Un Ex vivo Sistema de Cultura para estudiar el desarrollo de la tiroides

Resumen

Este protocolo describe la disección del anlagen tiroideo embrionario de ratón y el cultivo de explantes en filtros semiporosos o en portaobjetos de plástico para microscopía. Este sistema es ideal para estudiar los eventos morfogenéticos o de diferenciación que ocurren durante el desarrollo de la tiroides de embriones de tipo salvaje o knockout, y es susceptible de experimentos de ganancia y pérdida de función.

Resumen

La tiroides es una glándula endocrina bilobated localizada en la base del cuello, la producción de las hormonas tiroideas T3, T4, y la calcitonina. T3 y T4 son producidos por tirocitos diferenciadas, organizadas en ámbitos cerrados llamados folículos, mientras que la calcitonina es sintetizada por las células C, intercalados entre los folículos y una densa red de capilares sanguíneos. Aunque la arquitectura y las funciones de la tiroides de adultos han sido ampliamente descritos y estudiados, la formación de las unidades "angio-foliculares", la distribución de células C en el parénquima y los comunicaciones paracrina entre las células epiteliales y endoteliales está lejos de ser comprendido.

Este método describe los pasos secuenciales de ratón tiroides embrionario disección esbozos y su cultura en los filtros semiporosas o en diapositivas de plástico de microscopía. Dentro de un período de cuatro días, este sistema de cultivo recapitula fielmente en el desarrollo de la tiroides vivo. De hecho, (i) BILobation del órgano se produce (para explantes E12.5), (ii) tirocitos precursores se organizan en folículos y polarizan, (iii) tirocitos y células C diferencian, y (iv) las células endoteliales presentes en el tejido microdissected proliferan, migran a la lóbulos tiroideos y estrechamente se asocian con las células epiteliales, como lo hacen en vivo.

Los tejidos de la tiroides pueden ser obtenidos de tipo salvaje, nocaut o embriones transgénicos fluorescentes. Por otra parte, los explantes de cultivo se puede manipular mediante la adición de inhibidores, el bloqueo de anticuerpos, factores de crecimiento, o incluso células o medio acondicionado. Ex vivo de desarrollo se puede analizar en tiempo real, o en cualquier momento de la cultura mediante inmunotinción y RT-qPCR.

En conclusión, el cultivo de explantes de tiroides combinado con aguas abajo todo el montaje o en secciones de imagen y la expresión de genes de perfiles proporciona un sistema eficaz para la manipulación y el estudio de morfogénesis y diferenciación de eventos o de la tiroidesrganogenesis.

Introducción

La glándula tiroides es una colección de esferas epiteliales independientes, llamados folículos, rodeado de una densa red de capilares endoteliales. Esta organización permite que la función tiroidea: capilares endoteliales proporcionan tirocitos con yodo, necesarios para T3 y T4 síntesis de la hormona, y distribuir estas últimas a todo el cuerpo. Dispersos en entre los folículos y los capilares, las células C producen la hormona calcitonina hipocalcémico ^1. Aunque la arquitectura y las funciones de la tiroides adultos son bien conocidos, los mecanismos celulares y moleculares implicados en el desarrollo embrionario de la tiroides (la formación del folículo y la diferenciación) están lejos de ser entendido.

Durante la embriogénesis, tirocitos progenitoras se origina como un engrosamiento (el primordio de la línea media) de la pared ventral del endodermo del intestino anterior en el día embrionario (E) 8,5 en el embrión de ratón, mientras que las células C progenitores se originan en E11.5 como salientes en forma de gotitas-( la bo ultimobranquialmuere) de la cuarta bolsas faríngeas ^2-6. El brote de la línea media a continuación, se separa de la endodermo, se expande bilateralmente para fusionar en E13.5 con los cuerpos ultimobranquiales en cada lado de la tráquea. Finalmente, tirocitos se organizan en folículos y células C diferencian.

El conocimiento actual sobre la formación de tiroides proviene principalmente de análisis histológico de los tejidos fijos, pero los eventos morfogenéticos implicados en la formación de la tiroides son altamente dinámico e implican las comunicaciones e interacciones entre los diferentes tipos de células y con la matriz extracelular. Un trabajo reciente mostró que los progenitores tirocito producen altos niveles de VEGF para reclutar células endoteliales a la tiroides en desarrollo, y, a su vez, reclutan células endoteliales promueven la formación del folículo y la diferenciación de las células C ^7.

