Aislamiento de Neonatal extrahepática cholangiocytes

Resumen

Una técnica para aislar cholangiocytes de los conductos biliares extrahepáticos de ratones recién nacidos se describe. Los conductos están meticulosamente disecados, y luego las células se aíslan por consecuencia en geles de colágeno gruesas. Este método proporciona una herramienta útil para el estudio del desarrollo de vías biliares extrahepáticas y patología.

Resumen

Los conductos biliares intra y extrahepáticas del hígado son de desarrollo distinta, y puede ser diversamente afectados por ciertas enfermedades. Sin embargo, las diferencias entre cholangiocytes intra y extrahepáticas, y entre las células neonatales y de adultos, no están bien entendidas.

Los métodos para el aislamiento de cholangiocytes de conductos biliares intrahepáticos están bien establecidos ^1-4. Aislamiento de células ductales extrahepáticos, especialmente desde el recién nacido, todavía no se ha descrito, aunque esto sería de gran beneficio en la comprensión de las diferencias entre las poblaciones cholangiocyte distintos y en el estudio de enfermedades tales como la atresia biliar que aparecen para apuntar a los conductos extrahepáticos. Se describe aquí es una técnica optimizada para aislar las células de las vías biliares extrahepáticas, tanto neonatal y del adulto del ratón. Esta técnica permite obtener una población de células puro con un mínimo de contaminación de las células mesenquimales como los fibroblastos.

Esta metod se basa en la eliminación de los conductos y de la vesícula biliar extrahepática, seguida de la disección meticulosa y raspado para remover capas de grasa y fibroblastos. Estructuras están incrustadas en capas gruesas de colágeno y se cultivaron durante aproximadamente 3 semanas para permitir el crecimiento de cholangiocytes en monocapas, que luego pueden ser tripsinizaron y re plateado para uso experimental.

Introducción

El origen y desarrollo de cholangiocytes intra y extrahepáticas son marcadamente diferentes. El hígado se desarrolla a partir de un divertículo del intestino anterior endodermo ventral ^5. La región caudal del divertículo forma el árbol biliar extrahepático, mientras que la región craneal genera el árbol biliar intrahepático ^5. Cholangiocytes conductos intrahepáticos se derivan de células progenitoras alrededor de la placa ductal en las regiones portal peri ^6. Estas células tienen la capacidad de diferenciarse en hepatocitos o colangiocitos ^6. Esto tiene importantes implicaciones clínicas dado que cholangiopathies pueden dirigirse específicamente a una categoría de cholangiocytes. Por ejemplo, atresia biliar afecta inicialmente los conductos extrahepáticos del recién nacido, mientras que el síndrome de Alagille afecta conductos intrahepáticos.

Hay múltiples descripciones de la aislamiento de cholangiocytes intrahepáticos y unidades de conducto biliar de ratones y ratas. Entigadores han aislado células individuales mediante el aislamiento de conductos y la posterior derivación o por digestión del hígado y el anticuerpo desplegable de cholangiocytes que expresan marcadores de superficie celular específicos ^1-4. Unidades funcionales de las vías biliares y polarizados se han aislado por digestión del hígado y la filtración de tamaño ^7. Unidades de conductos biliares son capaces de responder a los estímulos secretora y demostrar la secreción de líquido ^7, mientras cholangiocytes aislados se ha demostrado que el desarrollo de las estructuras ductular in vitro ^1,2. Las limitaciones de estos métodos incluyen la necesidad de conocimientos técnicos especializados y equipos especiales para la perfusión del hígado con las enzimas digestivas. Además, hay un riesgo de contaminación con células mesenquimales ^3.

Un método para aislar extrahepáticos cholangiocytes del conducto biliar, específicamente de los conductos biliares extrahepáticos neonatales, no se ha descrito previamente. En este trabajo se describe una técnica simplificada para aislar un neonatals así como las células de las vías biliares extrahepáticas adultos en los altos niveles de pureza. Esta técnica facilitará el estudio de las diferencias entre cholangiocytes y la investigación sobre los mecanismos de enfermedades como la atresia biliar que implican los conductos intra y extrahepáticas extrahepáticas.

Protocolo

Todo el procedimiento se lleva a cabo a temperatura ambiente a menos que se especifique lo contrario. Todo animal de trabajo debe llevarse a cabo en condiciones humanas bajo un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado de Animales institucional y el uso local (IACUC).

