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Summary

Mouse models have become increasingly popular in studies of behavioral neuroscience. As models advance, it is important to develop sensitive behavioral measures specific to the mouse. This protocol describes the Pasta Matrix Reaching Task, which is a skilled motor task for use in mouse models of stroke.

Abstract

Los modelos de ratón se han convertido cada vez más popular en el campo de la neurociencia conductual, y, específicamente, en los estudios sobre el accidente cerebrovascular experimental. Como modelos de antelación, es importante el desarrollo de medidas de comportamiento sensibles específicos para el ratón. El presente protocolo describe una tarea motora especializada para su uso en modelos de ratón de un derrame cerebral. The Matrix Pasta Alcanzar funciones de tareas como un ensayo de comportamiento versátil y sensible que permite experimentadores para recoger datos de los resultados precisos y manipular utilización extremidad para simular fenómenos clínicos en humanos, incluyendo estrategias compensatorias (es decir, aprendido no uso) y se centró la formación de rehabilitación. En combinación con las herramientas neuroanatómicos esta tarea también permite a los investigadores a explorar los mecanismos que apoyan la recuperación de comportamiento de la función (o falta de ella) después de derrame cerebral. La tarea es simple y asequible para configurar y conducta, ofreciendo una variedad de opciones de formación y las pruebas para numerosas preguntas de investigación relativas a functional resultado después de una lesión. Aunque la tarea se ha aplicado a modelos de ratón de accidente cerebrovascular, sino que también puede ser beneficioso en los estudios de resultado funcional en otros modelos de lesión de las extremidades superiores.

Introduction

Los modelos de ratón se han convertido en cada vez más popular para la investigación experimental accidente cerebrovascular debido en parte a su conveniencia y el precio, así como la disponibilidad de líneas transgénicas que son adecuados para imágenes in vivo entre otras aplicaciones. Con este aumento de la popularidad en los modelos experimentales, el interés en el desarrollo de las evaluaciones de comportamiento sensibles del resultado funcional después de una lesión también ha aumentado ^1-7. El desarrollo de protocolos de entrenamiento de animales que imitan tanto la rehabilitación y estrategias de compensación utilizado por sobrevivientes de accidentes cerebrovasculares humanos mejora la capacidad de traducir con éxito los resultados de estudios experimentales en animales para su uso en la clínica ^8. Entrenamiento en habilidades de motor en la Matriz de Pasta Alcanzar Task (RTPM) se ha establecido previamente como una evaluación de comportamiento sensible de resultados habilidad motora tras una lesión isquémica de la corteza sensoriomotora ^3.

Uno de los intereses primarioss en el accidente cerebrovascular preocupaciones investigación rehabilitación y el desarrollo y la comprensión de las estrategias de comportamiento que promuevan la mejora de la recuperación de la función siguiente insulto. Actualmente, las estrategias de rehabilitación en los seres humanos como resultado incompleta ⁸ de recuperación. Además, los terapeutas de rehabilitación deben combatir las estrategias compensatorias que sobrevivientes de accidentes cerebrovasculares se desarrollan durante la recuperación que pudiera afectar a su capacidad de funcionamiento de su extremidad afectada (s) recuperar totalmente. Por ejemplo, a raíz de un derrame cerebral unilateral que afecta la función de las extremidades superiores, los seres humanos tienden a desarrollar una confianza en su extremidad inferior afectada por el ^{9, 10.} Al tiempo que mejora la capacidad de una persona para funcionar en el corto plazo, esto aprendió la falta de uso de la extremidad afectada puede impedir su máximo potencial de recuperación, como se ha demostrado en modelos animales ^11-13. Estos hallazgos en animales han ayudado a informar sobre el desarrollo y el uso de la terapia de movimiento inducido por restricción en el ser humano ^14. Los modelos animales son benefil para la mejora de las estrategias de rehabilitación, al permitir a los investigadores a explorar los mecanismos neurobiológicos que subserve y promover la recuperación de la función. Además de ser una evaluación de la conducta efectiva de la función después del accidente cerebrovascular, el RTPM se ha establecido como una estrategia de rehabilitación efectiva de promover un mejor resultado funcional después del accidente cerebrovascular sensoriomotora ^15. El RTPM también se puede utilizar para la no utilización efectiva mímica aprendido de la extremidad afectada y por lo tanto ofrecen una idea de la manipulación del comportamiento que pueden mejorar la recuperación funcional pese inicial exceso de confianza en la extremidad inferior ^afectada-13.