La mayoría de los estudios ex vivo en la tiroides se han realizado en adultos células derivadas de la tiroides-aislados, crecido ya sea en 2D de cultivo de tejidos de plástico dparroquias o en 3D matrices. El uso de estos tipos de cultivos, las células foliculares bien diferenciados permanecer polarizados y organizados en folículos o adquirir de nuevo una organización 3D ^8-10. Sin embargo, estas células epiteliales puras, explantados de su entorno fisiológico, y se cultivaron en 2D, ignoran las interacciones con la matriz extracelular, citoquinas, factores de crecimiento y con otros tipos de células tales como las células endoteliales o los nervios que normalmente se encuentran in vivo. Un estudio muy agradable describió recientemente un protocolo de diferenciación de células madre embrionarias en los folículos tiroideos utilizando una etapa de cultivo final en 3D Matrigel ^11. Sin embargo, estos cultivos 3D carecen de contacto con otros tipos de células.

Basado en la experiencia anterior en el páncreas y las glándulas salivales de cultivo de órganos ^12-14, un método para la disección de embriones de ratón Anlagen tiroides y el cultivo de los explantes sobre filtros semiporosas o en las diapositivas de plástico de microscopía fue desarrollado.

¿Cuándotrabajar con embriones E12.5, el doble origen de los esbozos de la tiroides (el esbozo de la línea media y los dos cuerpos laterales ultimobranquiales) impuso la microdisección de un gran fragmento de tejido. Este contenía la tráquea, pero no el esófago, y se extendió desde el arco faríngeo arterias hasta que la hinchazón aritenoides. Cuando se cultivan en filtros, el primordio de la línea media se extiende lateralmente a cada lado de la tráquea, donde se fusionan con los cuerpos ultimobranquiales para formar los dos lóbulos tiroideos, todavía conectadas por un estrecho istmo.

En cultivo, las células epiteliales proliferan, se organizan en folículos y se diferencian en tirocitos y células C, dependiendo de su origen. Las células endoteliales contenidas en el tejido microdissected también proliferan e invaden los lóbulos tiroideos para finalmente asociar estrechamente con la estructura folicular epitelial, independientemente del flujo de sangre o factores circulantes. Dado que el desarrollo de los explantes recapitula fielmente en vivo desarrollarción, este sistema de cultivo es óptima para estudiar morfogenética y eventos de diferenciación que ocurren durante el desarrollo de la tiroides.

Los tejidos de la tiroides pueden ser obtenidos de tipo salvaje, nocaut o embriones transgénicos fluorescentes, y el sistema de cultivo es susceptible a la pérdida-y los experimentos de ganancia de función. Por último, time-lapse de explantes de tiroides marcados con fluorescencia en placas de plástico de microscopía podría ser explotada para investigar mejor la cinética y la continuidad de los movimientos morfogenéticos que se producen in vivo. Time-lapse ya se ha utilizado para estudiar la morfogénesis de ramificación del páncreas ^15,16 o la yema ureteral ^17.

Protocolo

Los ratones fueron criados y tratados de acuerdo con los principios de cuidado de los animales de laboratorio del Comité de Bienestar Animal de la Universidad. Todos los procedimientos y protocolos fueron aprobados por este Comité.

1. Revestimiento de la microscopía de plástico cámaras de cultivo

NOTA: Realice todos los pasos siguientes en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. Los dos tipos de recubrimiento son funcionalmente equivalentes.

1. Cámaras de cultivo de plástico Escudo con fibronectina un día antes del aislamiento de los tejidos de la tiroides:
   1. Diluir fibronectina estéril a una concentración final 50 mg / ml en medio M199 suplementado con 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 0,25 mg / ml de fungizona y 2 mM de glutamina ^12.
   2. Cubrir los pocillos con 200 l de fibronectina se diluye y se incuba durante la noche en un refrigerador a 4 °.
   3. En el día de la disección, aspirar la fibronectina, enjuagar los pocillos una vez con M199 y añadir un volumen mínimo de 200 l de M199 suplementado con antibióticos, glutamina y 10% de suero de ternera fetal.
   4. Deje las cámaras revestidas en la incubadora hasta que esté listo a la placa de los explantes.
2. Escudo de plástico cámaras de cultivo con colágeno tipo I de 2 horas antes del aislamiento de los tejidos de la tiroides:
   1. Diluir tipo I colágeno estéril a una concentración final 50 mg / ml en HCl 10 mM. NOTA: Mantenga colágeno solución madre en hielo.
   2. Cubrir los pocillos con 200 l de tipo I colágeno diluida y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente (RT).
   3. Aspirar la solución de colágeno de tipo I, enjuagar los pocillos una vez con M199 y añadir un volumen mínimo de 200 l de M199 suplementado con antibióticos, glutamina y 10% de suero de ternera fetal.
   4. Deje las cámaras revestidas en la incubadora hasta que esté listo a la placa de los explantes.