1. Preparación de Equipos y Soluciones

1. Configuración de la mesa de operaciones del ratón en estrecha proximidad a la campana de cultivo de tejido y incubadora (Figura 1A). Nota: El equipo requerido incluye un microscopio de disección, una fuente de luz, 12,5 cm de largo tijeras iris recta, 6 pulgadas pinzas curvas dentadas no con puntas finas y 4 pulgadas pinzas dentadas con puntas curvas (fig. 1B).
2. Coloque los instrumentos esterilizados en un vaso de vidrio de 70% de alcohol en la mesa quirúrgica.
3. Llenar tres 60 mm placas de Petri estériles con medios de aislamiento estéril (Tabla 1); colocar dos en la mesa quirúrgica y una en la capilla, todo en hielo.
4. Coloque colágeno de cola de rata,estéril 10x tampón fosfato salino (PBS), agua estéril, estéril 1 N de NaOH y células epiteliales biliares (BEC) medios de comunicación (Tabla 1) en la campana de cultivo de tejido. Nota: El colágeno debe estar en hielo.

2. Aislamiento y cultivo del conducto biliar

1. La eutanasia a los ratones neonatales entre 0-3 días de vida, por la exposición a dióxido de carbono hasta que inconsciente seguido por dislocación cervical, según las directrices del IACUC (Figura 1C).
   Nota: Los ratones más viejos pueden ser utilizados en función de las necesidades experimentales específicas.
2. Coloque animal en decúbito supino y hacer una pequeña incisión horizontal que cruza la línea media en la región de la pelvis. Extienda esta incisión lateralmente y hacia arriba a ambos lados del abdomen, formando una aleta en forma de U. Gire la solapa hacia arriba para destapar los órganos abdominales. Una vez que el abdomen está abierto, mover cuidadosamente los intestinos de la cavidad abdominal hacia el lado derecho del animal para una mejor visualización del conducto biliar común y del hígado. Nota: puede ser necesario extender las incisiones laterales en la caja torácica para obtener una mejor identificación del hígado.
3. Usando el microscopio de disección, identificar el conducto biliar común, el hígado y los intestinos. Identificar el conducto biliar común primero (Figura 1 D), utilizando cautela, ya que las estructuras son muy delicados. Con las pinzas dentadas de sierra y no gubernamentales, meticulosamente limpia y acaba con el tejido conectivo que incluye la grasa que rodea a la bilis. Utilice uno fórceps para sujetar el conducto y el otro para limpiar.
4. Utilice una técnica similar para limpiar la vesícula biliar.
5. Coloque los conductos limpios y la vesícula hasta el primer plato de medios de aislamiento en el hielo. Masajea suavemente las estructuras con los forceps no dentados, mientras que en los medios de comunicación para eliminar más tejido conectivo y eliminar la bilis desde la vesícula biliar.
6. Traslado conductos y vesícula biliar con el segundo plato de medios de aislamiento.
7. Después del aislamiento de los conductos y vesículas biliares de 5 animales, transferir elpiezas a la tercera placa de Petri, en el capó. Nota: Si las células han de ser aislado a partir de más de 5 animales, se puede hacer en lotes, utilizando soluciones frescas para cada grupo de 5 animales.
8. Preparar geles de colágeno gruesas en la campana de cultivo de tejidos:
   Nota: cualquier plato tamaño puede utilizarse. Una placa de cultivo de 60 mm con un volumen final de 3 ml de colágeno para cada grupo de 5 neonatos funciona bien. Esto debe ser preparado fresco en el momento de la incorporación de conductos recién aisladas.
   1. Coloque colágeno de cola de rata, estéril 10x tampón fosfato salino (PBS 10x), dH ₂ O estéril, y estéril de NaOH 1 N en hielo.
   2. Cálculo de los volúmenes de dH ₂ 0, 10x de PBS, NaOH, y el colágeno necesario para geles con una concentración final de 2 colágeno mg / ml en PBS 1x, utilizando un volumen de 1 N de NaOH igual a 0,023 veces el volumen de colágeno añadido. Nota: Si se utiliza una fuente alternativa de colágeno, siga las instrucciones del fabricante para la neutralización y la formación de gel.
   3. Mezcle dH ₂ 0, 10x PBS, y 1 N de NaOH, a continuación, añadir colágeno y así pipeta para garantizar una mezcla uniforme.
9. Una vez solución de colágeno se ha espesado a un gel de consistencia similar a temperatura ambiente, inmediatamente incrustar los conductos en el colágeno.
10. Coloque en la incubadora a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 30 min para permitir que el colágeno se solidifique.
11. Una vez gel se ha solidificado (color cambia de transparente a blanco), overlay con 3,5 ml de medio BEC (Tabla 1) y se incuba a 37 ° C, 5% de CO _2.
12. Retire el medio de BEC 3 veces por semana y reemplazarla con 3,5 ml de medio fresco.

