s), predijeron sitios de escisión se pueden mutar usando mutagénesis dirigida al sitio. Canales Wildtype y mutantes se comparan en experimentos paralelos utilizando ovocitos de los slote ame.

Con este enfoque metodológico se demostró por primera vez que la activación proteolítica de las corrientes de células enteras mediadas por ENAC se correlaciona con la aparición dependiente del tiempo de ENaC de escisión de fragmentos en la superficie celular. Estos resultados sugieren una relación causal entre la división del canal y la activación del canal. Por otra parte, el uso de mutagénesis dirigida al sitio de supuestos sitios de escisión en combinación con la técnica de dos electrodos de fijación de voltaje, los sitios de escisión funcionalmente relevantes para la plasmina, quimotripsina y catepsina ^{13-S 8} se identificaron.

Protocolo

1. Aislamiento de oocitos de Xenopus y microinyección de ARNc

1. Obtener ovocitos de Xenopus laevis hembra adulta. Anestesiar animales en 0,2% MS222, y resecar lóbulos ováricos través de una pequeña incisión abdominal.
2. Aislar ovocitos de los lóbulos ováricos por digestión enzimática a 19 ° C durante 3-4 horas con 600 a 700 U / ml de colagenasa tipo 2 de Clostridium histolyticum disueltos en solución OR2 libre de calcio (receta en la Tabla 1).
3. Para la selección, coloque los ovocitos desfolicularon en una placa de Petri con un microscopio binocular en un alto contenido de sodio que contiene la solución (DN96: Receta en la Tabla 1).
4. Seleccione ovocitos V-VI de la etapa y colocarlos en otra placa de Petri con una pipeta Pasteur. NOTA: Blunt pipeta Pasteur por flameado para evitar lesiones de los ovocitos.
5. Inyectar oocitos con ARNc (por ejemplo 0,2 ng por αβγENaC subunidad). Disolver cARNs en RNasa libre de agua. NOTA: Totalvolumen inyectado en cada ovocito es de 46 nl.
6. Tienda inyectado ovocitos a los 19 ° C en una solución baja en sodio para evitar la carga de sodio de los ovocitos (ND9: Receta en la Tabla 1). Suplemento la solución con penicilina 100 U / ml de sodio y 100 g / ml de sulfato de estreptomicina para prevenir el crecimiento bacteriano. Maneje cuidadosamente los ovocitos de limitar la cantidad de ovocitos dañados o muertos y mantenerlos en pequeños grupos individuales en un 12 pocillos de la placa de pozos llenos de solución del baño durante los dos días después de la inyección de ARNc.

2. Realización de dos electrodos Los experimentos de fijación de voltaje

1. Medir la ovocitos dos días después de la inyección.
2. Llene una jeringa de un sistema de perfusión alimentado por gravedad con solución ND96 y otra jeringa con solución ND96 contiene amilorida (2 M). Monte jeringas de 50 cm por encima de la cámara de baño de los ovocitos. NOTA: La concentración de la amilorida inhibidor de ENaC fue elegido para ser 20 veces superior a su IC ₅₀ (100 nM).
3. Encienda la fuente de luz fría 150 W halógeno y ajustarlo a 10 cm por encima de la cámara de baño de ovocitos que permite una buena visualización con el microscopio binocular. A continuación, encienda de succión y ajustar el tubo de succión en el extremo de la cámara de baño de ovocitos. Adaptador Localice succión tubo opuesto al superfusion tubos 'entrar en el baño de los ovocitos. NOTA: Potencia de succión debe ser suficiente para soportar el flujo continuo de la solución de superfusión el ovocito.
4. Ajustar la velocidad de superfusión de cada solución a 3-5 ml / min utilizando el dispositivo de control de flujo por gravedad IV. Conectar los tubos de superfusión con un adaptador para la cámara de baño de ovocitos.
5. Tire de capilares de vidrio con un extractor de micropipeta para obtener diámetros de punta de <1 m. Luego llena los capilares a ~ 1/4 con 3 M KCl. NOTA: Asegúrese de que la parte tratada con cloro del alambre de plata del soporte del electrodo se sumerge en una solución de KCl. Compruebe si hay burbujas de aire en la punta del capilar. Las burbujas de aire deterioran la medirement al aumentar la resistencia capacitancia parásita.
6. Inserte los capilares en los soportes de los electrodos de la corriente y el electrodo de tensión y los situará en ND96 contiene amilorida solución (2 M) utilizando los micro-manipuladores.