Construcción de la RTPM se ha descrito previamente ^3. En pocas palabras, la cámara de llegar se compone de cuatro paredes de plexiglás (20 cm de alto, 15 cm de largo y 8,5 cm de ancho) con una parte superior abierta y la parte inferior. Hay una hendidura central (13 cm de altura y 5 mm de ancho) que se extiende desde la base inferior de la pared frontal de la cámara que sirvecomo la abertura de alcanzar (Figura 1A). La matriz de la pasta es un bloque de plástico de alta resistencia (8,5 cm de largo, 5 cm de ancho y 1,5 cm de altura) con agujeros de diámetro 1 mm perforados por completo a través de la profundidad del bloque. Hay un total de 260 agujeros, comenzando 2 mm desde la ventana de llegar con 2 mm entre cada agujero (fig. 1B). La matriz de la pasta está diseñado de tal manera que, piezas de pasta secas orientadas verticalmente se extienden a través de toda la profundidad de la fase de matriz con aproximadamente la mitad de la pieza de pasta expuesta. Una pieza extraíble de plástico encima de la cabeza o cartulina se debe cortar a tamaño y asegurado con cinta adhesiva a la parte inferior de la matriz. Esto evita que las piezas de pasta de caer fuera de la matriz durante el transporte y permite una fácil extracción de las piezas de pasta rotos.

El RTPM es un ensayo de comportamiento versátil y sensible que permite experimentadores para recoger datos de los resultados precisos y manipular el uso del miembro para imitar fenómenos clínicos. Como o de comportamientoESULTADO medida, la RTPM permite experimentadores para recoger datos de comportamiento que refleja con más precisión la eficacia de una estrategia de rehabilitación que hace la medida tradicional de tamaño del infarto ^{3, 16.} Como la manipulación del comportamiento, la RTPM permite experimentadores para controlar el uso de las extremidades superiores en los ratones en los fin de imitar las experiencias clínicas de rehabilitación (es decir, formación extremidad afectada) o no uso aprendido (es decir, la formación extremidad inferior afectada). Cuando se combina con métodos neuroanatómicos, el RTPM proporciona a los investigadores una oportunidad para explorar los mecanismos que apoyen la recuperación del comportamiento de la función o de la plasticidad de mala adaptación tras el uso del miembro compensatoria después del accidente cerebrovascular. El RTPM podría aplicarse además a otros modelos murinos de lesión cerebral y el deterioro de las extremidades superiores, tales como lesión cerebral traumática. Otra ventaja de la RTPM es su asequibilidad. El equipo requerido para la tarea puede ser construido bastante razonable en casa, la recopilación de datos haceno requiere una gran cantidad de espacio o los recursos financieros, y la tarea es bastante simple para los estudiantes de pregrado para recoger datos de forma fiable. Además, el RTPM es sensible a incluso pequeños déficits de comportamiento ^{3, 13.} Este protocolo proporciona una manera simple y eficaz para evaluar el aprendizaje de habilidades motoras, promover la recuperación conductual después de una lesión, y los fenómenos de no uso aprendido imitan en un modelo murino de accidente cerebrovascular establecido.

