Cuantificación y Tamaño-perfiles de extracelular vesículas Usando Tunable resistiva Pulso Sensing

Summary

Vesículas extracelulares juegan papeles importantes en procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo la coagulación, respuestas inmunitarias, y el cáncer o como agentes terapéuticos potenciales en la administración de fármacos o la medicina regenerativa. Este protocolo presenta métodos para la cuantificación y caracterización de tamaño de las vesículas extracelulares aisladas y no aisladas en diversos fluidos utilizando sintonizable de detección de pulso resistiva.

Abstract

Vesículas extracelulares (EVs), incluyendo 'microvesículas' y 'exosomas', son muy abundantes en los fluidos corporales. Los últimos años han sido testigo de un enorme aumento en el interés por los vehículos eléctricos. EVs han demostrado que desempeñan papeles importantes en varios procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo la coagulación, respuestas inmunitarias, y el cáncer. Además, los vehículos eléctricos tienen potencial como agentes terapéuticos, por ejemplo, como vehículos de suministro de fármacos o como medicina regenerativa. Debido a su pequeño tamaño (50 a 1000 nm) cuantificación exacta y el tamaño de los perfiles de los vehículos eléctricos es técnicamente difícil.

Este protocolo describe cómo sintonizable tecnología de detección de pulso resistiva (TRP), utilizando el sistema de qNano, se puede utilizar para determinar la concentración y el tamaño de los vehículos eléctricos. El método, que se basa en la detección de los vehículos eléctricos sobre su transferencia a través de un poro de tamaño nano, es relativamente rápido, es suficiente el uso de pequeños volúmenes de muestra y no requiere la purficación y la concentración de los vehículos eléctricos. Junto al protocolo de operación regular un enfoque alternativo se describe utilizando muestras adicionadas con perlas de poliestireno de tamaño conocido y concentración. Este tiempo real técnica de calibración se puede utilizar para superar los obstáculos técnicos encontrados en la medición de los vehículos eléctricos directamente en los fluidos biológicos.

Introduction

Las vesículas de origen celular son muy abundantes en los fluidos corporales ^1. Estos llamados vesículas extracelulares (SVE) (50 - 1000 nm de tamaño) se forman por cualquiera de fusión de cuerpos multivesiculares con la membrana celular, o por gemación directa en el exterior de la membrana celular. En los últimos años, el interés científico en los vehículos eléctricos se ha incrementado en gran medida, lo que resulta en una gran cantidad de publicaciones EV-centrado, en el que las nuevas funciones y características de los vehículos eléctricos se describen ^1. EVs ahora se cree que están involucrados en una amplia gama de procesos fisiológicos y patológicos tales como la transducción de señales, regulación inmune, y la coagulación de la sangre ^1-4. En el cáncer, los vehículos eléctricos parecen jugar un papel en la formación de nichos premetastatic ^5,6, la transferencia de pro-canceroso contenido de ^7,8 y la estimulación de la angiogénesis ^8. Además de esto, los vehículos eléctricos se exploran como agentes de suministro de agentes terapéuticos ^9.

A pesar de estos dedesarrollos, la cuantificación fiable de los vehículos eléctricos sigue siendo un reto. Tradicionalmente, se utilizan métodos de cuantificación indirectos, que se basan en la cuantificación del contenido total de proteína o proteínas específicas. Aunque se usan ampliamente, estas técnicas no tienen en cuenta las diferencias de proteínas-por-EV, y no discriminan entre contaminantes agregados de proteínas y proteínas en los vehículos eléctricos. Además, estas técnicas requieren el aislamiento de los vehículos eléctricos, que en muchos casos hace que la comparación de las concentraciones de EV en muestras biológicas imposible.

Por lo tanto, se realizan esfuerzos para desarrollar nuevos métodos que permitan la medición EV más precisa y directa ^10. Este informe describe el uso de los sensores de pulso resistiva sintonizable (TRP) para la cuantificación fiable y tamaño de perfiles de los vehículos eléctricos.