3. Medición de las corrientes de células enteras amilorida-sensibles

1. Poner a cero el potencial de electrodo del electrodo de tensión (V _m) y el electrodo de corriente (V _e) mediante el ajuste de la V _m y V _e desplazamiento _{botones NOTA:.} La resistencia debe ser 1-2 MΩ para el electrodo para medir V y 0,5 _m -1 MΩ para el electrodo de inyección de corriente.
2. Coloque el ovocito en la cámara de baño en estrecha proximidad al electrodo de detección de voltaje. NOTA: No dañe el ovocito durante cualquiera de estos pasos de transferencia. Utilizar una pipeta Pasteur para transferir el ovocito. Para evitar daños en el ovocito de los bordes de la pipeta debe ser mitigado por flameado.
3. Empalar ooCytes suavemente con las dos microelectrodos.
4. Ajuste el potencial de explotación al amplificador a -60 mV y encender el registrador gráfico. Encienda la amilorida (2 M) que contiene la solución. NOTA: La corriente debe ser de aproximadamente 0 ± 0,5 μA. Corrientes de fuga mayores indican un empalamiento con fugas. Por lo tanto, estos ovocitos deben ser rechazados. Por otra parte, las corrientes de fuga medida en presencia de amilorida (2 M) deben ser similares en αβγ-WT expresar ovocitos a los medidos en-αβγ mutante ENaC expresar ovocitos. Esto indica que las mutaciones no afectan a la amilorida-sensibilidad del canal.
5. Inicie la grabación. Si es necesario ajustar la ganancia.
6. Después de la corriente medida alcanza una meseta estable, cambiar a la solución a amilorida libre. NOTA: desviaciones actuales a la baja en las trazas de corriente corresponden a corrientes hacia el interior, es decir, el movimiento de carga positiva (Na ⁺⁾ desde el lado extracelular en la célula.
7. After una meseta actual se alcanza (después de ~ 60 seg), cambiar la superfusión de nuevo a la solución que contiene amilorida. Después de la corriente del ovocito alcanza la corriente de referencia inicial, desactive el bloqueo de tensión y suavemente retirar los electrodos.
8. Para permitir el resellado de la membrana plasmática en los sitios de empalamiento, colocar el ovocito en un pocillo de una placa de 96 pocillos que contenía 100-150 l de proteasa libre de solución ND96.
9. Después de 5 min, transferir los ovocitos a una proteasa que contiene una solución o a una solución de control sin proteasa durante un tiempo de incubación de 30 min. NOTA: El tiempo de incubación depende de la proteasa y el canal estudiado.
10. Después de la etapa de incubación repetir la medición de la corriente (ver 3.2 y siguientes). NOTA: Es posible medir> 90% de los oocitos después de la incubación en solución de proteasa.

