El objetivo de este protocolo es utilizar valoraciones redox monitoreadas por resonancia paramagnética electrónica (EPR) para identificar diferentes cofactores de Saccharomyces cerevisiae Nar1. Las valoraciones redox ofrecen una forma muy robusta de obtener potenciales de punto medio de diferentes cofactores activos redox en enzimas y proteínas.
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EPR supervisado Redox La titulación de los cofactores de
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Resumen
Resumen
Resonancia Paramagnética Electrónica (EPR) supervisa valoraciones redox son un poderoso método para determinar el potencial punto medio de cofactores en proteínas y para identificar y cuantificar los cofactores en su estado redox detectable.
La técnica es complementaria a la electroquímica directa (voltametría) se aproxima, ya que no ofrece información sobre las tasas de transferencia de electrones, pero no establecer el estado redox identidad y de los cofactores en la proteína en estudio. La técnica es ampliamente aplicable a cualquier proteína que contiene una resonancia paramagnética electrónica (EPR) cofactor detectable.
Una titulación típica requiere proteína de 2 ml con una concentración de cofactor en el intervalo de 1-100 mM. La proteína se valora con un reductor químico (ditionito de sodio) o el oxidante (ferricianuro potásico) para contrapesar la muestra en un determinado potencial. Un alambre de platino y un electrodo de referencia de Ag / AgCl se conectan a un voltiometro para medir el potencial de la solución de proteína. Un conjunto de 13 diferentes mediadores redox se utiliza para equilibrar entre los cofactores redox de la proteína y los electrodos. Las muestras se extraen a diferentes potenciales y los espectros de Resonancia Paramagnética Electrónica, característicos de los diferentes cofactores redox en la proteína, se midieron. La trama de la intensidad de la señal en comparación con el potencial de la muestra se analiza utilizando la ecuación de Nernst con el fin de determinar el potencial de punto medio del cofactor.
Introducción
Llama la atención que los procesos químicos más fundamentales que sustentan la vida en este planeta, la fotosíntesis, la fijación de nitrógeno y la respiración, son catalizadas por grandes complejos de proteínas que contienen una amplia gama de cofactores redox orgánicos e inorgánicos. Se ha estimado que aproximadamente el 30% de todas las proteínas contienen uno o más cofactores metálicos. 1,2 identificación y caracterización de los cofactores redox se pueden establecer utilizando la electroquímica directa (por ejemplo, proteína de voltametría película) o valoraciones redox. Las dos técnicas son complementarias en su naturaleza y aplicabilidad. Voltamperometría ofrece determinación rápida de potenciales de punto medio y la cinética de transferencia de electrones de cofactores que pueden reaccionar con una superficie de electrodo. 3,4 lo general, esto funciona bien para las proteínas de transferencia de electrones, tales como citocromo c o ferredoxina. Y a veces funciona para las proteínas más complejas que han sido inmovilizados a una superficie del electrodo. El conocimiento detallado de lanaturaleza de cofactores en la proteína tiene que estar disponible, ya que el voltamograma no dará ninguna información directa sobre la identidad del cofactor. Valoraciones redox son más laborioso para ejecutar y requieren cantidades mg de proteína. Sin embargo, ofrecen información sobre el potencial punto medio y la identidad del cofactor. 5 Además, en una sola titulación múltiples cofactores en una proteína pueden ser monitoreados.
El principio de una titulación redox es que la proteína activa redox o enzima se reduce o se oxida químicamente. Con el fin de asegurarse de que los cofactores reaccionan con los mediadores reductor u oxidante redox se utilizan. Estos mediadores redox también reaccionan con un electrodo de modo que el potencial de la solución se puede medir. Los mediadores actúan como un tampón redox y se equilibran entre los cofactores en la proteína y el electrodo. Después de poising químicamente el potencial en el valor deseado, se extrae una muestra y rápidamente congelados en nitrógeno líquido en AWait posterior análisis con técnicas espectroscópicas. Espectroscopia EPR es particularmente útil a este respecto, ya que puede ser usado para medir cuantitativamente centros metálicos paramagnéticos o radicales orgánicos.