Actualmente, el qNano instrumento (Figura 1a) es la plataforma sólo está disponible comercialmente para TRPS. En TRPS, una membrana elástica no conductor puntuada wiª un poro de tamaño nanométrico se separa dos células del líquido. Una de las células del líquido se llena con la muestra de interés, mientras que la otra celda se llena con electrolito libre de partículas. Mediante la aplicación de una tensión, un flujo / corriente eléctrica iónica se establece, que se altera en la transferencia de las partículas a través del poro (Figura 1b). La magnitud de este bloqueo actual ('pulso resistiva') es proporcional al volumen de la partícula ¹¹ (Figura 1c). La duración del bloqueo se puede utilizar para evaluar el potencial zeta de las partículas, que se basa en características de las partículas tales como la carga o la forma ^12. Tamaño de perfiles de partículas desconocidas puede llevar a cabo mediante la comparación de los impulsos resistivas causadas por las partículas desconocidas con los pulsos resistivas causadas por las partículas de calibración con un diámetro conocido. Además de la magnitud de un evento de bloqueo, se mide la tasa de los que éstos se producen. Esta tasa de recuento reliES en la concentración de partículas. Dado que la concentración y la tasa de bloqueos son linealmente proporcional ^13, usando una sola muestra de calibración con una concentración conocida de partículas y tamaño de partícula permite la medición de la concentración y distribución de tamaño ^{14 11} de una muestra desconocida.

El movimiento de las partículas a través de la nanopore se determina por electro kinetic- fuerzas electroforéticas (y electro-osmótica) y de fluidos ^15. Al utilizar el módulo de presión variable (VPM) una diferencia de presión entre las cámaras de fluido puede ser inducida como una fuerza adicional. La aplicación de presión positiva aumenta la velocidad de flujo de partículas, que pueden ser de beneficio cuando la concentración de partículas es baja. También, la presión se puede aplicar para reducir el efecto de las fuerzas electro-cinética. Esto es especialmente importante cuando se utiliza nanoporos con un pequeño diámetro de poro relativo (NP100, NP150 y NP200 posiblemente) que se utiliza a menudo como para la detección de los vehículos eléctricos.Para estos nanoporos, incluso cuando se aplica una presión significativa, las fuerzas electro-cinética pueden, dependiendo de la carga superficial de las partículas, siendo no despreciable ^16. Mediante la medición de la tasa de partícula en múltiples presiones, un electro cinéticamente corregido, y por lo tanto más precisa, la concentración EV se puede calcular.

Aquí, protocolos detallados se proporcionan para determinar la distribución del tamaño y la concentración de los vehículos eléctricos. Junto al protocolo de funcionamiento regular, un enfoque alternativo se describe que las muestras están sobrecargadas con perlas de poliestireno de tamaño conocido y concentración ^17. Esta técnica de calibración en tiempo real se puede utilizar para superar algunos de los desafíos técnicos encontrados en la medición de los vehículos eléctricos directamente en fluidos biológicos, tales como orina, plasma y sobrenadante de cultivo celular, o cuando la estabilidad de la nanoporos durante un largo período de tiempo de medición no puede ser asegurado.