4. Ensayo de biotinilación

1. Seleccionar y descartar ovocitos defectuosos bajo el microscopio binocular. NOTA: Utilice injected ovocitos del mismo lote para las mediciones de corriente y para los experimentos de biotinilación.
2. Mantener biotina a TA durante al menos 20 minutos antes de su uso en el experimento.
3. Preparar las soluciones: DN96 y DN96 contiene la proteasa apropiada. Preparar pipetas Pasteur etiquetándolos y por flameado brevemente sus consejos para evitar lesiones de los ovocitos. NOTA: Aquí, se utiliza la proteasa quimotripsina 2 mg / ml en ND96. Tratar a cada grupo con una pipeta separada para evitar la contaminación cruzada de las soluciones.
4. Llene cada pocillo de una placa de 6 pocillos con 2,5 ml de control DN96 o DN96 contiene una proteasa a TA. Luego depositar 30 ovocitos por pocillo y se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente. NOTA: Para los procedimientos posteriores es importante para mantener las muestras en hielo en todo momento. Todos los pasos de centrifugación se realizó a 4 ° C.
5. Llene cada pocillo de una nueva placa de 6 pocillos con 2,5 ml ND96 (cada grupo tiene 3 pozos para los pasos de lavado) y pesar la biotina. NOTA: 2,5 mg de biotina pER así se requiere (1 mg / ml). Disolver la biotina en el tampón de biotinilación (es decir, 25 mg de biotina (para 10 grupos) en 25 ml de tampón de biotinilación (receta en la Tabla 1).
6. Transfiera cada grupo de ovocitos a un pozo lleno de 2,5 ml ND96. Transferencia ovocitos secuencialmente en dos pozos adicionales con ND96 para lavar cualquier proteasa restante. Incubar los ovocitos durante 5 min en ND96.
7. La transferencia de los oocitos en una solución también contiene 2,5 ml de biotina y se incuba con agitación suave ('agitador') durante 15 min. NOTA: Minimizar el ND96 transferido con la pipeta para evitar la dilución de la solución de biotina.
8. Transfiera cada grupo de ovocitos en un pozo que contiene 2,5 ml de tampón de enfriamiento rápido (receta en la Tabla 1) para detener la reacción de biotinilación. A continuación, traslado a cada grupo de ovocitos en un segundo pozo también contiene 2,5 ml apagues tampón y se incuba durante 5 minutos con agitación suave.
9. Retire ovocitos dañados o muertos. Nota:Elige el mismo número de ovocitos por grupo para el siguiente procedimiento.
10. Transfiera cada grupo de ovocitos a un tubo de microcentrífuga de plástico de 1,5 ml. NOTA: Reducir al mínimo la cantidad de memoria intermedia de enfriamiento que se transfiere.
11. Posteriormente, la lisis de los ovocitos haciéndolas pasar a través de una aguja 27 G en 1 ml de tampón de lisis (receta ver Tabla 1) suplementado con inhibidores de la proteasa.
12. Centrifugar los lisados ​​durante 10 min a 1500 x g.
13. Aspirar el sobrenadante y transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 0,5% de Triton-X-100 y 0,5% de NP40. Deseche el sedimento restante. NOTA: El sobrenadante contiene proteínas de la membrana de plasma con biotina y proteínas intracelulares no biotinilado.
14. Incubar los tubos de microcentrífuga durante 20 min en hielo. Repetidamente vórtice los tubos durante este periodo para disolver completamente el proteínas en NP40 y Triton-X-100.
15. Centrífuga de 100 l de perlas de agarosa por grupo de ovocitos durante 3 min a 1500 x g. Después de lacentrifugación eliminar el sobrenadante de la solución de perlas y lavar tres veces con tampón de lisis para equilibrar las cuentas con tampón.
16. Pipetear 100 l de las perlas lavadas en cada tubo de microcentrífuga que contiene el detergente-solución de proteína preparada en 4,13 para permitir la unión de las proteínas biotinilados a las perlas.
17. Incubar los tubos de microcentrífuga con sobrecarga de rotación O / N a 4 ° C.
18. Centrifugar los tubos de microcentrífuga durante 3 min a 1500 x g. A continuación, transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. NOTA: proteínas intracelulares no están etiquetados con biotina. El sobrenadante se puede almacenar a -20 ° C. No aspirar los talones.

