La extracción del veneno y veneno glándula microdisecciones de arañas de Proteómica y análisis Transcriptomic

Venenos son secreciones animales predominantemente inyectados en otro animal a los efectos de la depredación o la defensa, y también tienen importantes aplicaciones biológicas con relevancia biomédica ^1-3. Sólo ciertos animales sintetizan veneno, pero su producción es taxonómicamente generalizada en invertebrados (por ejemplo, los cnidarios, caracoles cono, escorpiones y arañas) y vertebrados (por ejemplo, serpientes, algunos peces y mamíferos), debido a que ha evolucionado independientemente varias veces ^1,4 . La caracterización bioquímica de los venenos muestran típicamente se componen de una amplia variedad de proteínas y péptidos, que actúan en gran medida de los sistemas circulatorio y nervioso de los animales inyectados para entregar rápidamente toxinas constituyentes ^1. Una pequeña fracción de los animales venenosos puede representar una amenaza para los seres humanos, en particular las especies con distribuciones sinantrópicas ^5. El estudio de la composición del veneno y las actividades funcionales ha jugado un papel importante enla caracterización funcional de los componentes celulares de vertebrados (en particular los canales iónicos neuronales) ⁶ y en la elucidación de los procesos celulares fundamentales (por ejemplo neurosecreción ^7). Por otra parte, seleccione péptidos del veneno tienen propiedades útiles en contextos biomédicos, incluyendo sus usos como tratamientos para el cáncer y el dolor ^8,9, y se extraen para los plomos de drogas candidatos y el desarrollo de antiveneno. Venenos también jugar un papel destacado en la investigación ecológica y evolutiva ^1,4,10,11, por tanto, la colección de estas secreciones peligrosos tiene muchas utilidades.

Hay> 40.000 especies descritas de araña (orden Araneae), y todos menos uno de los más de 100 familias de arañas poseen pares de glándulas de veneno que terminan en ¹² colmillos. La alta diversidad de especies de arañas sugiere que representan el mayor clado de organismos venenosos. Sin embargo, la caracterización bioquímica de venenos de araña tiene largely concentrado en un pequeño número de especies más frecuentemente asociados con envenenamiento humano. Recientes estudios de proteómica y transcriptómica de venenos de araña indican por lo general contienen muchas proteínas y péptidos ^2,13,14 únicas. Los avances en alto rendimiento de secuenciación de ADNc y la espectrometría de masas de huellas dactilares péptido ha facilitado en gran medida el descubrimiento de estas proteínas de veneno de ^15. Sin embargo, este trabajo comienza con la recolección de veneno suficiente y / o glándulas de veneno de las arañas, y la documentación detallada de estas técnicas son pocos ^16.

En este trabajo se presenta un protocolo para la recolección de veneno y veneno de las glándulas de arañas viuda negra, que se puede aplicar a las arañas de tamaño similar. La colección de veneno por separado de las glándulas permite la identificación de proteínas que se secretan en el veneno en oposición a las proteínas que realizan otras funciones celulares. Las viudas negras y otra Latrodectus especies son ampliamente reconocidos entre las arañas más peligrosas debido a su veneno altamente neurotóxico, lo que provoca dolor severo en los seres humanos, que a veces se acompaña de sudoración profusa, contracciones musculares, hipertensión, dificultad para respirar y parálisis desigual ^5. El protocolo de recogida de veneno que aquí se presenta utiliza electro-estimulación para suministrar corriente eléctrica a las arañas anestesiados para provocar contracciones musculares y la liberación de veneno. Gotitas de veneno se recogen rápidamente con micro-capilares y se dispensan en tubos para almacenamiento en el congelador. Debido a que el protocolo implica procedimientos peligrosos, sólo debe ser realizado por individuos bien entrenados y se instó a la precaución en pasos clave. El veneno de recogida tiene numerosos usos, como la caracterización y aislamiento de moléculas constituyentes ^2, para experimentos o ensayos fisiológicos funcionales ^18, y para estimular el veneno de la expresión del gen ^11. El protocolo concluye con una description de la disección glándula de veneno y la preservación útil para la clonación de genes-veneno específica, la expresión de los que se ha demostrado que se producen 2-3 días siguientes agotamiento de veneno de arañas en diferentes ^10,11.