Protocol

1. Protocolo de Operación Estándar

1.1 Configuración del instrumento y la preparación de muestras

1. Conecte el instrumento a un ordenador con el software Izon Control Suite instalado.
2. Elija el tamaño nanoporo utilizar: para el tamaño y la concentración medida de los vehículos eléctricos una NP150 (meta rango de tamaño de 85 a 300 nm) o NP200 (meta rango de tamaño de 100 a 400 nm) se utilizan con más frecuencia. Cuando se trabaja con vehículos eléctricos que han sido aislados usando un protocolo que implica la eliminación de los vehículos eléctricos más grandes, por ejemplo haciendo pasar la muestra a través de un filtro de 220 nm, un poro NP100 (objetivo intervalo de tamaño de 70 a 200 nm) se puede utilizar. Cuando se trabaja con los vehículos eléctricos en una muestra biológica o vehículos eléctricos aislados usando un protocolo diferente, el NP200 se puede utilizar, ya que puede quedar atascado con menos frecuencia. Otros nanoporos como el NP300 (rango objetivo tamaño de 150 a 600 nm) o la NP400 (objetivo intervalo de tamaño de 200 a 800 nm), o nanoporos aún más grandes, se pueden utilizar para los tipos más grandes de los vehículos eléctricos.
3. Elija el calibr poliestirenopartículas ación que complementan el nanoporo seleccionado en el paso 1.1.2. Para una NP100, NP150 y NP200 nanoporo utilizan el CPC100, partículas CP100 y CPC200, respectivamente. Para la estimación del tamaño exacto, asegurar que las partículas de calibración tienen un tamaño similar a las partículas desconocidas.
4. Para asegurar la homogeneidad de las partículas de calibración, brevemente vórtice (30 seg). Opcionalmente, aplicar sonicación para eliminar los agregados.
5. Diluir las partículas de calibración en PBS a la concentración objetivo en un volumen de al menos 40 l. Nota: La concentración objetivo varía según el nanoporo seleccionado en el paso 1.1.2. Concentraciones objetivo se suministran con los nanoporos.
6. Pega y despega directamente 78 l de PBS en la celda de fluido inferior; esta humectación de la celda inferior fluido reduce el riesgo de formación de burbujas de aire bajo el nanoporos cuando se aplica un electrolito a la celda de fluido inferior cuando el nanoporo está en posición.
7. Coloque el nanoporo en los 4 brazos del instrumento. Usolos calibres digitales para medir la distancia entre dos brazos opuestos y entran en la distancia en mm en el campo de entrada "Stretch" y haga clic en "calibrar tramo" para calibrar el tramo nanoporo.
8. Estirar el nanoporo a 47 mm, girando la rueda lateral y por lo tanto aumentar la distancia entre los brazos opuestos del instrumento, antes de volver a 78 l de PBS a la celda de fluido inferior.
   Nota: La interferencia eléctrica puede afectar sustancialmente la calidad de las mediciones. Al utilizar un ordenador para ejecutar el software Izon Control Suite, asegúrese de que el ordenador portátil está conectado a la red eléctrica mediante un enchufe con conexión a tierra y un enchufe. Los teléfonos móviles mantienen cerca del instrumento también puede ser una fuente de interferencia eléctrica. Se observa interferencia eléctrica como picos constantemente repetidas en la actual línea de base, a menudo con la raíz cuadrada media (RMS) del ruido> 10 pA.
   Nota: Casi cualquier tampón puede ser usado para diluir las partículas de calibración y EVS para TRPS CARACTERÍSzación. La presencia de sales es un requisito previo para el establecimiento de una corriente eléctrica. Para las mediciones de EV utilizar PBS como tampón. Partículas de calibración siempre debe ser diluido en el mismo tampón que los vehículos eléctricos para garantizar mediciones precisas.

1.2. Determine los ajustes óptimos para la medición

Nota: Antes de grabar, es importante establecer los valores óptimos de medición. La magnitud bloqueo causado por una partícula que pasa a través de la nanopore depende del estiramiento aplicado y el voltaje aplicado. Para mediciones confiables del ruido RMS debe ser <10 pA y la magnitud del bloqueo modo debe ser> 0,1 nA.

1. Coloque la cámara de fluido superior y blindaje jaula en el nanoporo e introducir 40 l de partículas de calibración diluidos en la celda de fluido superior. Utilice el VPM aplicar ≥0.8 presión kPa positivo.
2. Reducir el estiramiento aplicado lentamente hacia 44 mm, mientras que el análisis de los eventos de bloqueo causados ​​por la calibraciónpartículas. Nota: Cuando se reduce el diámetro de poro el movimiento de partículas a través de la nanopore será menos probable y por lo tanto la tasa de partículas disminuirá. Sin embargo, debido al aumento de bloqueo relativo de los poros un evento de bloqueo se producirá más grande resultando en una mejor relación señal-ruido. El aumento de la tensión puede aumentar aún más la magnitud bloqueo, pero también puede aumentar el ruido RMS.
3. Reducir el tramo hasta que se observaron eventos de bloqueo apropiados (Figura 1c) en el panel de "Signal rastro". (Modo de> 0,1 nA) y la tasa de partícula correspondiente es> 100 / min. Nota: La tasa de partícula es menos estricto de corte, sin embargo, como las mediciones de al menos 500 partículas son ideales, las tasas de partícula de <100 / min causarán grabación duraciones de al menos 5 min. Tipos de partículas superiores a 2,000 / min pueden producir mediciones menos precisas (si está presente, se debe realizar dilución de la muestra).