5. Detección de ENAC Escote fragmentos en la superficie celular mediante análisis de transferencia Western

1. Lavar las perlas tres veces con tampón de lisis y añadir 100 l de 2x tampón de muestra de SDS-PAGE. NOTA: Las muestras se pueden almacenar a -20 ° C o inmediatamente prepararon para el análisis de transferencia de Western.
2. Hervir splos de 5 min a 95 ° C y luego colocar los tubos en hielo.
3. Centrifugar las muestras durante 3 min a 20.000 xg y la pipeta el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga. NOTA: Este sobrenadante contiene las proteínas de la membrana de plasma biotiniladas de la superficie celular de los ovocitos.
4. Analizar 30 l de este sobrenadante por Western blot para investigar fragmentos de escisión en la superficie celular.
5. Separar las proteínas biotiniladas por SDS-PAGE (dodecil sulfato de electroforesis en gel de poliacrilamida de sodio) usando un gel apropiado (8%, 10%, 12%, dependiendo del peso molecular de los fragmentos de escisión investigados).
6. Transferencia de las proteínas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas mediante transferencia semiseca.
7. La sonda de la membrana con un anticuerpo específico contra γENaC humano dirigido contra un epítopo en el extremo C-terminal (véase la Figura 3 y ^13).
8. Utilice peroxidasa de rábano picante de cabra marcada con anticuerpo anti-conejo como anti secundariacuerpo.
9. Detectar las señales quimioluminiscentes.

Resultados

Para investigar si la plasmina proteasa serina puede activar las corrientes mediadas por ENAC, Delta I _ami de ovocitos que expresan el ENaC individuales se determinó antes y después de 30 min de incubación de los ovocitos en-proteasa libre (de control) (Figura 2A) o una solución de plasmina que contiene (figura 2B) utilizando la técnica de fijación de voltaje de dos electrodos (véase la Figura 1). La exposición a la plasmina aumentó Delta I _IAM en cada ovocito medido. En contraste, en los experimentos de control, 30 min de incubación de ENaC-expresan en oocitos de solución de proteasa libre tuvo un efecto insignificante (Figura 2 C, D). Por lo tanto, mediante el uso de este método, una estimulación de la corriente mediada por ENaC por la plasmina se puede detectar.

Para estudiar los efectos de la mutación de los sitios de escisión putativo de la activación de las corrientes mediadas por ENAC, así como tras la escisión de canal, el efecto de la quimotripsina en WT-ENaC se comparó con la deun ENaC mutante con prostasina mutado y los sitios de escisión de la plasmina _{(RKRK178AAAA γ; K189A).} El curso temporal de la activación del canal por quimotripsina, así como la aparición de ENaC de escisión productos en la superficie celular se investigó mediante el uso de diferentes tiempos de incubación de la proteasa (Figura 4A). Se demostró que los retrasos de los canales mutantes y reduce la activación de la corriente mediada por ENaC por quimotripsina. Esto es paralelo a una aparición retardada de un fragmento de escisión molecular inferior γENaC peso de 67 kDa correspondiente a la subunidad totalmente escindido. Fragmentos de escisión se detectaron utilizando un anticuerpo γENaC dirigido contra un epítopo en el extremo C-terminal (Figura 3). Este enfoque metodológico demuestra que el curso temporal de la activación proteolítica de las corrientes mediadas por ENAC se correlaciona con la aparición de un producto de escisión de 67 kDa γENaC en la superficie celular (Figura 4 B, C). Esto apoya el concepto de unrelación de causalidad entre la escisión proteolítica de canal y la activación del canal ^13. Además, mediante la combinación de mediciones de corriente y la detección de fragmentos γENaC en la superficie celular se demostró que los sitios de escisión mutadas son funcionalmente relevante para la activación del canal proteolítica.

Figura 1. Procedimiento de determinar el efecto estimulador de una proteasa en ENaC heteróloga expresada en oocitos de Xenopus laevis. Actividad de ENaC se estima mediante la medición de la de células enteras componente de corriente sensible a amilorida Delta I _AMI.