1. Preparación del aparato electro-estimulador

1. Conecte el cable de alimentación electro-estimulador a la salida y adjuntar pedal externo para la entrada de señal externa.
   Nota: Los cables eléctricos deben estar aislados correctamente y metal expuesto actual entrega no se deben tocar. Use guantes de látex o nitrilo para la protección. Interruptor de energía electro-estimulador debe estar en la posición OFF al conectar el cable de alimentación y fijar los cables.
2. Conecte el electrodo positivo al terminal de salida de rojo en electro-estimulador (cuando el interruptor de polaridad está en modo normal) y conectar el electrodo negativo al terminal de salida negro. Nota: Cada alambre electrodo debe terminar en una pinza.
3. Establecer estimulador para los siguientes ajustes iniciales recomendados: Tensión = 7 V, Frecuencia = 1 pulsos por segundo, retardo = 0 milisegundos, duración = 200 milisegundos, pulsos individuales cambian = regular, y el interruptor de modo = apagado.
4. Prueba de salida de electrodos adjuntando pinzas de cocodrilo a voltmeter cables de prueba positivos y negativos. Encienda el interruptor de alimentación estimulador y suministrar corriente con pedal de pie.

2. Preparación de inmovilizar fórceps y Otros Materiales

1. Sumerja una punta de pinzas de peso pluma en revestimiento de plástico líquido y esperar cuatro horas para dejar secar recubrimiento. Envuelva bien 15 mm de la punta de la púa de oposición con una sola capa de hilo de coser de algodón, y asegurar el hilo de atar el extremo de un nudo.
   Nota: El hilo se utiliza para absorber una solución salina aplicada que promueve la conductividad eléctrica, mientras que el revestimiento de plástico proporciona aislamiento para retardar actual.
2. Cortar la punta de la aguja hipodérmica roma con tijeras afiladas y suavizar la apertura con papel de lija. Coloque la aguja a una trampa de residuos de vacío (por ejemplo, matraz de filtración al vacío) a través de la tubería.
   Nota: La aguja de distancia succionar agua y regurgitar, y servirá para completar el circuito creado por los electrodos del estimulador. El mu abertura de la agujast ser lo suficientemente pequeño para no perjudicar la araña, pero lo suficientemente grande como para solución de vacío sin la obstrucción (por ejemplo, 25 G x 1 ½ en calibre, ver Lista de Materiales).
3. Fórceps Posición de peso pluma horizontalmente en una posición bien cerrado utilizando una pinza de doble vertiente cubierto de vinilo asegurada a una base magnética o un aparato de soporte fijado en el campo de un microscopio de disección de vista, con plástico recubierto puntas de unas pinzas en la parte superior y el hilo recubiertos púa en la parte inferior.
   Nota: La abrazadera de dos puntas se mantiene en una posición estacionaria a la base magnética por un soporte de abrazadera (ver Lista de Materiales). Una banda de goma puede ser fijado firmemente alrededor puntas de las pinzas de peso pluma, al lado del soporte de pinzas, para añadir presión adicional para mantener las pinzas de peso pluma en una posición cerrada alrededor de la araña una vez introducido.
4. Adjuntar pinza electrodo positivo a punta inferior fórceps 'aguas arriba de la rosca y adjuntar pinza negativa a despuntar la aguja de vacío de metal. Circuito de prueba actual con voltímetro colocando el cable positivo en fórceps púa entre hilo y pinza y colocar el cable negativo en la aguja de vacío embotado. Presione el pedal para asegurar que se detecte suficiente corriente y retire los cables si se detecta corriente suficiente.
5. Prepare varios tubos microcapilares para la recolección de veneno. Sostenga un solo tubo microcapilar en un extremo con una mano enguantada y en el otro extremo con una pinza de metal estériles, colocando el extremo fórceps en posición horizontal sobre una llama de mechero Bunsen. Tire del microcapillary con las pinzas de metal lejos de la llama para crear una punta alargada, mientras mantiene el otro extremo en una posición estacionaria.
   Nota: usar gafas de protección como microcapilares pueden fracturarse fácilmente.
6. Descanse microcapilares preparados en una tira de masilla de montaje en una placa de Petri. Examinar microcapillary termina bajo un microscopio de disección y crear un pequeño, la apertura biselada en el extremo desmenuzado con pinzas de metal esterilizados.
7. Label número variable de tubos estériles de 0,5 ml. Añadir agua desionizada estéril a tubos estériles (por ejemplo, 5 l de agua desionizada en autoclave). Cerrar los tubos y colocar tubos en el hielo.
8. Preparar la solución salina en un vaso de precipitados y llenar un segundo vaso de precipitados con agua tratada en autoclave.