1.3 Medición de la calibraciónLas partículas, lavado de la cámara de fluido de Uper y medición de la muestra

1. En esta sección los vehículos eléctricos a partir del sobrenadante de cultivo de células del glioblastoma multiforme línea celular U87-MG / EGFRvIII se caracterizan. El aislamiento y la preparación de estos vehículos eléctricos se ha descrito anteriormente y se visualizaron ^18.
2. Coloque las partículas de calibración en la celda fluido superior. Aplique presión (por ejemplo 0,8 kPa) con el VPM y registro> 500 partículas.
3. Si se realiza una medición de multi-presión, aumente la presión aplicada (por ejemplo, a 1,0 kPa) y grabar un segundo archivo de calibración. Se requiere un mínimo de 0,2 kPa diferencia: Nota.
4. Retirar la muestra de calibración de la celda de fluido superior. Lave la celda fluido superior 3 veces con 100 l de PBS para eliminar las partículas residuales. Antes de la introducción de la muestra en la celda de fluido superior, utilice paño libre de pelusa para eliminar el PBS residual de la célula de fluido superior.
5. Introducir la muestra a la celda de fluido superior. Asegúrese de que la corriente de línea de base es menos de 3% de la corriente de línea de base observado en la medición de las partículas de calibración. Si no menos de 3%, aplicar la estrategia se describe a continuación para estabilizar la corriente de línea de base. Aplicar las presiones exactas que se aplican a las partículas de calibración y registrar los archivos de ejemplo.
   Nota: La línea de la velocidad de las partículas debe mostrar la detección de partículas constante (Figura 2a). En caso de interrupción súbita de la detección de partículas, una caída repentina de la corriente de línea de base, o un aumento repentino en el ruido RMS, el poro puede estar obstruido; por lo tanto, hacer una pausa en la grabación. Con el fin de restaurar la línea de base, toque o gire la tapa de protección, aplicar el émbolo, o eliminar por completo la nanoporo y lavarlo con agua desionizada y vuelva a colocarla en el instrumento.
   Nota: Alternativamente, aumentar el estiramiento de nanoporos a 47 mm en combinación con la presión máxima de la VPM durante aproximadamente 5 min.

Análisis de datos 1.4

1. Haga clic en el "; Analizar ficha Datos "para entrar en la sección de análisis del software. Procesar la calibración y archivos de ejemplo, haga clic en el "Proceso de Archivos" "sin procesar archivos" y seleccionar.
2. Haga clic en la casilla junto a la muestra en la columna "calibrado" para acoplar los archivos de ejemplo para las grabaciones de calibración. Seleccionar archivos de ejemplo y de calibración correspondientes y haga clic en "Aceptar". Nota: cuando se utiliza la opción de calibración multi-presión seleccionar la pestaña "Calibración Multi-presión" de la izquierda para par de muestras múltiples a múltiples archivos de calibración.
3. Una vez acoplado con éxito, el software Izon Control Suite mostrará diferentes características de la muestra, tales como un tamaño de distribución (Figura 2b), las duraciones de referencia, la mitad del máximo ancho (FWHM) y un análisis de concentración. Opcionalmente: Para cada muestra, los puntos de datos individuales se pueden exportar como un archivo separado por comas.

2.Protocolo LTERNATIVA - El clavar muestras con bolas de calibración

Nota: En general, el procedimiento operativo estándar se puede utilizar cuando se trabaja con los vehículos eléctricos aislados. Cuando se trabaja con los vehículos eléctricos no aislados en muestras biológicas, o preparaciones EV aisladas contaminadas con grandes agregados de proteínas, de utilizar el instrumento puede ser un reto. Estos desafíos consisten principalmente en una alta tasa de bloqueo de nanoporos (caída repentina de la corriente de línea de base), la incapacidad para recuperar corrientes de línea de base dentro del 3% de la medición de calibración o diferencias significativas en las tasas de partícula entre muestras idénticas (Figura 3A). Para las muestras que presentan estas dificultades un protocolo alternativo para cuantificar los vehículos eléctricos se desarrolló ^17. Esta metodología se basa en la introducción de grandes bolas de calibración de poliestireno en la muestra de interés (Figura 3b). Un procedimiento detallado para este protocolo alternativo se discute a continuación.

