Los patrones de activación de receptores olfativos codifican identidad olor, pero la falta de datos publicados identificar ligandos de olor para los receptores olfativos de mamíferos dificulta el desarrollo de un modelo integral de olor de codificación. Este protocolo describe un método para facilitar la identificación de alto rendimiento de ligandos de receptores olfativos y cuantificación de la activación del receptor.
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Artículo de método
Análisis de alto rendimiento de los mamíferos receptores olfativos: Medición de la activación del receptor a través de actividad luciferasa
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Resumen
Resumen
Odorantes crear patrones únicos y solapados de la activación del receptor olfativo, lo que permite una familia de aproximadamente 1.000 murino y 400 receptores humanos de reconocer miles de sustancias odoríferas. Ligandos odorizantes se han publicado para menos de 6% de los receptores humanos 1-11. Esta falta de datos se debe en parte a las dificultades que expresan funcionalmente estos receptores en sistemas heterólogos. Aquí, se describe un método para la expresión de la mayoría de la familia del receptor olfativo en las células Hana3A, seguido de evaluación de alto rendimiento de la activación del receptor olfativo usando un ensayo de indicador de luciferasa. Este ensayo se puede utilizar para (1) paneles de la pantalla de odorantes contra paneles de receptores olfativos; (2) confirmar la interacción odorante / receptor a través de las curvas de dosis-respuesta; y (3) comparar los niveles de activación del receptor entre variantes del receptor. En nuestros datos de la muestra, 328 receptores olfativos se proyectaron contra 26 odorantes. Pares Odorante / receptor con puntuaciones de las respuestas fueron variadas selecciónTed y probado en respuesta a la dosis. Estos datos indican que una pantalla es un método eficaz para enriquecer para los pares de odorante / receptor que pasarán un experimento de respuesta a la dosis, es decir, los receptores que tienen una respuesta de buena fe a un odorante. Por lo tanto, este ensayo de luciferasa de alto rendimiento es un método eficaz para caracterizar los receptores olfativos-un paso esencial hacia un modelo de olor de codificación en el sistema olfativo de los mamíferos.
Introducción
El sistema olfativo de los mamíferos tiene la capacidad de responder a un gran número de estímulos olorosos, lo que permite la detección y la discriminación de miles de sustancias odoríferas. Los receptores olfativos (OR) son los sensores moleculares expresadas por las neuronas sensoriales olfativas en el epitelio olfatorio 12. Mamíferos reconocimiento de olores se produce a través de la activación diferencial de las RUP por olores, y la familia de genes OR es extensa, con aproximadamente 1.000 murino y 400 receptores humanos 12-16. Análisis funcionales anteriores de RUP en las neuronas olfativas y en células heterólogas han demostrado que disti....
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Protocolo
1. Cultivo de células Hana3A
- Preparar los medios de comunicación de M10 completándolo medio esencial mínimo (MEM) con 10% (v / v) de FBS.
- Mantenimiento Cultura
- Mantener las células en medios de M10. NOTA: Los vectores de expresión para RTP1L, RTP2, REEP1, y G αolf confieren resistencia a la puromicina a las células Hana3A, pero el mantenimiento de las células con este antibiótico no afecta significativamente a los resultados del ensayo.
- El subcultivo en una proporción de 01:08 en 10 cm de platos cada 2-3 días.
- Incubar a 37 ° C con 5% de CO 2.
2. Las célu....
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Resultados
Una pantalla primarios probados 328 RUP contra olores 26 a una concentración de 100 mM. Esta concentración de olor ha sido demostrado para activar eficazmente una gran proporción de las RUP con ligandos conocidos 10. En primer lugar, la actividad de la luciferasa normalizada se calculó dividiendo la lectura de luciferasa de luciérnaga por la lectura de luciferasa de Renilla. A continuación, los valores baselined se calcularon restando las lecturas de luciferasa normalizada para el control si.......
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Discusión
Identidad odorante es codificada por los patrones de activación de receptores olfativos, pero los patrones de activación del receptor, incluyendo el que los receptores se activan y en qué grado, son conocidos por menos del 6% de los receptores olfativos humanos 1-11. Los esfuerzos para caracterizar receptores olfativos han sido limitados por sus métodos o aplicabilidad de mano de obra intensiva para sólo un subconjunto de la familia de receptores olfativos 17,23,24,33,34. El sistema de expresión he.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta labor fue apoyada por R01 DC013339, R03 DC011373, y Ruth L. Kirschstein Servicio Nacional de Investigación Premio T32 DC000014. Una parte del trabajo se ha realizado mediante el Monell quimiosensorial Receptor Signaling Core, que es apoyada, en parte, con fondos del NIH P30 DC011735-NIDCD Core Grant. Los autores agradecen a C. Sezille para ayudar con la recolección de datos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Células Hana3A | Disponibles en el Laboratorio Matsunami a petición | ||
| RTP1S-pCI | Disponibles en el Laboratorio Matsunami a petición | ||
| M3-R-pCI | Disponibles en el Laboratorio Matsunami a petición | ||
| pCRE-luc | Agilent | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231 | RL |
| Medios esenciales mínimos, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (sin Ca2+ y Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | a href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS |
| Tripsina (0.05% Tripsina EDTA) | Life Technologies | 25300 | Tripsina |
| CD293 | Life Technologies | 11913-019 | CD293 |
| >96-pocillos PDL blanco/transparente | BD BioCoat | 356693 | placas |
| Reactivo de transfección de lípidos: Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamina |
| Sustrato de luciferasa de luciérnaga, extinguidor de luciferasa de luciérnaga de luciérnaga/Renilla sustrato de luciferasa: Ensayo de doble glo | Promega | E2980 | dual glo |
| Synergy S2 | BioTek | SLAD | a href="http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy2_multimode_microplate_reader.html">BioTek S2 |
| Software de lectura de microplacas: Gen5 Software de análisis de datos BioTek | Gen5 | Gen5 | |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300 μ l GripTips | Integra | 4433 | GripTips |
| 12.5 μ l GripTips | Integra | 4414 | GripTips |
| 300 μ l GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433 | XYZ tips |
| 12.5 μ l GripTips 384 XYZ | Integra | 6403 | XYZ tips |
| 384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE buffer | Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d2650?lang=en& region=US">DMSO |
| Forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010 | FOR |
Referencias
- Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (199....
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Reimpresiones y permisos