3. Aislamiento cholangiocytes primarias de grueso colágeno geles

Nota: en el plazo de 3 semanas, hojas de cholangiocytes (células con núcleo grande que se extiende directamente desde conductos integrados) serán visibles en el colágeno de espesor. Si hay un gran número de fibroblastos en el plato, debe desecharse. Si un par de regiones del plato tienende crecimiento de fibroblastos, éstos se puede cortar con un bisturí y se retira antes de la división de los colangiocitos.

1. Preparar geles de colágeno delgadas:
   1. Diluir colágeno a una concentración de 1 mg / ml con PBS estéril. Nota: Utilice 1 ml por placa de 100 mm; ajustar en consecuencia para otros platos de tamaño.
   2. Corre la solución de colágeno de manera uniforme con un esparcidor de células (grandes platos) o puntas de pipeta (pequeños platos), a continuación, dejar a temperatura ambiente durante 10 min.
   3. Cubrir la placa con DMEM/F12 y se incuba a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 10 min.
   4. Retirar la placa de la incubadora y lavar con PBS 1x. Inmediatamente aspirar el PBS 1x.
   5. Escudo con una segunda capa delgada de colágeno, la difusión mediante la rotación de la placa o la colocación de la placa en un agitador. Incubar a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 10 min.
   6. Después de colágeno se ha solidificado, la placa de cubierta con DMEM/F12 e incubar a 37 ° C, 5% de _CO2 durante 30 min.
2. Dividir celdas de thgeles de colágeno ick:
   1. Con espátula de cultivo celular o rascador de células, raspar gel de colágeno suavemente la placa de modo que está flotando.
   2. Preparar la solución de colagenasa diluyendo Tipo XI colagenasa (vea la lista de materiales) a 10 mg / ml con DMEM/F12. Mezclar bien y filtrar de forma estéril.
   3. Añadir 1 ml de solución de colagenasa (arriba) por 60 mm de placa de células en colágeno de espesor. No extraiga el soporte BEC (que debe ser 3 ml). Incubar plato durante 30 min a 37 ° C, 5% de CO _2.
   4. Retire la solución que contiene células, y el lugar en 15 ml tubo cónico.
   5. Centrifugar a 2200 xg durante 5 min. Descartar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en volumen similar de DMEM/F12.
   6. Girar solución de nuevo en 2200 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.
   7. Resuspender el sedimento en 3 ml de 0,5% de tripsina, y se incuba a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 5 min. Después de la incubación, la solución de la pipeta hacia arriba y abajo para romper las hojas de cholangiocytes. Añadir 5 ml de los medios de comunicación un BECsolución giro ª a 1500 × g durante 5 min.
   8. Extraer el sobrenadante, y resuspender el sedimento en DMEM/F12, a continuación, girar solución a 1500 xg durante 5 min.
   9. Eliminar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en medios BEC (Tabla 1). Las células de la placa en geles de colágeno delgadas hechas previamente.

4. Pasaje y almacenamiento de células

Nota: las células en geles de colágeno delgadas se pueden dividir según sea necesario.

1. Lavar las placas con PBS estéril antes de la incubación en tripsina al 0,25% a 37 ° C durante 10-15 min.
2. Neutralizar con un volumen igual de medio de BEC, y sedimentar a 1500 xg durante 5 min. Enjuague de pellets con DMEM/F12, entonces sedimentar a 1500 xg durante 5 min.
3. Resuspender las células en los medios de comunicación de BEC para la distribución de colágeno recubierto placas de cultivo celular.
   Nota: Alternativamente, las células pueden ser resuspendieron en medios de almacenamiento y se almacenan en un congelador de -80 ° C o nitrógeno líquido (Tabla 1).

Resultados

El uso de este protocolo resulta en el aislamiento de una población de ratones cholangiocytes extrahepáticas neonatales con excelente pureza, como lo demuestra la tinción de inmunofluorescencia K19 (Figuras 2A y 2B); logramos resultados similares aislamiento de células a partir de ratones adultos. Hemos observado que se tarda 3 semanas para las células de los conductos biliares recién aisladas para formar monocapas sobre geles de colágeno gruesas. Los cholangiocytes crecen de forma lineal a lo largo del...