3. Inmovilización de la araña en el fórceps

1. A su vez en CO ₂ tanque y transferir araña de plástico recoger vial cerrado (ver Lista de Materiales) en CO ₂ cámara utilizando pinzas metálicas largas.
   Nota: las arañas viuda negra tienen veneno peligroso; Siempre use guantes durante este protocolo.
2. Mantenga araña en la cámara durante 5-10 minutos o hasta que anestesiado y ya no se mueve cuando pinchó suavemente con unas pinzas largas. Use la pipeta de transferencia para mojar hilo en pinzas con solución salina.
   Nota: Para obtener instrucciones sobre el CO ₂ parámetros de anestesia para las viudas negras, consulte Spagna y Moore ^19.
3. Recuperar araña anestesiado de CO ₂cámara por recogerlo por sus patas anteriores utilizando pinzas de disección roma y las manos enguantadas. Mueva araña anestesiado a peso pluma aparato fórceps. Puntas separadas de fórceps de peso pluma cerrados y lugar cefalotórax de la araña en entre los dientes y permitir que los dientes se cierren cerrada para garantizar la araña se mantiene firmemente en su lugar, pero no está siendo aplastado. Asegúrese de que la araña se coloca lado dorso del caparazón hacia abajo (ver Foelix ²⁰ de guía a la anatomía de la araña), que descansa sobre hilo recubierto de púa, y parte ventral del caparazón de cara al revestimiento de plástico, mientras que el electrodo positivo permanece unido a la punta inferior. Trabaje con rapidez al manipular araña.
4. Ajuste la disección de magnificación del microscopio, el enfoque, y la fuente de luz hasta quelíceros de la araña y colmillos son claramente visibles.

4. Veneno Colección

1. Encienda el vacío y spray quelíceros araña con una solución de agua con una segunda punta roma de la jeringa nEedle. Succionar el agua con la aguja de vacío para eliminar las impurezas.
2. Toque la aguja de vacío con electrodo negativo unido a tribuna araña y entregar impulsos con pedal de pie una o más veces. Vacío regurgitar de inmediato si es necesario.
   Nota: tribuna araña se encuentra dentro de la boca posterior a queliceras en la superficie dorsal entre quelíceros y enditos (ver Foelix ²⁰ para la anatomía detallada de araña). Nota: Con cada impulso, el contrato de las piernas de la araña, y el veneno será visible en forma de gotas claras que salen de los colmillos.
3. Recoger las gotitas de veneno con punta microcapilar y punta capilar de transferencia en el tubo de 0.5 ml con agua o solución tampón (solución será absorbido por capilaridad).
   Nota: evitar perforar araña con capilar que puede conducir a la contaminación de la hemolinfa y la muerte. También evitar la contaminación de los capilares con seda y cola de hileras.
4. Adjuntar transferencia jeringa con adaptador de tubo para microcapilar (en el extremo opuesto a la punta de la colección) y dsolución de veneno ispense de nuevo en el tubo. Ponga el tubo en hielo.
   Nota: Deshágase de los capilares de residuos en un contenedor de objetos punzantes cerca.
5. Coloque plástico recoger abierto el vial, junto con su tapa, cerca de la araña. Sujete cuidadosamente las patas de araña con pinzas de disección roma a cabo en una mano y pluma cuidadosamente abierta fórceps dientes con la otra mano, araña cayendo en la recogida de vial con unas pinzas romas y rápidamente cierre la tapa. Continuar con los tubos que contienen veneno de araña-siguiente y almacenar en -80 ° C congelador cuando haya terminado.
   Nota: seguir ejerciendo cuidado al mover la araña de las pinzas de nuevo en el vial. Asegúrese de que el vial colector y la tapa es cercana a la araña para su rápida transferencia y usan guantes.

5. Veneno Glándula disecciones

1. De dos a tres días después de la recolección de veneno, anestesiar araña en CO ₂ cámara (consulte el paso 3.1). Rellene portador de nitrógeno líquido y el lugar junto al microscopio de disección.
   Nota: WHen trabajar con nitrógeno líquido, protección ocular y guantes de uso criogénicos.
2. Área de disección limpia y pinzas de disección con una solución que elimina RNasa y ADN contaminación. Llene una pequeña placa de Petri puesto bajo microscopio de disección con la disección de tampón (por ejemplo, citrato salino-sódico 1x (SSC) de amortiguación).
3. Araña de transferencia de CO ₂ cámara de placa de Petri y el uso de fórceps para separar rápidamente el cefalotórax del abdomen.
4. Mantenga el cefalotórax bajo el microscopio de disección con una pinza y la posición de los quelíceros en el campo de vista. Utilice los afilados extremos de un segundo par de pinzas para cortar la cutícula de unirse a la caparazón de las caras laterales de los quelíceros. Lateralmente captar los quelíceros utilizando el segundo par de pinzas, y tirar suavemente hacia atrás y hacia delante hasta que las glándulas de veneno se sacan.
5. Glándulas separadas de los quelíceros (o salir unidos a queliceras si se desea) y la transferencia a un tubo de 0,5 ml cyrosafe. Coloque closed tubo en nitrógeno líquido.
   Nota: cada disección no debe tardar más de 15 min.
6. Repita la disección con arañas adicionales hasta que termine. Tubos de transferencia de nitrógeno líquido en -80 ° C congelador.