Protocol

Los siguientes métodos están de acuerdo con los protocolos aprobados por la Universidad de Texas en Austin y Illinois Wesleyan Animal Comités tenga cuidado y use. Se recomienda que los investigadores o bien usar guantes o tomar las precauciones adecuadas (lavarse las manos antes y después) cuando participan en la formación del comportamiento con cualquier animal de laboratorio. Se deben usar guantes al manipular animales en la preparación y durante la cirugía. 1. Habituación y la Alimentación Restricción NOTA: A medida que el RTPM es una tarea apetitiva, es beneficioso para restringir la cantidad y el momento de la alimentación antes del inicio de la formación con el fin de motivar la respuesta alcance y evitar la saciedad durante las sesiones de entrenamiento. Coloque los ratones en un horario de alimentación restringida a partir de al menos 1 semana antes del inicio de la capacitación de tareas. Pesar cada ratón antes de la aparición de la restricción de alimentos para establecer los pesos de alimentación libre, que son determinados como THe pesos de cada animal en el primer día de la alimentación restringida. Alimente los ratones una vez al día, con cada receptor de ratón ~ 2,5 g de alimento estándar para roedores por día (por ejemplo, si hay 4 ratones alojados en una jaula, la jaula recibirá 10 g de alimento al día). Asegúrese de alimentación se produce a la misma hora cada día, preferiblemente en el momento se espera que las sesiones de entrenamiento diario para concluir. Pesar animales regularmente para asegurarse de que ningún ratón pierde más del 10% de su peso en periodo libre. NOTA: Ajuste las cantidades diarias de alimentos de acuerdo para promover el mantenimiento del peso adecuado. Los ratones suelen ganar peso a medida que maduran, incluso con los ratones de restricción alimentaria constantes permanecen en la restricción de alimentos durante la duración de la RTPM formación / evaluación. Exponer animales en trozos más pequeños de pasta (cortadas a 1,6 cm) en su jaula varias veces antes del entrenamiento con el fin de superar las respuestas neophobic. NOTA: Por lo general 5 a 10 días de exposición son suficientes, con cerca de 4 piezas por disposición del mouseded en cada alimentación. Corte las piezas de pasta al tamaño (3,2 cm) usando una cuchilla de afeitar. NOTA: Se recomienda que el exceso de piezas de pasta se cortan antes de comenzar el entrenamiento del día y piezas utilizados almacenados en un recipiente hermético. La pasta Capellini se utiliza para llenar la matriz. Como las diferentes marcas de pasta varían en textura y diámetro, que podría influir en la estabilidad de la pasta en la matriz o la cantidad de fuerza necesaria para los ratones para romper la pasta, se recomienda que DeCecco de pasta marca se utiliza en toda la formación y las pruebas. Coloque trozos de pasta sin cocer capellini en la matriz de la pasta, llenando todos los agujeros disponibles en la matriz (Figura 1A). Habituar a los ratones a la cámara de pruebas con una matriz de pasta llena colocado delante (Figura 1A) y varias piezas de pasta para comer en la parte inferior de la cámara de pruebas. Habituar a ratones durante 3 sesiones de 5 a 10 min. NOTA: Los ratones no deben ser alentados a alcanzar para la pasta durante la habituacióncapacitación ción. Los ratones generalmente comienzan a mostrar interés en la pasta situada fuera de la cámara de llegar oliendo a él a través de la abertura. Es posible habituar a dos compañeros de jaula en una sola cámara, si se desea, pero los ratones debe ser formado y entrenado individualmente. Todas las superficies deben ser limpiadas con etanol al 70% o una solución desinfectante similares, caja de seguridad antes y después de cada animal se coloca en el aparato de comportamiento. 