2.1. MuestraPreparación

Nota: En la preparación de las muestras usando el método alternativo, se desea establecer una relación de-EV-a gota de alrededor de 1. También, es esencial incluir un "cordón de calibración sólo 'de la muestra, para permitir la exacta' gating" de la bolas de calibración y para determinar el número de partículas de fondo (por ejemplo, agregados de proteínas) presente en el tampón.

1. Centrifugar 100 l de sobrenadante de cultivo celular durante 7 min a 300 xg
2. Añadir 20 l del sobrenadante a 20 l de PBS y 10 l de 75 veces diluido 335 nm (perlas de poliestireno de stock 7E10 / ml).

2.2. Medición de la muestra

1. Utilice la estrategia descrita en la sección 1.2 para determinar la configuración óptima de los instrumentos.
2. Mida el «talón de calibración sólo 'muestra primero. Asegúrese de que la detección de fondo de las pequeñas partículas no del grano es tan baja como sea posible (<10% de las perlas).
3. Mide cada individuo sample una vez antes de la grabación se replica con el fin de distribuir fluctuación en condiciones de nanoporos igualmente sobre las diferentes muestras. Medir al menos 3 repeticiones de cada muestra.
4. Vuelva a medir el «talón de calibración sólo 'muestra después de terminar la grabación de todas las muestras.

2.3. Análisis de Datos

Nota: Cuando se utiliza el protocolo alternativo, el uso exclusivo del software Izon Control Suite no es suficiente para el cálculo de la concentración. Se requiere software adicional hoja de cálculo. Tabla 1 indica un ejemplo de cálculo de la concentración de las muestras representadas en la Figura 3.

1. Abra el 'talón de calibración sólo' uno o más archivos de muestra de la muestra y.
2. Determinar que el bloqueo evento tamaño (en nA) puede ser utilizado como un punto de corte para la distinción entre los vehículos eléctricos y perlas de poliestireno. Determinación del valor de bloqueo (nA) correspondiente a la base izquierda de la población perlas de poliestireno ( Figura 3b). Nota: garantizar la igualdad de ajuste de los Bin-tamaños de todas las mediciones (puede ser ajustado en 'ViewSettings' al que se accede haciendo clic en el botón de "pop-up" de abajo "Trace bloqueo individual").
3. Recuperar los valores del recuento total de partículas para cada muestra haciendo clic en la pestaña "Análisis de Partículas Resumen" de la muestra.
4. Filtra los conjuntos de datos utilizando el nivel de corte determinado en el paso 2.3.2. seleccionando la opción "Filtrado de datos" pop-up. Mostrar sólo las partículas más pequeñas que el punto de corte.
5. Recuperar los valores de recuento de la EV para cada muestra desde el "análisis de la partícula Resumen".
6. Reste la cantidad de vehículos eléctricos de las partículas totales para determinar la cantidad de bolas de calibración.
7. Determinar la relación EV a talón dividiendo recuento EV según el recuento de talón de calibración.
8. Determinar la proporción media de fondo promediando los coeficientes determinados para cada uno y# 8220; grano sólo "muestra de calibración. Restar este valor de cada muestra individual.
9. Multiplique el ratio ajustado-EV a talón por la concentración de bolas de calibración para determinar la concentración de vehículos eléctricos para cada muestra.
10. Multiplicar la concentración encontrada en el paso 2.3.9 por el factor de dilución EV introducido por la adición de perlas de calibración para la muestra EV. Nota: En el ejemplo de configuración de la muestra, la dilución total de la muestra en PBS y perlas de calibración es 2,5 veces y por lo tanto la concentración encontrada en el paso 2.3.9 debe multiplicarse por 2,5 para determinar la concentración de la muestra EV prima.
11. Calcular estadísticas tales como los promedios, desviación estándar y el error estándar de la media para cada grupo de repeticiones.
    Nota: en algunos casos se superponen entre los vehículos eléctricos y perlas de poliestireno con púas que se observa. Si se requiere una corrección de la subestimación de la concentración de EV, también deben medirse muestras sin perlas de poliestireno con pinchos. Utilice el mismo cortefuera tal como se determina en el paso 2.3.2 para determinar una relación "bead-a-EV", para calcular la relación de los vehículos eléctricos que caen dentro del rango de las perlas de poliestireno con púas. Esta relación de talón-a-EV debe añadirse a la relación-EV a talón determinado en el paso 2.3.8.