Figura 2. Plasmina estimula curren mediadas por ENACts en oocitos que expresan ENAC. (Ad) Los ovocitos que expresan el ENaC humana se incubaron durante 30 minutos en solución de proteasa libre (control) o en solución que contiene plasmina (10 g / ml). Para determinar Delta I _ami antes (-) y después (+) de incubación, los ovocitos se sujetaron a un potencial de mantenimiento de -60 mV (A, B) Cuatro de células enteras trazas de corriente representativas de un lote de ovocitos.. Amilorida (ami) estaba presente en la solución del baño para inhibir específicamente ENaC como se indica por barras negras. (C) Los puntos de datos obtenidos a partir de un oocito individuales se conectan por una línea. (D) Resumen de experimentos similares, como se muestra en C. Las columnas representan efecto estimulador relativa en Delta I _ami calcula como la relación de Delta I _ami medido después de una incubación de 30 min (Delta I _IAM 30 min) para el _AMI Delta I inicial _(IAM Delta I inicial) medido antes de la incubación. Números dentro de las columnas indican elnúmero de ovocitos individuales medidos. N indica el número de diferentes lotes de oocitos. (Esta cifra se ha modificado a partir de [Haerteis et al 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763])

Figura 3. Modelo de la subunidad que muestra sitios de escisión de γENaC para la activación proteolítica y el sitio de unión del anticuerpo utilizado. La escisión proteolítica por la furina convertasa asociado-de Golgi es importante para la maduración de ENaC en la ruta biosintética antes de que el canal llega a la membrana plasmática. Después de la escisión por furina un fragmento de 76 kDa puede ser detectada en la superficie celular utilizando un enfoque de biotinilación y un anticuerpo contra un epítopo en el extremo C-terminal de la subunidad γ-. El último paso fundamental en proteolítica ESactivación aC probablemente tiene lugar en la membrana plasmática donde γENaC se escinde por proteasas extracelulares (por ejemplo, plasmina o quimotripsina) en una región distal al sitio de furina como resultado un fragmento de escisión de 67 kDa. (Esta cifra se ha modificado a partir de [Haerteis et al 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763])

Figura 4:. La mutación tanto de la plasmina (K189) y el sitio de escisión prostasina (RKRK178) retarda la activación de las corrientes mediadas por ENAC y la aparición de un producto de escisión de 67 kDa de γ-subunidad del canal oocitos que expresan WT (símbolos abiertos) y γ _RKRK178AAAA; canal mutante _K189A ENAC (símbolos cerrados) se incubaron durante 30 minutos en una solución exenta de proteasa (control) o de 5, 30, o 60 min en una solución que contiene quimotripsina (2 g / ml). (A) Para determinar Delta I _ami antes y después de la incubación, los ovocitos se sujetaron a un potencial de mantenimiento de -60 mV. Los círculos representan la relación de Delta I _ami medida después de 5, 30, o 60 min de incubación (Delta I _ami min) para el _AMI Delta I inicial _(IAM Delta I inicial) medido antes de la incubación. Cada punto de datos representa la media Delta I _ami medido en 22-24 ovocitos individuales de cuatro lotes diferentes. (BD) En paralelo a la detección de Delta I _IAM, la expresión de γENaC biotinilado en la superficie celular se analizó mediante SDS-PAGE. γENaC se detectó con un anticuerpo contra un epítopo en el extremo C-terminal de γENaC humana. Se muestran transferencias de Western representativas de un lote de ovocitos. (CE) El análisis densitométrico de tres transferencias de Western similares a los mostrados en B o D. Para cada carril, los signals detectados en las regiones de 76 kD (columnas en blanco) y 67 kD (columnas grises) se determinaron y se normalizó a la suma de la señal total detectado. N indica el número de diferentes lotes de ovocitos. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Discusión

En este manuscrito un enfoque metodológico que se aplicó con éxito para estudiar los mecanismos que subyacen a la activación de ENaC por proteasas se describe ^8,13. Se utilizó para funcionalmente expresa ENaC El sistema de expresión bien establecida de Xenopus laevis de ovocitos. Función de ENaC se evaluó con la técnica convencional de fijación de voltaje de dos electrodos. Se empleó la mutagénesis dirigida al sitio para identificar los sitios de escisión de la proteasa funcionalmente relevantes. Experimentos de biotinilación realizadas en paralelo con las mediciones electrofisiológicas hicieron posible correlacionar la aparición de ENaC de escisión de productos en la superficie celular con activación actual proteolítica. Una correlación entre el transcurso de tiempo de activación actual y la aparición de fragmentos de escisión proteolítica en la superficie celular es compatible con el concepto de activación del canal proteolítica.