2. Conformación del Alcance Determinar extremidad preferida de cada animal mediante la conformación del alcance durante 3-5 ensayos de conformación una vez al día. Permitir que los ratones para llegar durante 10 minutos o un total de 10 veces, lo que ocurra primero. Coloque los ratones individualmente en la cámara de pruebas con una matriz de pasta completa en frente de la cámara como en el entrenamiento de habituación (Figura 1A). Anote el número de tramos con cada extremidad, lo que denota el número de tramos con el derecho y las extremidades izquierda por separado. Definir un alcance como la extensiónde la extremidad a través de la abertura de alcanzar de tal manera que la muñeca rompe el plano de la cámara; no es necesario para el alcance que se dirige hacia o hacer contacto con la pasta. Mantenga varias piezas de pasta justo dentro de la cámara a través de la abertura de llegar a alentar los ratones que son reacios a alcanzar. Dibuja las piezas de pasta cuando el ratón muestra interés (por ejemplo, inhalación, morder), para animarles a llegar después de las piezas de pasta en retirada. Si los ratones no muestran inicialmente interés en la pasta seca, luego mojar las puntas de las piezas de pasta en una pequeña taza de agua tibia para hacerlos más apetecibles. Determinar la preferencia extremidad cuando un ratón exhibe un mínimo de 70% de sus alcances diarias con una sola extremidad. No a un exceso de la forma de animales, ya que esto puede limitar la cantidad de aprendizaje observada durante la parte de la formación de las tareas que llegan a 17. Comenzar el entrenamiento RTPM una vez que se forman los ratones. NOTA: La formación puede iniciarse tan pronto como el next día, pero también es aceptable que esperar varios días entre la formación y los procedimientos de formación. Entrenamiento 3. Llegar Tren ratones una vez al día antes de insultar a fin de establecer el dominio sobre la RTPM. NOTA: Cada prueba consta de un máximo de 15 min o 100 tramos contabilizados por el observador (con y sin éxito), lo que ocurra primero. Los ratones están capacitados para alcanzar sólo con su miembro preferido. Ratones tolerarán dos ensayos por día si un paradigma de entrenamiento más intenso se desea 18. Coloque los ratones en la cámara de pruebas con una matriz de medio completo colocado delante (Figura 1B). Ratones tren para llegar sólo con su extremidad preferida rellenando sólo el lado contralateral de la matriz para la extremidad preferida puesto que los ratones llegan a través de la línea media de su cuerpo. Deja la parte de la matriz correspondiente a la extremidad unpreferred sin llenar con el fin de desalentar los intentos de alcanzar con esta parte (que no sería sUccessful porque no pueden llegar a la pasta) y animar a alcanzar sólo con la extremidad preferida. Coloque una pequeña cantidad de presión sobre la pasta mientras se encuentra en la matriz para ayudar a los ratones se rompen con éxito piezas durante las sesiones de formación temprana. No rompa las piezas de pasta para el ratón. Lograr esto mediante la celebración de una o dos piezas de pasta ligeramente detrás y perpendicular a la meta de llegar a lo previsto. Esta pequeña cantidad de apoyo ayuda a estabilizar la pasta fina, que es bastante flexible y difícil para los ratones para comprender lo que están aprendiendo inicialmente la tarea. Anote el número total de tramos, el número de tramos de éxito, y la ubicación de alcances exitosos. Alcances exitosos requieren el ratón para llegar a través de la abertura, agarra un pedazo de pasta, y romper la pieza de pasta para quitarlo de la matriz. NOTA: pedazos de pasta no deben ser sustituidos en la matriz hasta después de la prueba ha terminado. A principios de entrenamiento, los ratones no se romperán muchos pedazos de pasta. Ratones Tren en la RTPM a ser competente, que se define como al menos 3 días (y hasta 5 días) de un rendimiento constante (que se rompen en menos 9 piezas de pasta con no más de 2 más o menos piezas en días). Tarda a menudo entre 15 a 20 días para entrenar a los ratones adultos jóvenes a ser competente. 