2.4. Opcional: EV distribución por tamaño del Uso del método alternativo.

1. Abra una grabación muestra dos veces en la suite de software de control.
2. Configure las opciones de filtro de una de las muestras a sólo partículas de visualización más grande que el valor de corte determinado anteriormente. Esto mostrará sólo las partículas de calibración.
3. Establezca la muestra filtrada a "archivo de calibración" e introduzca el tamaño medio de las bolas de calibración.
4. Pareja el archivo de ejemplo y el "archivo de calibración", creado en el paso 2.4.3 tal como se describe en 1.4.2. El archivo muestra ahora mostrará una distribución de tamaño de ambos vehículos eléctricos y bolas de calibración basado en las bolas de calibración de pinchos.
   Nota: La ópera estándarprotocolo ting será más a menudo suficiente para la determinación del tamaño de las distribuciones de los vehículos eléctricos. A veces, sin embargo, los componentes del tampón exactos son desconocidos (por ejemplo en el plasma o en la orina) lo que hace imposible para preparar una muestra de perlas de calibración en el mismo tampón como los vehículos eléctricos de interés. Una muestra de EV de pinchos con partículas de calibración se puede utilizar para el tamaño de sobrestimación EV en estas condiciones específicas.

Results

Para utilizar el instrumento TRPS, un nanoporo no conductor que tiene que situarse en los 4 brazos de la máquina (Figura 1a) y una tensión (Figura 1b) tiene que aplicarse. Una vez que se establece una corriente eléctrica de línea de base, los pulsos de resistencia causadas por las partículas que pasan a través del poro se detectarán como se ilustra en la Figura 1c.

EVs se purificaron a partir del sobrenadante de cultivo de células de la línea celular de glioblastoma U87-MG / EGFRvIII por ultracentrifugación. Se observa una tasa de partícula-parcela estable cuando la medición de los vehículos eléctricos aislados (Figura 2A) en una nanoporo NP100. Se requiere esta partícula estable tasa de parcelas para una medición de la concentración EV fiable. Después de emparejar la grabación EV-muestra una grabación de perlas 115 nm de calibración de poliestireno, una distribución de tamaño (Figura 2b) y estimación de la concentración de la EV-muestra se puede obtener (datos no mostrados).

(Figrue 3a). Esto resulta en estimaciones de concentraciones EV inexactos. Por clavar la muestra con perlas de poliestireno de concentración y tamaño conocido, una relación de-EV a talón se puede determinar. Figura 3b ilustra los resultados obtenidos después del enriquecimiento sobrenadante de cultivo celular con perlas de poliestireno de 335 nm de tamaño. Se observan dos poblaciones claras. Las partículas inducen un bloqueo de menos de 0,46 nA son vehículos eléctricos determinados, las partículas más grandes se determinan perlas de poliestireno. La relación de los vehículos eléctricos a perlas de poliestireno se utiliza para calcular la concentración en bruto de los vehículos eléctricos (Tabla 1). Figura 3C ilustra la estimación del tamaño de las dos poblaciones basadas en las perlas de poliestireno con púas. El re configuración nanoporo utilizadoconsultado en la detección de los vehículos eléctricos> 140 nm de tamaño. Esto se puede disminuir reduciendo la apertura de nanoporos, sin embargo, esto también resultará en eventos más obstrucción.