La valoración redox se puede realizar en dos direcciones: de menor a mayor o de mayor a menor potencial punto medio. La elección depende de la estabilidad de los cofactores en estudio. A menudo es prudente comenzar a bajo potencial y añadir oxidante para escalonadamente aumentar el potencial. Esto se llama una titulación oxidativo y se describe aquí. Aquí mostramos la valoración redox del cluster hierro-azufre que contiene proteína Nar1 de Saccharomyces cerevisiae. Esta proteína está implicada, probablemente como un andamio de proteínas, en la citosólica de hierro-azufre biosintética clúster maquinaria (CIA vía) 6,7.
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Protocolo
1. Preparación de la instalación y Soluciones
- Preparar la solución tampón que contiene Tris 100 mM, NaCl 250 mM y 10% de glicerol a pH 8,5. Purgar el tampón por lavado con argón. Introducir el tampón en una cámara anaeróbica.
- Divida la memoria intermedia en dos porciones. A una porción (tampón A) añadir 1 mM DL-ditiotreitol (DTT, M r 154,25 g / mol) y 1 mM de L-cisteína. La otra parte (tampón B) no contiene agentes reductores.
- Preparar soluciones oxidantes y reductores. Hacer 1 ml de soluciones de 2, 20 y 200 mM ferricianuro de potasio (FIC, M r 329,26 g / mol) y de ditionito de sodio (SD, M r 174,11 g / mol) en tampón anaeróbica B.
- Preparar la mezcla mediador como sigue:
- Añadir 160 M de cada uno de los siguientes mediadores redox y NaCl 50 mM a tampón B: N, N, N ', N' tetrametil-p-phenylendediamine (TMPD, M r 237,17 g / mol, E '0 0,276 V) , 2,6-diclorofenol indofenol(DCIP, M r 290,08 g / mol, E '0 0.217 V), etosulfato fenacina (PSE-M r 334,4 g / mol, E' 0 0.055 V), azul de metileno (M r 319,85 g / mol, E ' 0 0.011 V), resorufina (M r 235,17 g / mol, E '0 -0,051 V), Indigodisulphonate (M r 466,35 g / mol, E' 0 -0,125 V), 2-hidroxi-1,4-naphtaquinone ( M r 174,15 g / mol, E '0 -0,145 V), antraquinona-2-sulfonato de (M r 328,28 g / mol, E' 0 -0,225 V), fenosafranina (M r 322,8 g / mol, E '0 -0,252 V), safranina O (M r 350,84 g / mol, E '0 -0,280 V), rojo neutro (M r 288,8 g / mol, E' 0 -0,340 V), bencilo viológeno (M r 409,4 g / mol, E '0 -0,350 V), y metil viológeno (M r 257,16 g / mol, E' 0 -0,440 V).
- Envuelva la botella en papel de aluminio para proteger el mediadors de la luz.
- Preparar 10 mg / ml S. cerevisiae proteína Nar1 strep-etiquetado (181 M, M r 55,2 kDa) en tampón A. expreso S. cerevisiae Nar1 en E. coli como una proteína Strep-etiquetados utilizando un vector de expresión pET24a. Se purifica la proteína en una cámara anaeróbica utilizando medios de cromatografía Strep-Tactin (IBA) y purificar usando un sistema de purificación de proteínas tales como purificador Akta (GE Healthcare).
- Preparar la configuración de titulación redox en una cámara anaeróbica como sigue:
- Conectar un electrodo de referencia Ag / AgCl y un electrodo de alambre de platino para el recipiente de valoración. Conecte los dos electrodos a un voltímetro que pueden medir desde mV hasta V.
- Inserte una pequeña barra de agitación.
- Coloque el recipiente de valoración por encima de un agitador magnético.
