Inducida por la quimioterapia Vascular Toxicidad - En tiempo real En vivo Imagen de Deterioro del buque

La evidencia clínica indica que varias clases de quimioterapias producen una variedad de patologías vasculares manifestados por el fenómeno de Raynaud, hipertensión, con infarto de miocardio, ataque cerebrovascular y hepática veno-occlusivedisease ^1,2. "Fármacos antiangiogénicos 'accidental'" es un término bastante nuevo, que describe agentes quimioterapéuticos convencionales que actúan como posibles inhibidores de la angiogénesis, aunque no desarrollaron originalmente para este propósito ^3-5 pero diseñados para eliminar células tumorales mediante la imposición de tan poco "garantía daño "a las células normales como sea posible ^3. Varios quimioterapias se han implicado como vasculo-tóxicos como se ha observado en estudios clínicos utilizando biomarcadores séricos. Entre ellos están los agentes (como la ciclofosfamida), compuestos de platino (como cisplatino) y antraciclinas ^1,2,5-7 alquilantes.

Complicaciones cardiovasculares agudas pueden ocurrir como result de la toxicidad vascular inducida por la quimioterapia. Ellos pueden progresar en condiciones crónicas como la aterosclerosis y representan mayor riesgo de morbilidad vascular tarde. Sin embargo, a pesar de la creciente evidencia clínica, hay una escasez de estudios designados enfatizando el mecanismo de toxicidad vascular y, por tanto, mayor esclarecimiento de la patogenia exacta que infligen se justifica.

Un reto importante en el descubrimiento del mecanismo de toxicidad vascular inducida por la quimioterapia se deriva de la complejidad de la investigación de la función vascular en vivo. Se describe en este documento una plataforma de alta resolución en imagen molecular in vivo en ratones que permite capturar el flujo sanguíneo y características del buque. Esta plataforma facilita la detección de efectos vasculares directos inducidos por el tratamiento: en tiempo real, así como después de ellos durante un período de tiempo dentro de los mismos individuos.

Declaración de Ética: Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional. Cuidado de los animales estaba de acuerdo con las directrices institucionales. Ratones ICR hembra (7-8 semanas de edad; 25 - 30 g) fueron alojados en aparatos de aire acondicionado, luz controlada instalaciones de los animales de la Facultad Sackler de Medicina en la Universidad de Tel-Aviv. Al término, los animales fueron sacrificados con una sobredosis de anestesia.

1. fibred confocal microscopía de fluorescencia de calibración (FCFM)

1. Encienda el dispositivo.
2. Conecte la microsonda (mini0 / 30).
3. Calibrar el dispositivo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2. Los ratones Preparación for Imaging

1. Anestesiar por una inyección subcutánea de tanto Ketaset (100 mg / kg) y XYL-M2 (6 mg / kg). Confirme anestesia adecuada por falta de respuesta a los pies de pellizcar.
2. Incisión en la piel debajo de la ingle con el fin de revelar los vasos arteriales femorales. Mantenga el lugar de la incisión húmeda con solución salina después de la incisión.
3. Calentar la cola usando una bolsa (o un guante) lleno de agua tibia (no demasiado caliente al tacto) por aproximadamente 30 segundos. Preparar un (IV) de derivación intravenosa para la administración del FITC dextrano (un agente de contraste) y de solución salina o de agente quimioterapéutico, mediante la inserción de una aguja (30 G, 1/2 pulgadas) en la vena de la cola y fijación de una jeringa de 1 ml a ella . Asegúrese de que la vena está abierto mediante la inyección de solución salina.
   NOTA: Una administración IV de FITC dextrano (de alto peso molecular; 100 l; 10 mg / ml; 2.000 kDa) facilita la visualización de la microvasculatura femoral por FCFM. La doxorrubicina (100 l; 8 mg / kg, adriamicina) o solución salina también se administran más tarde IV en la vena de la cola pre-calentado.
4. Pasa el raton supina en un escenario de poliestireno. Asegure el ratón a la almohadilla y mantener la posición con cinta adhesiva quirúrgica.

NOTA: El microscopio confocal fibrado utilizado en este estudio se compone de dos unidades: (1) microsonda (mini0 / 30). (2) unidad de escaneo láser (LSU-488; 488 nm de longitud de onda).

