Ensayo de adherencia estática para el Estudio de la integrina activación en linfocitos T

Summary

Ensayo de adhesión estática es una herramienta poderosa que se puede utilizar para modelar las interacciones entre los linfocitos T y otros tipos de células. Interacciones se generan mediante la inyección de células T marcadas en pocillos recubiertos con moléculas de adhesión, mientras que un lector de placas se utiliza para cuantificar el número de células adherentes después de lavados de serie.

Abstract

Se requiere la adhesión de linfocitos T para múltiples funciones de las células T, incluyendo la migración a los sitios de inflamación y formación de sinapsis inmunológica con células presentadoras de antígeno. Células T lograr la adhesión regulada mediante el control de las propiedades adhesivas de las integrinas, una clase de moléculas de adhesión celular que constan de pares de proteínas transmembrana heterodiméricas que interactúan con moléculas diana en las células asociadas o matriz extracelular. El más prominente de la integrina células T es función de los linfocitos antígeno asociado (LFA) -1, compuesto por subunidades αL y β2, cuyo objetivo es la molécula de adhesión intracelular (ICAM) -1. La capacidad de una célula T para controlar la adherencia se deriva de la capacidad de regular los estados de afinidad de las integrinas individuales. Dentro de señalización de salida describe el proceso por el cual las señales dentro de una célula causan los dominios externos de las integrinas para asumir un estado activado. Mucho de nuestro conocimiento de estos complejos fenómenos se basa en mecanicistaLos estudios realizados en simplificación en sistemas de modelos in vitro. El ensayo de adhesión de linfocitos T se describe aquí es una excelente herramienta que permite a las células T para que se adhieran a las moléculas diana, en condiciones estáticas, y luego utiliza un lector de placas de fluorescencia para cuantificar la adhesividad. Este ensayo ha sido útil en la definición de sustancias-estimulador o inhibidor de adhesión que actúan sobre los linfocitos, así como la caracterización de los eventos de señalización implicadas. Aunque se ha descrito aquí para la LFA-1 - ICAM-1 de adhesión mediada; este ensayo puede ser fácilmente adaptado para permitir el estudio de otras interacciones adhesivas (por ejemplo, VLA-4 - fibronectina).

Introduction

Adhesión de los linfocitos T es un proceso fundamental en la respuesta inmune ^1. Se requiere para la interacción de células T con células endoteliales decoración de las paredes de los capilares, para el antígeno de células presentadoras de barrido (APC) dentro de los ganglios linfáticos, y para la formación de sinapsis inmunológica (IS) con las células diana ^2. Estos requisitos son funcionalmente y cinéticamente distintas. El proceso de la extravasación de linfocitos consiste quimioatracción, laminados, la adhesión firme y la transmigración. La transición de la rueda a la adhesión firme requiere que las células T para responder a una señal de receptor acoplado a proteína G rápidamente. Esta respuesta se obtiene una interacción ligando integrina que ralentiza y detiene la célula de rodaje ^3. Un cambio inmediato en la avidez de la integrina medie este proceso. La migración requiere interacciones betweenTcells dinámicas y las células endoteliales con la formación de adherencias en el 'front-end' y la rotura de adherencias en la "parte trasera"con un intervalo de aproximadamente un minuto entre la formación y la ruptura ^4. El IS forma inminutes, pero debe permanecer intacto durante horas ^6.

Curiosamente, una molécula de adhesión, la función de los linfocitos miembro de la familia de integrinas antígeno asociado (LFA) - 1, es esencial para todos estos procesos ^5. LFA-1 media la adhesión a través de interacciones con varios miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas. El ligando más ampliamente estudiado con la mayor afinidad a la LFA-1 es la molécula de adhesión intercelular (ICAM) -1. Linfocitos circulantes no activadas expresan baja afinidad de LFA-1 en la superficie celular, y por lo tanto son incapaces de adherirse a la ICAM-1 recubiertos superficies. LFA-1 afinidad es variable y regulada por varios eventos de señalización tales como la activación de la proteína G de receptores acoplados, la estimulación de citoquinas, y las señales mediadas por receptores de células T (TCR). La forma de alta afinidad resultante de la LFA-1 transmite la activación intracelular al espacio extracelular tediante interacciones con la ICAM-1. Esta vía se denomina dentro-fuera de señalización ^7. Del mismo modo, la señalización a través de LFA-1 desde el espacio extracelular se llama fuera-en la señalización.