4. Formación de extremidades afectadas por Menos Capacitar a la extremidad inferior afectada (es decir, la extremidad unpreferred preoperatoria) que empezará cuatro días después de lesión isquémica de la corteza motora contralateral a la extremidad de llegar preferido (ver Figura 2 aclaraciones sobre las extremidades afectadas / preferido y less-affected/unpreferred) . Administrar sesiones una vez al día de 15 minutos o de formación 100-alcance. Retire la primera columna de la pasta (es decir, la columna vertical más medial que se extiende desde la abertura de llegar a) para la primera semana de la formación extremidad menos afectada-con el fin de garantizar que llega temprano con el miembro afectado no tienen éxito. <li> ratones lugar en la cámara de llegar con la matriz de la mitad lleno colocado delante. Asegúrese de que el medio lleno de la matriz es opuesto de la pre-operatorio de llenado medio, lo que obligará a los ratones para llegar a ahora con la (unpreferred) extremidad menos afectada-. Anime a alcanzar con la extremidad inferior afectada reforzando extensión de esta extremidad a través de la abertura de llegar. Cuando los ratones se extienden de la extremidad inferior afectada en los primeros días de su lugar de entrenamiento, una pequeña (1/2 pieza) de la pasta en el piso de la cámara de llegar independientemente de si o no el alcance es exitoso. Contar sólo los alcances realizados con la extremidad inferior afectada hacia el total alcance 100. No cuente intentos furtivos con la extremidad afectada hacia el número total de tramos. Devuelva la columna vertical más medial de la pasta a la matriz después de los primeros 7 días de entrenamiento de miembros menos afectados. Anote el número de tramos, el número de tramos de éxito, y la ubicación de succalcances essful. NOTA: Estos datos pueden ser analizados para observar las diferencias en los patrones de alcanzar con la extremidad menos afectada-, pero no se ha informado anteriormente. Análisis 5. Alcanzar Determinar el impacto de los afectados por el menor uso de las extremidades en la recuperación de la función del miembro afectado mediante la evaluación de la extremidad afectada en la tarea RTPM siguiente entrenamiento de miembros menos afectados. Esta evaluación se produce después de que el número deseado de días de formación extremidad menos afectadas son completos (normalmente 14 días). Coloque la matriz en frente de la cámara, orientada de forma idéntica a los procedimientos de formación (es decir, con la mitad de la matriz contralateral a la extremidad preferida lleno). NOTA: Esto obliga a los ratones para llegar con su afectada (y previamente preferido) extremidad. Anote el número total de tramos, el número de tramos de éxito, y la ubicación de alcances exitosos para comparar con los niveles de rendimiento pre-accidente cerebrovascular. No pruebe el rendimiento deel miembro afectado durante el entrenamiento de miembros menos afectados-ya que estas sondas extremidad afectada puede funcionar como sesiones de formación que podrían afectar a la recuperación de la extremidad afectada.

Representative Results

Los resultados del análisis de RTPM deben incluir el número de piezas de pasta roto y el patrón de partes más exitosos. Los resultados de los ratones con lesiones corticales sensoriomotoras indican que el insulto isquémico afecta tanto el número de tramos de éxito, así como los patrones de alcance físico 3, 19, como se muestra en la Figura 3A. Cambios en el patrón de representación se pueden observar en la Figura 3B. La capacidad de la RTPM para imitar los efectos …

Discussion

El RTPM representa una forma sencilla, cuantitativa para evaluar el rendimiento de alcanzar expertos en ratones. Aunque mucho tiempo, es posible que los estudiantes previamente sin experiencia para ser entrenados para recoger datos fiables y reproducibles, con sólo unas pocas sesiones de entrenamiento. La tarea es lo suficientemente sensible como para medir incluso pequeños cambios en el rendimiento de las habilidades motoras del ratón siguientes insulto isquémico ^{3, 13, 15,} y una serie de estudios de cit…

Materials

Reaching chamber			Reaching chambers are made in house with Plexiglas
Pasta matrix block			The Pasta matrix box is made in house using a heavy plastic block
Capellini pasta	DeCecco		DeCecco brand capellini pasta can be purchased in a grocery store or through an online retailer such as Amazon