- Llene el recipiente de valoración con Tampón B, solución mezcla mediador y solución de proteína de hasta 2 ml, es decir, a concentraciones finales de proteína de 72 mM y 38 mM de cadamediador. Nota: dependiendo de la concentración de proteínas y el mediador requieren concentraciones de las cantidades de las tres soluciones debe ser ajustado.
- Se agita durante 30 minutos y encienda el voltímetro.
- Preparar 10 tubos de vidrio de cuarzo EPR limpias. Introducir los tubos en la cámara anaeróbica.
- Llenar una pequeña (circa 200 ml) Dewar de nitrógeno líquido con nitrógeno líquido.
2. Realice Valoración redox
- Espere hasta que el potencial de la solución es estable. Nota: En la práctica esto significa que el potencial se desplaza menos de 1 mV por minuto.
- Anote el potencial dado por el voltímetro.
- Dibuje la primera muestra de 200 l e inyectar en un tubo de EPR.
- Se tapa el tubo con un tapón de goma y retire el tubo de la cámara anaeróbica.
- Congelar el tubo en nitrógeno líquido de la siguiente manera: ¡Precaución! Esto tiene que ser hecho lentamente, de lo contrario el tubo se rompa.
- Primero inserte el tip del tubo en el nitrógeno líquido.
- Espere hasta que un silbido se escucha. Nota: Esto puede tardar hasta 10 segundos.
- Introduzca lentamente el resto del tubo de modo que la parte de la muestra está completamente sumergida.
- Añadir una pequeña alícuota 1-2 l de la solución 2 mM SD a la solución en el recipiente de valoración para reducir el potencial de la solución a -0,6 V.
Nota: Si hay más de 10 l tiene que añadir, cambiar a la solución de 20 mM. Como es muy difícil de contrapesar a un valor potencial específica, los valores reales registrados en el voltímetro se anotan y se usaron para construir la curva de titulación. - Dibuja una muestra como se describe en el paso 2.3 a 2.5.
- Anote el potencial real propuesta por el voltímetro.
- Añadir oxidante hasta que el potencial se ha incrementado en alrededor de 50 mV. Comience agregando una pequeña alícuota 2/1 l de la solución 2 mM FIC. Si más de 10 l tiene que ser añadido, cambiar a la solución 20 mM.
- Anote how gran parte de las soluciones se ha agregado. Nota: Esto es necesario para corregir la dilución de la muestra durante la valoración.
- Dibuje una muestra como se describe en el 2/3 a 2/5 pasos.
- Anote el potencial real propuesta por el voltímetro.
- Repita los pasos 2,9 y 2,12 hasta el rango potencial de -0,6 V a 0,2 V ha sido cubierto y los 10 tubos de EPR se llenan cada uno con 200 l.
Nota: Como se reduce el volumen con cada retirada puede ser necesario ajustar el posicionamiento de los electrodos de tener un buen contacto con la solución sin interferencia de la agitación. Puede ser difícil para medir el potencial después de la retirada de la última muestra y por lo tanto el potencial de que la muestra puede ser menos precisa. - Opcionalmente, almacenar las muestras EPR congelados en nitrógeno líquido hasta que las medidas de EPR pueden tener lugar.
3. Medida de titulación muestras utilizando EPR Espectroscopia y análisis de datos
- Record EPR espectros de los diferentesmuestras de titulación de la siguiente manera:
- Utilice una bomba de alto vacío para evacuar un criostato de cuarzo a <10 -5 bar.
- Conectar la refrigeración por agua del imán EPR. Abrir el flujo de aire seco a través de la cavidad de EPR.
- Encienda la fuente de alimentación para el imán y el equipo de la EPR.
- Ejecutar un programa de calibración de frecuencia. Establezca los parámetros de medición del EPR. Conecte el criostato al dewar helio líquido. Se enfría la cavidad a 9-16 K.
- Introducir la muestra EPR en la cavidad. Registre el espectro EPR.