La cascadas de señalización intracelular que participan en el interior-y exterior-en la señalización son un foco importante de la investigación actual. La pequeña GTPasa Rap1 ha surgido recientemente como el componente clave de dentro a fuera de señalización que es común tanto a la ligadura de TCR y la señalización de citoquinas ^8. El papel crítico de Rap1 en activación de la integrina se pone de relieve por el descubrimiento de que la sobreexpresión de Rap1 estimula la adhesión dependiente de integrina de las células T, mientras que la adhesión de células T está bloqueada por la expresión de dominante negativo Rap1 ^9. Estos avances en nuestra comprensión de la regulación de la integrina por Rap1 han llevado a cabo utilizando herramientas vitro. Entre ellos se encuentra el ensayo de adhesión estática se describe aquí.

El objetivo general de este método es el estudio de Tadhesividad de células a la ICAM-1 las superficies recubiertas. Más específicamente, se utiliza para medir y cuantificar objetivamente la LFA-1 afinidad hacia sus ligandos contador en células vivas en tiempo real, bajo diferentes condiciones. Esta técnica utiliza pocillos de poliestireno recubiertas con ICAM-1 para imitar las superficies celulares que las células T interaccionan con. Muchos ensayos de adhesión de células T estáticos descritos anteriormente fueron experimentalmente complejo. Estos ensayos a menudo necesarios para las células T que se marcaron radiactivamente, utilizan células corneales bovinas cultivadas para crear una matriz extracelular como el sustrato para la adhesión de las células T, o llamados para no fisiológica estimulación de células T durante una duración prolongada para promover la adhesión de células T ^10. El uso de la medición fluorométrica para cuantificar las células T después de la incubación de adherencia es un método más sensible y precisa de la cuantificación en comparación con la citometría de flujo y microscopía, como se utilizan en muchos otros sistemas de ensayo ^11. Además, solo microscópicas de célulasIC análisis de la localización de la integrina no permite el análisis amplio, la población basada en la misma forma que la medición fluorométrica. Mientras que la activación de LFA-1 anticuerpos específicos de cada estado están disponibles comercialmente, estos anticuerpos ofrecen baja sensibilidad en relación con el método descrito aquí. La principal ventaja sobre las técnicas alternativas es su simplicidad y la capacidad de examinar múltiples condiciones experimentales simultáneamente. Al considerar este método para una aplicación específica, se debe tener en cuenta que las células T deben ser seleccionados negativamente, recién aisladas, y se etiquetan con un marcador fluorescente.

Protocol

1. Revestimiento de la microplaca Wells

Nota: El objetivo de este paso es a las superficies de poliestireno capa con la ICAM-1 para servir como ligandos para células T de LFA-1.

1. Preparar las siguientes soluciones:
   1. Preparar la solución de recubrimiento mediante la resuspensión recombinante de ICAM-1 con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (NaCl 137 mM, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na ₂ HPO _4, 2 mM de KH ₂ PO _4, pH 7,4) enriquecida con calcio (1 mM _CaCl2) y magnesio (2 nM de MgCl _2). Asegúrese de que la concentración final de ICAM-1 es de 10 g / ml, elaborados a partir de una solución madre de 0,7 mg / ml y se mantuvieron en un -80 ° C congelador.
   2. Preparar la solución de la adhesión mediante el enriquecimiento de PBS con 0,5% humana (o bovina) de albúmina de suero (HSA / BSA), 2 mM de MgCl _2, y 1 mM de _CaCl2.
   3. Prepare la solución de lavado añadiendo 2 mM MgCl ₂ y 1 mM CaCl ₂ a PBS. Calentar todas las soluciones a 37° C antes de su uso.
2. Lávese 24 pozos con 50 l de solución de lavado. Esto incluirá pozos sin lavar (células tratadas con PMA) positivos, y (pozos sin revestimiento) de los controles negativos. Para cada condición establecida por lo menos tres pozos (por triplicado).
3. Añadir 50 l de solución de revestimiento a cada pocillo. No agregue a los pocillos de control sin revestir. Incubar durante una hora en el interior 37 ° C incubadora.
4. Aspirar la solución de recubrimiento suavemente, sin permitir que la punta toque el fondo de los pocillos. Lavar una vez con 50 l de solución de lavado.
5. Añadir 50 l de solución de adherencia y se incuba la microplaca durante una hora en el interior 37 ° C incubadora.
6. Aspirar con cuidado y lavar una vez con 50 l de solución de lavado. Utilice la placa en el mismo día, sin embargo es posible que la mantenga a 4 ° C durante la noche, y usarlo al día siguiente.