2. Disección de la tiroides Anlagen contienen tejidos (E12.5) o de la tiroides Lóbulos (E13.5-e14.5)

NOTA: Utilice las herramientas de disección limpias y placas Petri / cultura. Los pasos generales y las incisiones se describen a continuación son los mismos para E12.5 y embriones E14.5.

1. Sacrificio oportuna embarazada ratones hembra en la embrionaria deseada (e) días (a partir de E12.5 a E14.5) y extraer el útero utilizando instrumentos de disección.
2. Coloque el útero diseccionado en una placa de 10 cm que contiene HBSS.
3. Mantenga un extremo del útero con fórceps y abrir el útero con unas tijeras pequeñas para liberar progresivamente todos los embriones.
4. Separe los embriones de la placenta con unas tijeras y la transferencia de los embriones con sus membranas extraembryonic en una nueva placa de 10 cm que contiene HBSS.
5. Retire el saco vitelino y el amnios. NOTA: A partir de este punto, el trabajo bajo un microscopio estereoscópico con transiluminación de abajo; aumentando la ampliación con los pasos de disección. Use agujas de tungsteno en capilares de vidrio como herramientas de disección.
6. Uso de las agujas comoun cuchillo y un tenedor, retirar la parte superior de la cabeza, incluyendo la mandíbula superior y los oídos (Figura 1A, corte a lo largo de una).
7. Mantenga el embrión en su parte posterior y quitar primero una pieza extra del tubo neural (Figura 1A, corte a lo largo b), entonces la parte inferior del embrión, justo debajo de los miembros anteriores y por encima del corazón (Figura 1B).
8. Transferir la rebanada embrión que contiene la lengua (para orientar el tejido) y la región del cuello en una nueva placa de 10 cm que contenía HBSS.
9. Quitar el tubo neural y tejidos posterior al esófago / tráquea (Figura 1C, un corte a lo largo).
10. Suavemente la sección de la lámina de tejido a lo largo de ambos lados de la lengua (Figura 1C, cortado a lo largo de B y B ').
11. Localice el esófago y la tráquea, en la prolongación de la lengua, y diseccionar la lengua, dejando el aritenoides hinchazón (Figura 1D, corte a lo largo de una), y el tejido de both lados del esófago / tráquea (Figura 1D, corte a lo largo b y b ').
12. Retire el esófago, la tráquea y el lugar con el lado ventral hacia arriba.
13. Diseccionar los tejidos no deseados tales como el timo (Figura 1E) y todos los tejidos situados lateralmente a las arterias arco faríngeo. Para E13.5 o embriones E14.5, visualizar los lóbulos tiroideos en cada lado de la tráquea (Figura 1F; líneas de puntos rojos) y diseccionar los lóbulos de la tráquea.
14. Transferir el aislado región tráquea E12.5, o los lóbulos tiroideos E13.5-E14.5 en una placa de cultivo de 35 mm que contiene medio M199 pre-calentado suplementado con antibióticos, glutamina y 10% de suero de ternera fetal. Traslado explantes utilizando un filtro de boquilla prehumedecida sobre una micropipeta P-200. Para explantes E12.5, corte el extremo de la punta para ensanchar la abertura. NOTA: De forma rutinaria, y si los embriones tienen el mismo genotipo, realice los pasos 6 y 7 en todos los embriones, laN 9-11, y finalmente 12 y 13.