Figura 1: instrumento qNano y modo de operación. (A) Fotografía del instrumento. Un nanoporos se coloca en el instrumento, la separación de una cámara de fluido inferior de una cámara de fluido superior. Las células del líquido están protegidos de interferencias eléctricas del medio ambiente por la tapa de protección. (B) Ilustración delineando detección de pulso resistiva sintonizable (TRP). Un nanoporo elástico no conductor está separando dos células de líquido. Mediante la aplicación de una tensión de una corriente eléctrica se establece a través del poro perforado en el nanoporo. Como vesículas extracelulares se mueven a través de la nanoporos, el flujo iónico se altera y detectado como un pulso resistiva. En TRPS el tamaño de apertura de la nanoporos puede ser sintonizado (reducción o aumento) estirando el nanoporo mediante el aumento de la distancia entre los brazos opuestos del instrumento, o la reducción de esta distancia. (C) Ejemplo ilustrativo de pulsos resistivas. La magnitud de un solo pulso de resistencia es proporcional al volumen de la partícula:. Pulsos más grandes indican las partículas más grandes Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Partículas contar-parcela y tamaño-distribución obtenida a partir de la medición de los vehículos eléctricos aislados de U87-MG / EGFRvIII sobrenadante del cultivo celular (A) Partículas contar-parcela indicando la detección de partículas global constante.. Breve reducción de la particSe observó la detección le entre 80 y 100 segundos de la grabación. Después de la pausa de la grabación y tocar la tapa de protección, la tasa de partículas se estabilizó después de lo cual se reanudó la grabación. (B) La distribución del tamaño de los vehículos eléctricos aislados se traza después de la calibración de la muestra desconocida (EVs) a 115 nm bolas de calibración de poliestireno. (5 nm de tamaño bin). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: TRPS cuantificación de los vehículos eléctricos en el sobrenadante del cultivo de células utilizando el protocolo alternativo. (A) típicas parcelas de tipos de partículas obtenidas en la medición de los vehículos eléctricos directamente en un fluido biológico. La obstrucción de los poros provoca breves interrupciones y las fluctuaciones en la tasa de detección de partículas. Cadaparcela representa una medición de la replicación de la misma muestra. gráficos (B) Tres replicar tamaño de distribución obtenidos después del enriquecimiento sobrenadante de cultivo celular con 335 nm perlas de calibración de poliestireno. Todas las partículas que inducen un pulso resistiva de menos de 0,46 nA se seleccionan como vehículos eléctricos. (C) Las perlas de poliestireno de púas se pueden utilizar para obtener un tamaño de distribución de la muestra. (5 nm de tamaño bin). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Medición	Calibración sólo # 1	Calibración sólo # 2	El sobrenadante # 1	El sobrenadante # 2	El sobrenadante # 3
Corriente media (nA)	117	120	116	118	120
Tasa de Partículas	172	194	250	246	196
corte utilizado (nA)	0.46	0.46	0.46	0.46	0.46
Partículas totales	303	317	489	488	454
Vesículas extracelulares	3	1	213	215	213
Bolas de calibración con pinchos	300	316	276	273	241
EVS / bolas de calibración	0.01	0.003	0.772	0.788	0.884
Muestra - Fondo			0.765	0.781	0.877
Vesículas EXTRACCIÓN (10 7) / Ml			7.14	7.29	8.18
2.5x muestra diluida
EVs concentración Raw (10 7) / ml			17.85	18.22	20.46

Tabla 1:. Ejemplo de cálculo de la concentración de EV usando el protocolo alternativo Un valor de corte es determinado para distinguir los vehículos eléctricos a partir de perlas de calibración. Posteriormente, el número total de los vehículos eléctricos y los granos puede ser recuperada. Para cada medición se calcula el ratio EV a talón. La cantidad de partículas de fondo en el electrolito (por ejemplo, los agregados de proteína) se calcula promediando el ratio EV a talón para las mediciones individuales del 'bolas de calibración sólo' muestra. Para cada muestra la relación de fondo se resta de la relación obtenida. Este adjusted relación se multiplica por la concentración de las perlas de calibración en la muestra (en este ejemplo: 9.33e7 / ml). Para determinar la concentración en bruto de los vehículos eléctricos, la concentración obtenida se multiplica por el factor de dilución EVs total (en este ejemplo: 2,5).

Discussion

Los protocolos descritos en este manuscrito metodologías de oferta para la cuantificación y caracterización de tamaño de los vehículos eléctricos utilizando TRPS. Las principales ventajas de la plataforma TRPS son el pequeño tamaño de la muestra, duración relativa de medición corto y la ausencia de manipulación de la muestra requerida.

Requisito previo para la medición precisa TRPS es mantener condiciones idénticas entre las mediciones de calibración y muestras. Esto incluye el uso de topes idénticos, así como la configuración del instrumento idénticos, como el tamaño de nanoporos, la tensión y la presión aplicada. El VPM original, carece de un mecanismo para el ajuste exacto de la presión aplicada, causando con ello diferencias menores en la presión aplicada entre las muestras. También, la evaporación del fluido de cebado en el VPM puede inducir diferencias de presión de menor importancia cuando se mide en diferentes puntos de tiempo y el VPM tanto, a menudo debe ser re-cebado. Estas limitaciones potencialmente han sido resueltos por la introducción de la VPM2, quetiene una escala basada en clic y se basa presión de aire.