1. Realice todas las temporales vueltas análisis utilizando el láser de longitud de onda nm 488 LSU.
   NOTA: El detector detecta la unidad principal filtrada (500-650 nm) de fluorescencia emitida. Las imágenes adquiridas se reconstruyen después y visualizan a una velocidad de 12 cuadros / seg.
2. Desconecte cuidadosamente la jeringa de la aguja y coloque una nueva jeringa que contiene FITC dextrano. Administrar (IV) 100 l de FITC dextrano.
3. Cambie la microsonda (mini0 / 30) a un campo adecuado de visión y fijar que, tras el ajuste al eje z, con el fin de obtener la imagen correspondiente. Espere a que la señal inicial a desvanecerse hasta que una señal clara y enfocada es visible.
4. Grabar un flujo de sangre de referencia para un período de estabilización de corto (~ 30 seg). A continuación, conecte a la aguja otra jeringa, contiene doxorrubicina o solución salina. IV administrar 100 l doxorrubicina o solución salina.
5. Monitorear el flujo de inyectado FITC-dextrano continuamente durante 20 min. En el software FCFM-asociado, utilice el botón de diámetro en la regla superior con el fin de medir los vasos sanguíneos y clasificarlas como pequeños (<15 micras) o grandes (> 15 micras).
6. La eutanasia a los animales con una sobredosis de anestesia.

En las imágenes continua vivo en tiempo real

El aparato de formación de imágenes se utiliza aquí es una alta definición, microscopio confocal fibrado, equipado con una sonda que permite la visualización de la vasculatura y su respuesta a diversos estímulos como la quimioterapia. Este método es mínimamente invasivo ya que si bien puede facilitar la obtención de imágenes de vasos profundos o de órganos, que requiere una pequeña incisión para la sonda. Los haces de sonda constan de decenas de miles de fibras óptica del microscopio, y un conector de precisión propietario. Una representación esquemática se muestra en la Figura 1.

Obtención de imágenes de la microvasculatura femoral

Hemos clasificado la red de la vasculatura arterial femoral de acuerdo a los vasos de diámetro (pequeña <15 micras; grande> 15 micras) por FCFM en ratones inyectados con FITC-dextrano. Una vasoconstricción rápida (2-5 minutos) de los vasos pequeños fue inducida por la doxorubicina. Un disappearan completace de la fluorescencia FITC-dextrano, tratamiento de 8 minutos después de la doxorrubicina (Figura 2A por ejemplo, flechas, Video 1). En varios ratones, la reducción de la señal fluorescente en el vaso sanguíneo y aumentar la señal de su rodea se observó en la región perivascular, unos segundos después de la administración de doxorrubicina (Figura 2B g, flechas). Estos resultados indican que el aumento de permeabilidad de los vasos y las fugas del dextrano de alto peso molecular desde el vaso sanguíneo a los tejidos circundantes. No señal de fluorescencia fue evidente tras la administración de doxorrubicina en los ratones que no fueron inyectados previamente con FITC-dextrano. Los ratones tratados con paclitaxel demostraron estructura similar vasos de sangre y el caudal a los observados en los ratones inyectados con solución salina (no mostrado), en todo el periodo de medición.

Figura 1. La FCFM El microscopio confocal se utiliza aquí se compone de dos unidades: la microsonda (mini0 / 30) y la unidad de exploración láser (LSU-488; 488 nm de longitud de onda)..

Figura 2. Imágenes de señal de fluorescencia FITC-dextrano en la microvasculatura femoral. Los vasos se clasifican en dichotomously menor (<15 micras) o mayor (> 15 micras) de acuerdo con su calibre. Microvasculatura femoral del FITC dextrano (100 l; 10 mg / ml). Se obtuvieron imágenes de los ratones inyectados antes y durante la administración IV de cualquiera de doxorrubicina o solución salina (A) Los vasos menores, fotografiada por FCFM, comenzó vasoconstrictores agudamente 2 min después de la administración de doxorrubicina (f , flecha), que muestra un estrechamiento continuo de la señal fluorescente hasta su desaparición completa, sin recuperación aparente recuperación de la señal durante el next ocho minutos de la imagen en tiempo real (g, flecha). (B) Aspecto, en algunos instantáneas, de una zona de "vaga" alrededor de las paredes de los vasos sanguíneos de ratones inyectados con quimioterapia (g flecha) inmediatamente después de la inyección, indica un potencial El dextrano-FITC fugas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Vídeo 1. imágenes microvasculatura femoral. Un representante fotografiado película de menor fluorescente FITC-dextrano (<15 micras de diámetro) los vasos sanguíneos. Tiempo microvasculatura de ovario y femoral vueltas fotografía: ratones inyectados con 100 l de FITC-dextrano (10 mg / ml) fueron imágenes y fotografiado desde el momento de la administración IV de la doxorrubicina. 2 - 5 min después de la inyección doxorrubicina, vasos menores mostró vasoconstricción dramática seguido por la abolición completa de la señal fluorescente, ya después de 8 min treatment. (AVI) Por favor haga clic aquí para ver el vídeo.

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