Descrito aquí es un procedimiento para la obtención de largos tramos de grabación actual de un canal de iones con la técnica de patch-clamp de células-adjunto. Este método permite observar, en tiempo real, el modelo de open-close conformaciones de canales que son la base de la señal biológica. Estos datos informan acerca de las propiedades de los canales en las membranas biológicas inalteradas.
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Artículo de método
Un canal celular conectado a Patch-clamp grabación
En este artículo
Resumen
Resumen
Proteínas de los canales iónicos son dispositivos universales para la comunicación rápida a través de membranas biológicas. La firma temporal del flujo iónico que generan depende de las propiedades intrínsecas a cada proteína del canal, así como el mecanismo por el cual se genera y se controla y representa un área importante de la investigación actual. Información acerca de la dinámica de funcionamiento de proteínas de los canales de iones se puede conseguir mediante la observación de largos tramos de corriente producida por una única molécula. Descrito aquí es un protocolo para la obtención de patch-clamp grabaciones de corriente de la célula-adjunto de un canal para un canal de iones cerrada ligando, el receptor de NMDA, expresado de forma heteróloga en células HEK293 o de forma nativa en las neuronas corticales. También se proporcionan instrucciones sobre cómo adaptar el método a otros canales iónicos de interés al presentar el ejemplo del canal PIEZO1 mecano-sensible. Este método puede proporcionar datos con respecto a las propiedades de conductancia del canal y la secuencia temporal de Opeconformaciones n cerrados que componen el mecanismo de activación del canal, lo que ayuda a comprender sus funciones en la salud y la enfermedad.
Introducción
Comunicación rápida a través de membranas biológicas depende casi exclusivamente de las proteínas de membrana oligómeros formadores de poros, comúnmente conocidos como canales. Estas proteínas son muy diferentes en las señales de activación, los mecanismos de activación periódica y propiedades de conductividad. Proteínas de los canales cuyos poros son selectivos para iones se clasifican como canales iónicos; su activación produce corrientes iónicas a través de la membrana, y sus respuestas se puede grabar con alta resolución en tiempo real utilizando técnicas electrofisiológicas. Las señales de activación abarcan una amplia gama de insumos químicos y físicos, incluye....
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Protocolo
1. Cultivo Celular y Expresión de proteínas
- Mantener las células HEK293 (número de ATCC CRL-1573) entre los pasajes 22 y 40, que incluye pasajes realizados por la ATCC, en cultivo en monocapa en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina a la mezcla de 5% de CO 2 y 37 ° C. Entre los experimentos, las células de paso en matraces T25 a 5-20 diluciones en un volumen final de 10 ml. Nota: El uso de células durante estos pasajes garantiza la salud celular favorable que permita la formación de sellado óptimo y estabilidad parche.
- Para la transfección, la placa de células HEK293 en placas de 35 m....
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Resultados
Recombinante receptores NMDA
Los receptores NMDA se unen y responden a la acción simultánea de dos co-agonistas: glutamato y glicina. Se reúnen como heterotetrámeros de dos subunidades de unión a glicina GluN1 y dos glutamato vinculante subunidades GluN2. GluN2 subunidades están codificadas por cuatro genes (AD) y de éstos las formas más ampliamente transcritas en el cerebro son GluN2A en adultos y GluN2B en animales jóvenes. Debido a la diversidad de los subtipos de recepto.......
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Discusión
En el campo de los canales iónicos, un área importante de la investigación se dedica a la comprensión de la secuencia de acontecimientos que conduce al canal de apertura o mecanismo de compuerta del canal. Para la mayoría de los canales, este proceso es complejo e implica varios pasos cinéticos que no se puede deducir a partir de una señal multicanal macroscópica. Por el contrario, los experimentos pueden ser diseñados, donde la observación de la secuencia de los eventos de apertura / cierre en el registro de un solo ca.......
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Divulgaciones
Los autores de este manuscrito declarar que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por F31NS086765 (KAC), F31NS076235 (MAP), y R01 NS052669 (GKP) y EIA9100012. Los autores agradecen a Eileen Kasperek de experiencia y asistencia en la biología molecular y el cultivo de tejidos; y Jason Myers para compartir los datos obtenidos a partir de principios de neuronas corticales prefrontales.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Productos químicos | Sigma | Varios | |
| vidrio de borosilicato | Sutter | BF-150-86-10 | |
| Microscopio invertido de campo brillante | Olympus | 1x51 | Nikon también tiene microscopios similares |
| Caja fluorescente | X-cite | Serie 120 | |
| Guía de luz líquida | X-cite | OEX-LG15 | |
| Micromanipulador | MP-225 | Sutter Instruments | |
| TDS1001 | Tektronix | ||
| Dispositivos Moleculares | Axon Axopatch 200B | ||
| Mesa | TMC | 63561 | |
| Tarjeta NIDAQ | National Instruments | 776844-01 | |
| Extractor | Narishige | PC-10 | |
| Pulidor | Narishige | Microforge MF-830 | |
| Jaula de Faraday | TMC 8133306 | ||
| Abrazadera de presión de alta velocidad | ALA Scientific Instruments ALA | HSPC | |
| Bomba de presión/vacío | ALA Scientific Instruments ALA | PV-PUMP | para HSPC-1 |
Referencias
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques f....
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Reimpresiones y permisos