- Identificar las diferentes especies de EPR y utilizar el mejor espectro para cuantificar las señales. Lograr EPR cuantificación por doble integración de los espectros y la comparación con el espectro de una solución estándar externa de cobre mM CuSO 10 mM HCl 4/10 / 2 M NaClO 4. 8
- Hacer la curva de valoración de la siguiente manera:
- Trazar la amplitud de la señal de EPR en un g-valor que es característico para el paraespecies magnéticas de interés frente al potencial.
- Cambie la escala de amplitud de la señal de EPR a un giros / escala molécula mediante la cuantificación EPR desde el paso 3.2.
- Corregir la amplitud de la señal de cada muestra para la dilución que se ha producido debido a las adiciones de agente oxidante o reductor.
- Corregir el potencial para el potencial punto medio del electrodo de referencia Ag / AgCl.
Nota: El electrodo de referencia Ag / AgCl (con solución saturada de KCl) tiene un potencial punto medio de 0.194 V frente al electrodo de hidrógeno estándar (SHE) a 25 ° C. Por lo tanto, si el potencial en el voltímetro lee alrededor de -0,6 V, con el potencial de referencia a la que ella está -0,4 V.
- Montar la señal a la ecuación de Nernst de la siguiente manera:
Por una especie que es paramagnético en el estado reducido:
Para una especie que es paramagnético en el oestado xidized:
Para una especie que es paramagnético en un estado intermedio:
Estas ecuaciones son válidas para las reacciones redox en los que se transfiere un electrón, por lo que n = 1.
E = potencial en voltios
E m = potencial de punto medio en Volt
F = constante de Faraday = 96480 C · mol -1
R = constante de los gases = 8.314 J · K -1 mol -1
T = Temperatura en grados Kelvin
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Resultados
La titulación redox del cluster hierro-azufre que contiene proteína Nar1 a partir de Saccharomyces cerevisiae como resultado la identificación de tres cofactores diferentes: Nar1: un racimo [3FE-4S], un grupo [4Fe-4S] y un centro de Fe mononuclear (Figura 1) . Las señales EPR se caracterizan por sus valores g: para el [3FE-4S] + g z 2.01, 2.00 g de crossover (Figura 1B); para el [4Fe-4S] +, g z 2,02 g y 1,93, g <...
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Discusión
La serie de 13 mediadores redox permite un equilibrio redox en la solución en el rango de -0,45 a 0,3 V frente a SHE (Tabla 1 y Figura 3). Bien por encima y por debajo de estos potenciales de todos los mediadores son o bien totalmente reducidos o completamente oxidados y, por tanto, no más lejos de equilibrio con los centros redox activos de la proteína pueden ocurrir. Este es un concepto importante, como en la literatura titulaciones redox veces se llevan a cabo con sólo dos o tres med...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado financieramente por una beca de investigación de la Escuela Nacional de Investigación Combinación holandés, Catálisis Controlado por Diseño Química (NRSC-Catálisis). Dr. HY Steensma y el Dr. GPH van Heusden de la Universidad de Leiden son reconocidos por su apoyo a la expresión recombinante de S. cerevisiae Nar1.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Electrodo de referencia (Ag/AgCl) | Radiometer | ||
| Chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| Espectrómetro EPR | Bruker | ||
| N,N,N',N' -tetrametil-p-fenilendiamina (TMPD) y middot; (HCl)2 | 637-01-4 | ||
| 2,6-diclorofenol indofenol (DCIP), sal | sódica 620-45-1 | ||
| Etosulfato de fenazina (PES) | 10510-77-7 | ||
| metileno | 122965-43-9 | ||
| Resorufina, sal | 34994-50-8 | ||
| Indigodisulfonato (índigo carmín) | 860-22-0 | ||
| 2-hidroxi-1,4-naftaquinona | 83-72-7 | ||
| Antraquinona-2-sulfonato Na+ H2O | 153277-35-1 | ||
| Fenosafrina | 81-93-6 | ||
| Safranina O | 477-73-6 | ||
| Rojo | 553-24-2 | ||
| Bencilo viológeno | 1102-19-8 | ||
| viológeno de metilo | 1910-42-5 |
Referencias
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