Ensayo de adherencia estática para el Estudio de la integrina activación en linfocitos T

Resumen

Ensayo de adhesión estática es una herramienta poderosa que se puede utilizar para modelar las interacciones entre los linfocitos T y otros tipos de células. Interacciones se generan mediante la inyección de células T marcadas en pocillos recubiertos con moléculas de adhesión, mientras que un lector de placas se utiliza para cuantificar el número de células adherentes después de lavados de serie.

Resumen

Se requiere la adhesión de linfocitos T para múltiples funciones de las células T, incluyendo la migración a los sitios de inflamación y formación de sinapsis inmunológica con células presentadoras de antígeno. Células T lograr la adhesión regulada mediante el control de las propiedades adhesivas de las integrinas, una clase de moléculas de adhesión celular que constan de pares de proteínas transmembrana heterodiméricas que interactúan con moléculas diana en las células asociadas o matriz extracelular. El más prominente de la integrina células T es función de los linfocitos antígeno asociado (LFA) -1, compuesto por subunidades αL y β2, cuyo objetivo es la molécula de adhesión intracelular (ICAM) -1. La capacidad de una célula T para controlar la adherencia se deriva de la capacidad de regular los estados de afinidad de las integrinas individuales. Dentro de señalización de salida describe el proceso por el cual las señales dentro de una célula causan los dominios externos de las integrinas para asumir un estado activado. Mucho de nuestro conocimiento de estos complejos fenómenos se basa en mecanicistaLos estudios realizados en simplificación en sistemas de modelos in vitro. El ensayo de adhesión de linfocitos T se describe aquí es una excelente herramienta que permite a las células T para que se adhieran a las moléculas diana, en condiciones estáticas, y luego utiliza un lector de placas de fluorescencia para cuantificar la adhesividad. Este ensayo ha sido útil en la definición de sustancias-estimulador o inhibidor de adhesión que actúan sobre los linfocitos, así como la caracterización de los eventos de señalización implicadas. Aunque se ha descrito aquí para la LFA-1 - ICAM-1 de adhesión mediada; este ensayo puede ser fácilmente adaptado para permitir el estudio de otras interacciones adhesivas (por ejemplo, VLA-4 - fibronectina).

Introducción

Adhesión de los linfocitos T es un proceso fundamental en la respuesta inmune ^1. Se requiere para la interacción de células T con células endoteliales decoración de las paredes de los capilares, para el antígeno de células presentadoras de barrido (APC) dentro de los ganglios linfáticos, y para la formación de sinapsis inmunológica (IS) con las células diana ^2. Estos requisitos son funcionalmente y cinéticamente distintas. El proceso de la extravasación de linfocitos consiste quimioatracción, laminados, la adhesión firme y la transmigración. La transición de la rueda a la adhesión firme requiere que las células T para responder a una señal de re....

Protocolo

1. Revestimiento de la microplaca Wells

Nota: El objetivo de este paso es a las superficies de poliestireno capa con la ICAM-1 para servir como ligandos para células T de LFA-1.

1. Preparar las siguientes soluciones:
   1. Preparar la solución de recubrimiento mediante la resuspensión recombinante de ICAM-1 con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (NaCl 137 mM, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na ₂ HPO _4, 2 mM de KH ₂ PO _4, pH 7,4) enriquecida con calcio (1 mM _CaCl2) y magnesio (2 nM de MgCl _2). Asegúrese de que la concentración final de ICAM-1 es de 10 g / ml, ela....

Resultados

A continuación se muestra un ejemplo de ensayo de adhesión usando células T primarias estimuladas con diversas concentraciones de anticuerpos anti-CD3. Es útil conocer la fluorescencia de las células sin lavar (es decir, la carga total). Células no estimuladas sirven como un control negativo y las células tratadas de PMA son el control positivo para anticuerpos anti-CD3. Las células sembradas en pocillos no recubiertos sirven como un control para la ICAM-1. En un experimento típico, el porcentaje de células tra.......

Discusión

Hay varios ensayos para estudiar las señales a la LFA-1 de activación y adhesión de células T ^12. La citometría de flujo se utiliza para medir la LFA-1 estados de afinidad en las células vivas utilizando anticuerpos monoclonales que se unen selectivamente a cualquiera de doblado o extendido de LFA-1. Una de las limitaciones de este método es que no tiene en cuenta la avidez de las integrinas. Migración ensayos son herramientas útiles, pero miden la migración, y no la adhesión miserable en un punto de tiempo e.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Lector de placas	BioTek	Synergy H1 Pipeta híbrida
multicanal	Fisher	21-377-829
Microplaca de 96 pocillos con fondo óptico	Corning Costar	3603
Recombinante ICAM-1	R& D Systems	ADP4-050
Anticuerpos anti-CD3	Ancell	144-020
PMA	Sigma-Aldrich	79346
BSA	Sigma-Aldrich	A2058
CFSE	Sondas moleculares	C1157
RPMI	Gibco	11875-093
DPBS que contienen calcio y magnesio	Gibco
Linfocitos periféricos	< > ejemplo ratón o humano
Cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich	M8266
Cloruro de calcio	Sigma-Aldrich	499609
Open Gen 5 Software	BioTek	Versión 2.01
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00
Tubos de centrífuga de 15 y 50 ml	Fisher	352099, 352070
Pipetas Pasteur de plástico desechables	Matraces	13-711-7M
T-75	Fisher	50-754-1366
RosetteSep Kit de enriquecimiento de células T	StemCell Technologies	15061

14190250 de cultivo Fisher