2. T aislamiento de células de la sangre

1. Añadir humana T cóctel de enriquecimiento de células a 50 l / ml de of sangre entera (por ejemplo, para 3 ml de anticoagulante (heparina, EDTA o citrato) de sangre entera, añadir 150 l de cóctel). Mezclar bien.
2. Incubar 20 min a temperatura ambiente.
3. Para un tubo de centrífuga de 50 ml añadir 3 ml de sangre tratada y un volumen igual de PBS (sin calcio y magnesio) enriquecida con 1% de D-glucosa a temperatura ambiente. Mezclar suavemente con una pipeta Pasteur.
4. Añadir 15 ml de Ficoll-Paque PLUS al tubo de centrífuga.
5. Capa con cuidado los 6 ml diluidos muestra de sangre en el medio de aislamiento de linfocitos.
6. Se centrifuga a 400 × g durante 20 min a 20 ° C con rotura de apagado.
7. Trasvasar la capa superior con una pipeta Pasteur limpia, dejando la capa de linfocitos imperturbable en la interfase. La capa superior de plasma se puede guardar para su uso posterior. Con una pipeta Pasteur limpia transferir la capa de linfocitos a un tubo de centrífuga limpio.
8. Añadir 3 volúmenes (9 ml) de PBS para los linfocitos. Suspender las células suavemente por la Dra.ala ellos dentro y fuera de una pipeta Pasteur.
9. Se centrifuga a 400 × g durante 5 min a 20 ° C.
10. Eliminar el sobrenadante. Los linfocitos ahora deben ser suspendidos en el medio apropiado para la aplicación. Transferir las células a un frasco de cultivo T-75 en 20 ml de RPMI 1640 que contenía 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina.

3. Preparación de las células

Nota: Un requisito previo es que las células se pueden etiquetar con un reactivo fluorescente. En este protocolo utilizar carboxi éster de succinimidilo de fluoresceína (CFSE), proteína fluorescente sin embargo verde (GFP) son células que expresan una alternativa aceptable.

1. Cuente 2,4 x 10 ⁶ células T (1 x 10 ⁵ para cada pocillo) usando un hemocitómetro.
2. Resuspender las células en medios de cultivo que carece de suero (privación de suero). Se incuban las células durante 2 horas en la incubadora a 37 ° C.
3. Centrifugar las células durante 5 min (400 xg). Aspirar los medios de comunicación yresuspender en 1 ml de PBS.
4. Añadir CFSE a 1:1000 dilución (caldo hecho con 5 mM). Cubra la luz y se incuba durante 8 minutos a temperatura ambiente.
5. Se detiene la reacción mediante la adición de 10 ml de 37 ° C PBS y centrifugar a 400 xg durante 5 min.
6. Vuelva a suspender el sedimento celular con 1,2 ml de solución de adherencia precalentado (1 x 10 ⁵ células por 50 l).

4. Estimulación de las células

Nota: Con el fin de iniciar la adhesión, las células deben ser estimulados. En el siguiente experimento, las células son estimuladas a través del TCR usando anticuerpos anti-CD3 de reticulación, sin embargo solubles SDF-1 podría servir como una alternativa. Dependiendo del objetivo de los experimentos, varios reactivos farmacológicos podrían añadirse antes o durante la estimulación para estudiar el impacto de la adhesión celular. Forbol miristato acetato (PMA) es un éster de forbol que es estructuralmente similar a la segunda diacil-glicerol mensajero (DAG) y por lo tanto activa múltiples quinasas en sentido descendente del TCR (principalmente la proteína quinasa C); Aquí se usa como un control positivo.

1. Calentar la microplaca a 37 ° C.
2. Dividir las células en 8 vacíos tubos de 1,5 ml (150 mu l en cada tubo), un tubo para cada condición.
3. Tratar a las células en consecuencia:
   1. Estimular un tubo con PMA a 10 ng / ml para servir como control positivo. Mantenga tres tubos sin tratar, para servir como control para la estimulación ("sin estimulación"), el control de la carga sin lavar ("sin lavado"), y el control de ICAM-1 capa ("sin recubrimiento").
   2. Estimular cuatro tubos con diferentes concentraciones de anticuerpos anti-CD3 (0,1, 1, 5, y 10 mg / ml). Continúe en el siguiente paso sin retrasos.
4. Alícuota de 50 l de mezcla de células estimuladas en cada pozo vacío. El número final de células por pocillo es 1 x 10 ^5.
5. Coloque la microplaca en el 37 ° C incubadora durante 15 min.
   Nota: Algunas líneas de células T requieren estimulación más corto tiempo ción. Durante este tiempo, las células se establecerán a la parte inferior de los pocillos y se adhieren a los ligandos diana.