De dos electrodos grabaciones de fijación de voltaje requieren el empalamiento de un Oocyte con dos microelectrodos. Este procedimiento generalmente se realiza sólo una vez en un oocito individual. Sin embargo, era factible para eliminar los microelectrodos después de una grabación actual de células enteras inicial sin daño aparente para el ovocito. De hecho, la membrana de plasma en los sitios de impalements aparece para volver a sellar dentro de unos pocos minutos. Por lo tanto, después de completar una primera medición de fijación de voltaje de dos electrodos, es posible transferir el ovocito de la cámara de flujo experimental de la configuración de fijación de voltaje de dos electrodos a un tubo de microfuga o un pocillo de una placa de 96 pocillos lleno de un pequeño volumen de solución de ensayo o de control. Después, el mismo oocito puede ser transferido de nuevo a la cámara de flujo y puede ser atravesado de nuevo para realizar una segunda medición de fijación de voltaje de dos electrodos. Sorprendentemente, las corrientes mediadas por ENAC no varían mucho entre la primera y segunda medición cuando el oocito se mantuvo en la solución de control. En contraste, la incubación de los ovocitos en un sol de proteasa que contienelución después de la primera medición se tradujo en un aumento de la corriente mediada por ENAC en la segunda medición (Figura 2). Este hallazgo indica la activación del canal proteolítica.

Realización de dos mediciones de corriente separadas en un solo ovocito ofrece la ventaja de que el ovocito puede estar expuesto a las proteasas u otros agentes farmacológicos entre las dos mediciones para una longitud variable de tiempo en un pequeño volumen de solución de prueba. Esto es importante cuando se utilizan agentes que son caros y / o no está disponible en grandes cantidades, por ejemplo, preparaciones de proteasa purificada. La disponibilidad limitada de agentes puede hacer que sea imposible (o inaccesibles) para usarlos en continuo de dos electrodos grabaciones de fijación de voltaje debido a los grandes volúmenes de solución de ensayo requerida para superfusión continua los ovocitos con tasas de flujo de varios mililitros por minuto. Por otra parte, las mediciones de fijación de voltaje de dos electrodos continuos están limitadas por el fenómeno bien conocidomeno de resumen canal espontánea también describen por ENAC ^15. En contraste, la exposición de ovocitos para poner a prueba soluciones entre dos mediciones separadas por hasta una hora o más generalmente no representa un problema (véase la figura 4A). Por último, dos mediciones secuenciales realizadas en el mismo oocito permiten pares de observaciones de los efectos de la droga. Esto tiene una ventaja sobre las mediciones no apareados de dos grupos separados de ovocitos (tratado con proteasa y tratado con vehículo), ya que reduce el problema de la alta variabilidad entre ovocitos, normalmente observados en la expresión de canales de iones. Con pares de observaciones y la posibilidad de normalizar los datos a la primera medición, se necesitan menos ovocitos por grupo experimental para demostrar un efecto significativo de un agente farmacológico. La normalización de los datos también hace que sea fácil de resumir los datos de diferentes lotes de ovocitos con diferentes niveles de expresión de los canales iónicos y, por tanto, diferentes corrientes de línea de base (Figura 2D). Obviamente, los experimentos de control son necesarios para este enfoque para demostrar que la actividad del canal iónico de interés se mantiene estable en los ovocitos de control tratados con vehículo desde la primera a la segunda medición (véase la Figura 2).