Discusión

Aquí se describe es una técnica para aislar cholangiocytes puros a partir de las vías biliares extrahepáticas de los ratones de los ratones de todas las edades, incluidos los recién nacidos. La técnica ofrece la ventaja de que cholangiocytes extrahepáticos se pueden estudiar por separado de cholangiocytes intrahepáticas, y puede facilitar los estudios para identificar las diferencias clave entre estas poblaciones de células. Hemos publicado recientemente un estudio que demuestra disminuyó cilios en cholangiocytes extrah...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM/F12 (1:1)	Gibco/ Life technologies	11320-033	500 ml, utilizado en medios BEC
FBS	Atlanta Biologicals	S11150	25 ml, utilizado en medios BEC
MEM con aminoácidos no esenciales	Gibco/ Life technologies	11140-019	5 ml, utilizado en medios BEC
Insulina-transferrina-selenio	Gibco/ Life technologies	51300-044	5 ml, utilizado en medios BEC
Na Pyruvate	Cellgro	25-000-CL	5 ml, utilizado en medios BEC
Concentrado lipídico químicamente definido	Gibco/ Life technologies	11905-031	5 ml, utilizado en medios BEC
Penicilina-Estreptomicina	Cellgro	30-002-CI	5 ml, utilizado en medios BEC y 500 μ l en el aislamiento
Gentamicina	Gibco/ Life technologies	15750-060	0,2 ml, utilizado en medios BEC y 500 μ l en el aislamiento
Etanolamina	Sigma Aldrich	E9508-100ml	0,13 ml, utilizado en medios BEC
MEM solución vitamínica	Gibco/ Life technologies	11120-052	5 ml, utilizado en medios BEC
Inhibidor de tripsina de soja	Biowhittaker	17-605E	5 ml, utilizado en medios BEC. El disolvente es PBS, mezclar hasta 5 mg/ml concentración
de stock L-glutamina	Cellgro	25-005-CL	5 ml, utilizado en medios BEC
Extracto de hipófisis bovina	Gemini	500-102	1,1 ml, utilizado en medios BEC
Dexametasona	Sigma Aldrich	D4902	0,5 ml, utilizado en medios BEC, stock conc 393 μ g/ml diluido con etanol
3 3',5-triyodo-L-tironina	Sigma Aldrich	T6397	0,5 ml, utilizado en medios BIC, Stock conc 3,4 mg/ml diluido con etanol
Factor de crecimiento epidérmico	Millipore	01-101	0,5 ml, utilizado en medios BEC, 25 μ g/ml diluido con DMEM F12+1%BSA
Forskolin	Sigma Aldrich	F6886 5	ml, utilizado en medios BEC, uso a una concentración de stock de 0,411 mg/ml y diluido con DMSO
Fungizone	Gibco/ Life technologies	15290-018	1 ml, utilizado en medios BEC y 500 μ l en el aislamiento
Colágeno de cola de rata	BD Biosciences	354236	variable en función de la concentración de colágeno
PBS 10x	USB Corporation	75889	uso a 10x, sterlie, utilizado para producir colágeno, la cantidad utilizada depende de la concentración
de colágeno dH2O	N/A	N/A	estéril, la cantidad utilizada depende de la concentración de colágeno
NaOH 10 N	Fischer Scientific	ss255-1	Diluido a 1 N, estéril, utilizado para producir colágeno, la cantidad utilizada depende de la concentración
de colágeno colagenasa tipo XI de Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C7657	diluido en DMEM y filtro estéril antes de usar
tripsina-EDTA (1x) 0.25%	Gibco/ Life technologies	25200-056	3 ml, incubar máx. 10 min
tripsina-EDTA (10x) 0.5%	Gibco/ Life technologies	15400-054	3 ml, incubar máx. 10 min
Microscopio de disección	Nikon	SMZ645	Otros modelos aceptables
Fuente de luz (iluminador de fibra óptica)	Schott-Fostec	Ace EKE LR 92240	Otros modelos aceptables
Tijeras de iris rectas de 12,5 cm	Kent Scientific		Otros modelos aceptables
Pinzas curvas no dentadas de 6" con puntas finas	Ciencias de la Microscopía Electrónica Otros	modelos aceptables
de acero inoxidable dentadas de 4" con puntas finas	Ciencias de la Microscopía Electrónica Otros		modelos aceptables

Pinzas