5. Lavamiento células no adherentes

Nota: El objetivo de este paso es eliminar las células que no eran capaces de formar contactos estrechos con las superficies recubiertas con ligando. Utilizar una pipeta multicanal para este paso con el fin de garantizar que las mismas fuerzas físicas se aplican a todos los pocillos. Es importante mantener los pocillos de control indicados sin lavar para ayudar en el cálculo del porcentaje de células adherentes.

1. Añadir 150 l de solución de adherencia caliente para cada uno pozos. Agitar suavemente la placa durante unos segundos antes de retirar el medio de los pocillos. No toque el fondo de los pozos con las puntas.
2. Repita este paso tres veces. Cambie la dirección de la pipeta al pipetear el buffer de entrada y salida.

6. La determinación del porcentaje de células adherentes

_content "> Nota: En este paso un lector de placas fluorescente se utiliza para medir la intensidad de fluorescencia dentro de cada pocillo La intensidad está en correlación directa con el número de las células adherentes..

1. Encienda el lector de placas. Abra el software de lector de placas haciendo clic en el icono de acceso directo en el escritorio.
   1. En el menú "Tareas", haga clic en "Nuevo" para crear un nuevo protocolo.
   2. En el menú "Actions" elija la opción "Leer". Haga clic en "intensidad fluorescente" y pulsa la pestaña "Ok".
   3. Desde el menú desplegable, seleccione "longitud de onda de excitación 485" y "longitud de onda de emisión 528". Pulse la pestaña "Ok".
   4. En el menú de opciones "óptica", seleccione "Bottom" y pulsa la pestaña "Ok". Volver al menú "Actions" y ajustar la temperatura a 37 ° C y haga clic en "Ok".
   5. Inserte la microplaca en el lector de placas yhaga clic en "Ejecutar". El resultado se puede exportar a hoja de cálculo Excel.
2. Calcular el porcentaje de células adherentes utilizando la siguiente fórmula: Porcentaje de células adherentes = (intensidad de fluorescencia media leer en los pocillos lavados) / (intensidad de fluorescencia media de leer en las células sin lavar) x 100%.

Results

A continuación se muestra un ejemplo de ensayo de adhesión usando células T primarias estimuladas con diversas concentraciones de anticuerpos anti-CD3. Es útil conocer la fluorescencia de las células sin lavar (es decir, la carga total). Células no estimuladas sirven como un control negativo y las células tratadas de PMA son el control positivo para anticuerpos anti-CD3. Las células sembradas en pocillos no recubiertos sirven como un control para la ICAM-1. En un experimento típico, el porcentaje de células tra...

Discussion

Hay varios ensayos para estudiar las señales a la LFA-1 de activación y adhesión de células T ^12. La citometría de flujo se utiliza para medir la LFA-1 estados de afinidad en las células vivas utilizando anticuerpos monoclonales que se unen selectivamente a cualquiera de doblado o extendido de LFA-1. Una de las limitaciones de este método es que no tiene en cuenta la avidez de las integrinas. Migración ensayos son herramientas útiles, pero miden la migración, y no la adhesión miserable en un punto de tiempo e...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lector de placas	BioTek	Synergy H1 Pipeta híbrida
multicanal	Fisher	21-377-829
Microplaca de 96 pocillos con fondo óptico	Corning Costar	3603
Recombinante ICAM-1	R& D Systems	ADP4-050
Anticuerpos anti-CD3	Ancell	144-020
PMA	Sigma-Aldrich	79346
BSA	Sigma-Aldrich	A2058
CFSE	Sondas moleculares	C1157
RPMI	Gibco	11875-093
DPBS que contienen calcio y magnesio	Gibco
Linfocitos periféricos	< > ejemplo ratón o humano
Cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich	M8266
Cloruro de calcio	Sigma-Aldrich	499609
Open Gen 5 Software	BioTek	Versión 2.01
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00
Tubos de centrífuga de 15 y 50 ml	Fisher	352099, 352070
Pipetas Pasteur de plástico desechables	Matraces	13-711-7M
T-75	Fisher	50-754-1366
RosetteSep Kit de enriquecimiento de células T	StemCell Technologies	15061