3. Plating y Cultura de la tiroides explantes

1. Lavar los explantes por transferencia sucesiva en tres pocillos de una placa de 24 pocillos que contenía 1 ml de medio de cultivo pre-calentado (= M199 suplementado con antibióticos, glutamina y 10% de suero de ternera fetal).
2. Plating de lóbulos tiroideos sobre recubiertas de microscopía cámaras de cultivo de plástico:
   1. Aspirar M199 medio de cultivo de las cámaras revestidas.
   2. Con cuidado, la transferencia de los explantes de tiroides en las cámaras de cultivo utilizando una micropipeta y puntas con filtro. Coloque un explante en el centro de cada cámara.
   3. Retire el exceso de medios y coloque la cámara de cultivo en una incubadora de cultivo de tejidos (37 ° C, 5% CO ₂₎ durante 2 horas para permitir que los explantes se adhieren a la matriz.
   4. Añadir suavemente 200 a 300 l de medio de cultivo pre-calentado a cada pocillo.
   5. Incubar durante el cultivo a largo plazo en la incubadora de cultivo de tejidos.
3. Plating of región tráquea o de la tiroides lóbulos en filtros semiporosas:
   1. Llene el número de pocillos de una placa de 24 pocillos requerido con 330 l de medio de cultivo pre-calentado.
   2. Poner el filtro (por ejemplo, 0,4 micras filtro Millipore) en el medio, teniendo cuidado de evitar la captura de burbujas de aire por debajo del filtro de la cultura.
   3. Con cuidado, utilizando una micropipeta y puntas con filtro en la transferencia de los explantes de tiroides con un volumen mínimo de medio sobre el centro de los filtros (máximo 4/filter).
   4. Retire el exceso de medio y en el espacio los explantes con una aguja de tungsteno.
   5. Incubar durante el cultivo a largo plazo en la incubadora de cultivo de tejidos. NOTA: El cambio de medio de cultivo cada dos días bajo la campana de flujo laminar. Cultura de los explantes de hasta 7 días.

4. Todo el montaje Protocolo de tinción de inmunofluorescencia para la tiroides explantes

Desalojar explantes cultivados en filtros (después del paso 2 abajo) el uso de agujas de tungsteno opinzas finas y la transferencia en una placa de 24 pocillos para todos los pasos, excepto el primario (paso 5) y secundaria (etapa 7) incubaciones de anticuerpos (placas de 96 pocillos). Para explantes adherentes cultivadas en cámaras de plástico de microscopía, realice todos los pasos en las cámaras de cultivo.

1. Medio de cultivo Aspirar M199 y fijar el explante con helado paraformaldehído al 4% (PFA) durante 20 min (500 l en el plato de 24 pozos y 300 l en microscopía diapositivas).
2. Lavar 2x 10 min en solución salina tamponada con Tris con Triton (TBST; 50 mM de Tris HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,1% de Triton X-100) a TA.
3. Procesar los explantes inmediatamente o almacenar a -20 ° C. NOTA: Para el almacenamiento a largo plazo a -20 ° C, se deshidratan los explantes en metanol al aumentar gradualmente la concentración de metanol en TBST para alcanzar el 100% de metanol. Cuando esté listo para continuar con la inmunotinción (paso 4), rehidratar los explantes añadiendo gradualmente TBST a metanol.
4. Reemplazar TBST con la solución de bloqueo (10% suero de cabra normal en TBST) E incubar en un agitador mar-sierra durante 30-60 minutos a temperatura ambiente.
5. Diluir el anticuerpo primario en solución de bloqueo (100-200 l por condición). La transferencia de los explantes de "filtrar" a partir de una placa de 24 pocillos de una placa de 96 pocillos. Incubar explantes con los anticuerpos primarios en un rockero mar-sierra durante la noche a 4 ° C.
6. Al día siguiente, desechar la solución de anticuerpo primario, la transferencia de los explantes de "filtro" de nuevo en una placa de 24 pocillos y lavar por lo menos cinco veces con TBST en un rockero mar-sierra durante 45-60 minutos en cada una a TA.
7. Diluir anticuerpo secundario (por ejemplo, cabra anti-X-Alexa Fluor a 1:2.000 dilución) en TBST que contenía 1% de suero normal de cabra y se incuban los explantes con esta dilución durante la noche en un eje de balancín mar-sierra a 4 ° C y en la oscuridad. Para la contratinción nuclear, se compone de 1 g / ml de bis-Benzimida (Hoechst) junto con la solución de anticuerpo secundario.
8. El día siguiente, desechar la solución de anticuerpo secundario y lavar con TBST 5x en una sierra de marel rockero de 45 a 60 minutos cada una a TA. Durante los lavados, mantener los explantes en la oscuridad.
9. Lleve a cabo un lavado adicional en TBST agita suavemente durante la noche a 4 ° C en la oscuridad.
10. Postfix los explantes inmunoteñidas en PFA al 4% a 4 º C durante 10 min.
11. Lavar 2x 10 min con TBST.
12. La transferencia de los explantes o bien gradualmente en metanol 100% para el almacenamiento a largo plazo a -20 ° C, o analizar inmediatamente. Para explantes cultivados en los filtros, y immunostained en una placa de 24 pocillos, de transferencia en una cámara de microscopía (por ejemplo LabTek o ibidi) con TBST o mejor medio de montaje fluorescente antes del análisis con un Multifotónica o microscopio confocal.

