Este protocolo describe la disección del anlagen tiroideo embrionario de ratón y el cultivo de explantes en filtros semiporosos o en portaobjetos de plástico para microscopía. Este sistema es ideal para estudiar los eventos morfogenéticos o de diferenciación que ocurren durante el desarrollo de la tiroides de embriones de tipo salvaje o knockout, y es susceptible de experimentos de ganancia y pérdida de función.
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Resumen
Resumen
La tiroides es una glándula endocrina bilobated localizada en la base del cuello, la producción de las hormonas tiroideas T3, T4, y la calcitonina. T3 y T4 son producidos por tirocitos diferenciadas, organizadas en ámbitos cerrados llamados folículos, mientras que la calcitonina es sintetizada por las células C, intercalados entre los folículos y una densa red de capilares sanguíneos. Aunque la arquitectura y las funciones de la tiroides de adultos han sido ampliamente descritos y estudiados, la formación de las unidades "angio-foliculares", la distribución de células C en el parénquima y los comunicaciones paracrina entre las células epiteliales y endoteliales está lejos de ser comprendido.
Este método describe los pasos secuenciales de ratón tiroides embrionario disección esbozos y su cultura en los filtros semiporosas o en diapositivas de plástico de microscopía. Dentro de un período de cuatro días, este sistema de cultivo recapitula fielmente en el desarrollo de la tiroides vivo. De hecho, (i) BILobation del órgano se produce (para explantes E12.5), (ii) tirocitos precursores se organizan en folículos y polarizan, (iii) tirocitos y células C diferencian, y (iv) las células endoteliales presentes en el tejido microdissected proliferan, migran a la lóbulos tiroideos y estrechamente se asocian con las células epiteliales, como lo hacen en vivo.
Los tejidos de la tiroides pueden ser obtenidos de tipo salvaje, nocaut o embriones transgénicos fluorescentes. Por otra parte, los explantes de cultivo se puede manipular mediante la adición de inhibidores, el bloqueo de anticuerpos, factores de crecimiento, o incluso células o medio acondicionado. Ex vivo de desarrollo se puede analizar en tiempo real, o en cualquier momento de la cultura mediante inmunotinción y RT-qPCR.
En conclusión, el cultivo de explantes de tiroides combinado con aguas abajo todo el montaje o en secciones de imagen y la expresión de genes de perfiles proporciona un sistema eficaz para la manipulación y el estudio de morfogénesis y diferenciación de eventos o de la tiroidesrganogenesis.
Introducción
La glándula tiroides es una colección de esferas epiteliales independientes, llamados folículos, rodeado de una densa red de capilares endoteliales. Esta organización permite que la función tiroidea: capilares endoteliales proporcionan tirocitos con yodo, necesarios para T3 y T4 síntesis de la hormona, y distribuir estas últimas a todo el cuerpo. Dispersos en entre los folículos y los capilares, las células C producen la hormona calcitonina hipocalcémico 1. Aunque la arquitectura y las funciones de la tiroides adultos son bien conocidos, los mecanismos celulares y moleculares implicados en el desarrollo embrionario de la tiroides (la formación del folículo....
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Protocolo
Los ratones fueron criados y tratados de acuerdo con los principios de cuidado de los animales de laboratorio del Comité de Bienestar Animal de la Universidad. Todos los procedimientos y protocolos fueron aprobados por este Comité.
1. Revestimiento de la microscopía de plástico cámaras de cultivo
NOTA: Realice todos los pasos siguientes en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. Los dos tipos de recubrimiento son funcionalmente equivalentes.
- Cámaras de cultivo de plástico Escudo con fibronectina un día antes del aislamiento de los tejidos de la tiroides:
- Diluir fibronectina e....
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Resultados
Anlages tiroides (la línea media y la UB, junto con los tejidos circundantes) y lóbulos tiroideos son disecados de embriones de ratón en E12.5 y e13.5/e14.5, respectivamente (Figura 1). Después de un día de cultivo en el filtro, la Anlage línea media es visible (Figura 2A) como un tejido alargado que abarca en la parte superior de la tráquea. Se forma progresivamente dos lóbulos en cada lado de la tráquea. Si lóbulos tiroideos aislados (E13.5 E14.5) o se cultivan, se expanden, se somete.......
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Discusión
En este trabajo se describe un método para la disección y el cultivo de explantes de la tiroides (E12.5) o lóbulos (E14.5) con el fin de estudiar y comprender mejor los complejos acontecimientos que conducen a la formación de la tiroides. Debido a la doble origen de la Anlagen tiroidea (la Anlage línea media y los dos cuerpos ultimobranquiales laterales), y su pequeño tamaño, un fragmento de tejido E12.5 rostral localizado en las arterias arco faríngeo, y que contiene la tráquea, pero no el esófago se microdissected. Co.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El trabajo fue financiado por subvenciones de la Université catholique de Louvain (Action de recherché concertées) y el Fondo para la Investigación Médica Científica (F.R.S.-FNRS, Bélgica). A.-S.D. es becario doctoral de Télévie, A.-C.H. ha sido becario del Fonds pour la formation à la Recherche dans l'Industrie et dans l'Agriculture (Bélgica), M.V. cuenta con el apoyo del Instituto de Duve y C.E.P. es investigador asociado senior de la F.R.S.-FNRS (Bélgica).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| µ-diapositiva 8 pozo, ibiTreat, cultivo de tejidos tratado, | proxylab | estéril 80826 | |
| Colágeno tipo I, cola de rata | Millipore | 08-115 | |
| Fibronectina de plasma humano | Invitrogen | # 33010-018 | |
| M199 | Invitrogen | 31150-022 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025-100 | |
| Alambre de tungsteno | Inserto | LS237450 | |
| (12 mm de diámetro) | Millipore | PICM01250 | |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| E-cadherin | BD Biosciences | 610182 | 1/1.000 |
| Ezrin | Thermo Scientific | MS-661-P1 | 1/400 |
| PECAM | BD Biosciences | 550274 | 1/100 |
| Hoechst | Sigma | B2261 |
Referencias
- Colin, I. M., Denef, J. -F., Lengelé, B., Many, M. -C., Gérard, A. -C. Recent insights into the cell biology of thyroid angiofollicular units. Endocr. Rev. 34 (2), 209-238 (2013).
- Fagman, H., Andersson, L., Nilsson, M.
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Reimpresiones y permisos