El protocolo alternativo descrito en este manuscrito es especialmente adecuado para la medición de los vehículos eléctricos en muestras biológicas purificadas no ^17. Creemos que los componentes del tampón, tales como azúcares, lípidos, proteínas y otros residuos más grandes, puede en algunos casos influyen en las condiciones de medición demasiado para el protocolo estándar para ser aplicables. La adición de bolas de calibración de la muestra en lugar de comparar dos mediciones separadas introduce 'calibración en tiempo real'. Este método es especialmente adecuado cuando la comparación de muestras (por ejemplo, plasma sanguíneo de diferentes donantes) que tienen diferentes y / o desconocidos contenidos fluídicos fondo. Aunque existen diferencias entre los vehículos eléctricos y las partículas de poliestireno (por ejemplo, la densidad de las partículas y la carga superficial), modelos teóricos, así como los datos experimentales de relieve la capacidad de uso de perlas de poliestireno para la cuantificación y el tamaño de los perfiles de los vehículos eléctricos,bajo la condición previa de que se aplica una presión significativa ^15,19. Para minimizar la influencia de las fuerzas electrocinéticas, se recomienda el uso de la relativamente mayor NP150 / NP200 nanoporos y la presión positiva significativa.

EVs y bolas de calibración se distinguen por el tamaño. En consecuencia, el nanoporo tiene que ser abierto mediante la aplicación de estiramiento, a un diámetro donde se observa la detección de ambos vehículos eléctricos y las partículas más grandes de calibración. Desde la apertura del poro disminuirá la sensibilidad hacia partículas más pequeñas, sólo EVS más grande que un cierto tamaño se registran (a menudo EVs> 120 nm cuando se utiliza un cordón de calibración 335 nm). El límite de detección mínimo para los vehículos eléctricos se puede reducir a aproximadamente 90 nm, con 203 bolas de calibración nm en un nanoporo NP150. Sin embargo, esta configuración puede ser inviable cuando los vehículos eléctricos más grandes inducen obstrucción frecuente de la nanopore. La presencia de estos vehículos eléctricos que obstruyen puede forzar la utilización de una configuración en la que una población de EVs, demasiado pequeño para reaCH El umbral de detección, no será detectado.

La dificultad para operar el sistema aumenta cuando se trata de medir las partículas menores de 100 nm de tamaño. En tales casos, la detección puede mejorarse aumentando la concentración de sal del electrolito. Un aumento de la concentración de iones inducirá aumenta relativamente magnitudes de bloqueo para partículas pequeñas (mayor relación señal a ruido). La viabilidad de esta técnica para la medición de los vehículos eléctricos tiene que ser validado, aunque, como el aumento de las concentraciones de sal pueden influir en el volumen de los vehículos eléctricos.

En conclusión, la plataforma TRPS puede ser utilizado para la cuantificación directa y caracterización tamaño de los vehículos eléctricos. Dado que no se requiere aislamiento o manipulación EV (anticuerpo etiquetado de unión o fluorescente), la plataforma es adecuado para la cuantificación directa EV en fluidos biológicos. Un protocolo alternativo se prevé que puede ser beneficiosa para muestras en las que los componentes del tampón inducen significativa cloggin de porog eventos, por lo que la utilización fiable de el protocolo estándar inviable.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
qNano instrumento	Izon Science Ltd.	N/A
Módulo de presión variable	Izon Science Ltd.	N/A
Nanopore	Izon Science Ltd.	NP100, NP200	La elección del nanoporo varía en función de la partícula objetivo. Hay diferentes nanoporos disponibles para diferentes tamaños de objetivo.
Calibración de Partículas	Izon Science Ltd.	CPC100, CPC200, CPC400	están disponibles en diferentes tamaños.
Baño de sonicación	Múltiple disponible		Baño de sonicación básico es suficiente
(Mini) vórtice	Múltiples disponibles
Tejidos sin elevación	tamponadas
computadoras
	disponibles
Izon Control Suite 2.2	Izon Ciencia Ltda.	N/A
Software de hoja de cálculo	Múltiple disponible	N/A