5. Extracción de ARN a partir de tiroides

Trabajar en un ambiente libre de RNasa. Por lo tanto, el uso de ácido nucleico y libre de nucleasa puntas de pipeta y limpiar tanto el banco y el equipo de los contaminantes y RNasas. Este protocolo está basado en fenol / cloroformo, lleve a cabo el primer pasos (1-7) bajo una campana química.

1. Homogeneizar un explante de la tiroides o dos lóbulos tiroideos con 300 l de solución de extracción de ARN utilizando un mortero desechable para tubo de 1,5 ml. En entre las muestras, lavar la mano del mortero en 2% de SDS, después con agua, después con etanol.
2. Añadir otros 100 l de solución de extracción de RNA, de vórtice 10 seg y se incuba a TA durante 10 min.
3. Vortex durante 30 segundos y se añaden 20 ng de tRNA para cada muestra.
4. Vortex durante 1 minuto y añadir 80 l de cloroformo.
5. Vortex vigorosamente durante 30 segundos e incubar 15 minutos a temperatura ambiente.
6. Centrifugado durante 15 minutos a 19.000 xg en un (4 ° C) centrífuga refrigerada.
7. Transferir cuidadosamente la fase acuosa superior incolora en un nuevo tubo que contiene 20 g de glucógeno como coprecipitante.
8. Vortex y añadir 200 l de 100% de alcohol isopropanol.
9. Vortex vigorosamente durante 15 a 30 segundos y dejar que el ARN precipitado a -20 º C durante 2-3 horas oa -80 º C durante 1 hora.
10. Haga girar durante 30 minutos a 19.000xg a 4 ° C, y eliminar el sobrenadante.
11. Lavar el pellet con 450 l de etanol al 75% frío y agitar para desalojar el sedimento.
12. Centrifugar durante 10 min a 19.000 xg a 4 ° C, y eliminar el sobrenadante.
13. Secar el pellet en la campana durante 5 min.
14. Resuspender el sedimento con 10 l de agua libre de RNasa e incubar 10 min a TA.
15. La concentración de ARN de ensayo, almacenar a -80 ° C o revertir transcriben para el análisis de la expresión génica.

Resultados

Anlages tiroides (la línea media y la UB, junto con los tejidos circundantes) y lóbulos tiroideos son disecados de embriones de ratón en E12.5 y e13.5/e14.5, respectivamente (Figura 1). Después de un día de cultivo en el filtro, la Anlage línea media es visible (Figura 2A) como un tejido alargado que abarca en la parte superior de la tráquea. Se forma progresivamente dos lóbulos en cada lado de la tráquea. Si lóbulos tiroideos aislados (E13.5 E14.5) o se cultivan, se expanden, se somete...

Discusión

En este trabajo se describe un método para la disección y el cultivo de explantes de la tiroides (E12.5) o lóbulos (E14.5) con el fin de estudiar y comprender mejor los complejos acontecimientos que conducen a la formación de la tiroides. Debido a la doble origen de la Anlagen tiroidea (la Anlage línea media y los dos cuerpos ultimobranquiales laterales), y su pequeño tamaño, un fragmento de tejido E12.5 rostral localizado en las arterias arco faríngeo, y que contiene la tráquea, pero no el esófago se microdissected. Co...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
µ-diapositiva 8 pozo, ibiTreat, cultivo de tejidos tratado,	proxylab	estéril 80826
Colágeno tipo I, cola de rata	Millipore	08-115
Fibronectina de plasma humano	Invitrogen	# 33010-018
M199	Invitrogen	31150-022
HBSS	Invitrogen	14025-100
Alambre de tungsteno	Inserto	LS237450
(12 mm de diámetro)	Millipore	PICM01250
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516
E-cadherin	BD Biosciences	610182	1/1.000
Ezrin	Thermo Scientific	MS-661-P1	1/400
PECAM	BD Biosciences	550274	1/100
Hoechst	Sigma	B2261