La colección de veneno y de las glándulas de veneno de las disecciones se realizan con frecuencia para caracterizar proteínas y péptidos del veneno en el plano secuencia 10,11,15. Veneno recogido puede usarse también en ensayos fisiológicos para determinar sus actividades funcionales 18. La colección de veneno estimulará la expresión del gen de la glándula de veneno, lo que facilita la clonación de las transcripciones de toxina específicos a través de RT-PCR 10,11. Identificación de proteínas del veneno se puede realizar también de una manera de alto rendimiento mediante la integración de técnicas de espectrometría de masas estándar con bases de datos de secuencia generados a partir de bibliotecas de ADNc de glándula de veneno 15,21. Un ejemplo de este tipo de trabajo, a partir de veneno y las glándulas recogidas utilizando el protocolo detallado anteriormente, lo que demuestra su eficacia, se ilustra en la Figura 1.

Veneno de recogida de L. hesperus hembras adultas se digirió con tripsina y se sometieron a una solución enAnálisis MudPIT, que vincula la HPLC (cromatografía líquida de alta resolución) a la espectrometría de masas en tándem (MS / MS). Aquí el análisis MudPIT se llevó a cabo por la Universidad de Arizona Proteómica Consorcio. Las masas de péptidos detectadas y sus fragmentos disociados (iones hija, inferidos a partir de los espectros) se compararon con secuencias de péptidos predichos teóricamente a partir de las traducciones de las secuencias de ADNc obtenidas a partir de una biblioteca de expresión de gen construido a partir de L. hesperus glándulas de veneno (glándulas fueron adquiridos por el protocolo de disección se ha descrito anteriormente) 21. En este experimento, 36 proteínas se detectaron a partir de todos los espectros recogidos, en el umbral de probabilidad 99,9%, y contenían por lo menos un péptido detectados. Una de las proteínas detectadas se apoya en 43 espectros total (espectros ejemplar se muestra en la Figura 1A), correspondiente a tres péptidos exclusivos, que cubre 35% de la secuencia de la proteína (Figura 1B). La proteína detectada (traducido a partir de un collecte d ADNc) tiene un éxito superior a BLASTp latrodectin de L. tredecimguttatus (GenBank adhesión P49125.1), con un e-score de 2e-46, y comparte el 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la proteína detectada en este experimento. Latrodectin, que también se conoce como la proteína de bajo peso molecular de alfa-latrotoxina, es un componente reconocido de veneno de arañas viuda negro 22, 23, la verificación de la eficacia del protocolo presentado. Algunas proteínas identificadas a partir del veneno corresponden a secuencias para el que se ha encontrado ningún hit BLAST. No está claro si este resultado se debe a los limitados recursos genómicos disponibles para las arañas, así como la información funcional limitada por sus proteínas, o porque la proteína desconocida representa un contaminante veneno. Sin embargo, el gen o los análisis de expresión de la proteína examen de la abundancia de una proteína tal novela en glándulas de veneno relativos a otros tejidos deben revelar si se trata de un componente de veneno genuino.

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Figura 1: péptido Latrodectin identificado del veneno de la viuda de negro utilizando la espectrometría de masa (A) espectros Representante (uno de 43) detectada a través de parte de MS / MS de análisis MudPIT de L.. hesperus veneno que se asignó a la traducción predicha de una secuencia de ADNc recogido se muestra en la parte B. Los espectros muestra relación masa a carga (m / z) de iones secundarios detectados en el eje horizontal producido por la fragmentación de péptido parental (CGEEDFGEEIVK), con letras en la parte superior fue asignado indicando la secuencia del péptido sobre la base de masas de iones hija. (B) de secuencias de proteínas a la que los espectros en la parte A, que muestra en rojo, negrita y subrayado de texto la secuencia correspondiente de los espectros se muestra en la parte A, el texto en rojo adicional (no negrita) representa otro péptido en esta proteína detectada con otra sp recogidaECTRA. La secuencia de la proteína se traduce de una secuencia de ADNc obtenido a partir de glándulas de veneno disecados.

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