Para demostrar que la activación proteolítica de corriente se correlaciona con la aparición de productos de escisión de ENaC en la superficie celular, un enfoque de biotinilación originalmente descrito por Harris et al. ⁹ se puede utilizar. Este procedimiento (como se detalla en la sección de protocolo y muestra en la Figura 4) fue adaptado para demostrar que la exposición de los canales a las proteasas y la posterior activación de las corrientes mediadas por ENAC es paralela a la aparición dependiente del tiempo de fragmentos de escisión. El método de biotinilación también permite el análisis de un aumento global o la disminución de proteínas de membrana en la superficie celular. Por lo tanto, este método es adecuado para investigar el efecto de las proteasas y otros Pharagentes farmacológica sobre la inserción de canal en la membrana de plasma o sobre la recuperación de canal. Además, el análisis de transferencia Western de las proteínas de la membrana de plasma con biotina permite la detección de fragmentos de proteína (por ejemplo, fragmentos proteolíticos ENaC) o cambios en el patrón de glicosilación que puede ser funcionalmente relevante.

En conclusión, la combinación de los métodos utilizados para investigar el efecto estimulador de proteasas en las corrientes de células enteras mediadas por ENaC y para demostrar una correlación con la aparición de productos de escisión de ENaC en la superficie celular puede ser útil para una amplia gama de aplicaciones. En particular, estos métodos pueden ser adecuadas para abordar cuestiones similares con respecto a la regulación de otros canales iónicos, transportadores o receptores transmembrana (por ejemplo, los receptores activados por proteasas PAR).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Equipo
Cabezal de abrazadera de baño para OC-725C-V	Warner Instrument Corporation
Fuente de luz fría - Schott KL 1500 LCD	Schott	#SCOC150200EU	brillo 4; apertura mecánica: D; temperatura de color: 3.000 K
Portaelectrodos de la serie E (Str, Vent, Ag Wire, 1,2 mm)	ADinstruments	#ESW-F10v
Left micromanipulador; MM-33L	Warner Instrument Corporation	#64-0055
LIH 1600 - interfaz de ordenador	HEKA
(ALA BPS-8) en combinación con una interfaz TIB14 (HEKA)	ALA Scientific Instruments, amplificador HEKA
OC-725C para grabaciones de pinza de voltaje de dos electrodos	Warner Instrument Corporation
P-97 FLAMING/MARRÓN Extractor de micropipetas	Sutter Instruments		calor = 550; velocidad = 22; tiempo = 200
Micromanipulador derecho; MM-33R	Warner Instrument Corporation	#64-0056
Series portaelectrodos (45 grados, ventilación, manija, alambre agrícola, 1,2 mm)	ADinstruments	#E45w-f10vh
Controlador de flujo gravitacional STAT 2 IV	Conmed	#P-S2V-60
Eyector de generador de vacío SEG - para aspiración para eliminar la solución de baño	Schmalz
INFUJECT Jeringas con bomba de 60 ml para soluciones	Braun	#22050
Injekt-F para lisar los ovocitos	Braun	#9166033V
Tubo de borosilicato de pared estándar con filamento	Sutter Instruments	#BF150-86-10	diámetro exterior: 1,5 mm; diámetro interior: 0,86 mm; longitud: 10 cm
Comprimidos de cóctel de inhibidores de proteasas completos, mini, sin EDTA	Roche Applied Science	#11836170001
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin	Thermo Scientific	#21217
Anticuerpo secundario anti-conejo de cabra marcado con peroxidasa de rábano	picante Santa Cruz Biotechnology	#sc-2004
NeutrAvidin Agarose	Thermo Scientific	#29200	Perlas de agarosa marcadas con neutravidina
NP40 (Nonidet P-40)	Sigma-Aldrich	#I8896
Roti-Load 1 (2x SDS-PAGE muestra tampón)	Carl Roth	#K929.2
SuperSignal West Femto Sustrato quimioluminiscente para la detección de señales quimioluminiscentes	Thermo Scientific	#34095
Triton-X-100	Sigma-Aldrich	#T8787

Sistema de válvulas magnéticas