Evaluación de Cáncer de Ovario esferoide El apego y la invasión de células mesoteliales en Tiempo real

El cáncer de ovario tiene la tasa más alta de mortalidad de todos los cánceres ginecológicos ^1. A nivel mundial, hay ~ 230 000 casos y más de 100.000 muertes debido a la enfermedad cada año ^1. La mayoría de los pacientes (> 75%) se diagnostican después de que el cáncer ya se ha extendido por metástasis, cuando el tratamiento se complica aún más por el aumento de la resistencia a la quimioterapia y el pronóstico es pobre ^2. Los pacientes en estadio III-IV de la enfermedad metastásica tienen tasas de supervivencia a 5 años de sólo el 30-40% ^3. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de una mejor comprensión de los comportamientos celulares que subyacen a la metástasis del cáncer de ovario con el fin de tratar eficazmente la enfermedad avanzada.

El modelo actual de la metástasis del cáncer de ovario propone varios pasos en el proceso metastásico, cada uno de los cuales se produce en un microambiente distinto que los impactos en el comportamiento del tumor. Metástasis de células de cáncer de ovario inicialmente se desprenden de la localización del tumor primario y sobreviven en una no adherenciaEstado ENT dentro del fluido peritoneal como células individuales o estructuras multicelulares en tres dimensiones, denominado agregados o esferoides multicelulares ^2,4,5. Las células que no forman esferoides en suspensión son más susceptibles a la anoikis ^2,4,5. Esferoides también exhiben resistencia a la quimioterapia aumentó, lo que contribuye a la enfermedad residual y posterior recurrencia del cáncer ^2,4,5. Un segundo paso crítico en la metástasis del cáncer de ovario es la transición de los agregados de grupos de libre flotación de tumores secundarios establecidos dentro de la pared peritoneal y el omento ^5,6. Las interacciones célula-célula y célula-sustrato se han implicado en la formación de agregados, la supervivencia, y la adhesión a la matriz extracelular (ECM) producida por el revestimiento mesotelial del peritoneo ^4-11. Como, sin embargo, estos procesos son poco conocidos.

Para definir los mecanismos implicados en la diseminación de los cánceres de ovario, esferoides pueden ser generATED a partir de líneas celulares de cáncer establecidas utilizando métodos de cultivo no adherentes, el mantenimiento de las células en suspensión ya sea mediante la adición de metilcelulosa a los medios de cultivo de ^12,13 o mediante el cultivo de células en placas de baja fijación ^2,14. Cuando cultivadas de esta manera, las células de cáncer de ovario se ensamblan para formar agregados multicelulares o esferoides que presentan propiedades celulares, moleculares, y bioquímicas similares a las de los agregados tumorales encontrado in vivo ^2,14. Después de la formación, esferoides pueden ser posteriormente cosechadas a partir del medio no adherentes y se volvieron a sembrar en una variedad de superficies sólidas para más estudios funcionales. Esto representa un avance sobre ensayos en cultivo en monocapa, que no modelar con precisión el comportamiento de células en metástasis de cáncer de ovario en un entorno no adherente tal como el líquido intraperitoneal.

La capacidad invasiva de esferoides de cáncer puede ser evaluado en ensayos de punto final tradicional en Boyden cámaras ² 15,16; Sin embargo, el análisis de los datos lapso de tiempo es mucho tiempo y puede ser subjetiva. En la presente memoria, se describe un método rápido, cuantitativo para la evaluación de los comportamientos invasivos de esferoides de cáncer de ovario en tiempo real. En primer lugar, se estableció un modelo de célula-esferoide mesotelial que representa la etapa de la metástasis del cáncer de ovario cuando esferoides multicelulares se unen a e invaden el revestimiento peritoneal para formar tumores secundarios. Entonces metodología para un analizador en tiempo real de la célula (RTCA; ver la tabla Materiales para detalles de la empresa) fue adaptado para llevar a cabo mediciones en tiempo real para la cuantificación de la capacidad invasiva de diferentes líneas celulares de cáncer de ovario cultivadas como esferoides y probados en este modelo.

En la RTCA eninstrumento, las respuestas celulares se monitorizan continuamente en el transcurso de un ensayo, sin la necesidad de etiquetas exógenas, mediante la medición de cambios en la impedancia eléctrica. Placas de cultivo especialmente diseñados tienen microelectrodos de oro recubiertas situadas debajo de una membrana microporosa en la interfaz entre las cámaras superior e inferior de un 2 septadas bien (placas 'CIM). La ubicación de los electrodos en la cámara inferior permite la medición de cambios en la impedancia eléctrica como células invaden a través de un ECM o ECM barrera / celular. La interfaz de membrana entre las 2 cámaras de cada placa de CIM está recubierto en primer lugar con el componente de ECM de interés. En el sistema modelo de la célula mesotelial-esferoide, la interfaz está recubierta con una capa de Matrigel (ver la tabla Materiales para detalles de la empresa), para imitar el complejo ECM subyacente el revestimiento mesotelial del peritoneo, seguido de una monocapa confluente de mesotelial humana ' células diana '. Por último, preformadas esferoides de cáncer de ovario son added. Esferoidal células del cáncer de ovario deben invadir activamente a través de la capa de células diana y la matriz para llegar a la cámara inferior y alterar las lecturas de impedancia eléctrica. Las células diana en su propia también son evaluados para asegurarse de que no invaden a través de la capa de matriz y son adecuados para uso en este ensayo.

1. Preparación de las células, Medios y Reactivos

1. Preparación del medio que contiene metilcelulosa-
   1. Disolver 1,5 g de metilcelulosa en 100 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (sin aditivos) en un matraz de 250 ml.
   2. Calentar la solución a bajo en el microondas durante 5 min; tener cuidado para evitar hirviendo sobre.
   3. Una vez que el polvo de metilcelulosa es semi-disueltos, añadir un agitador magnético limpio y los medios de comunicación para tomar el volumen a 125 ml.
   4. Mezclar, invertido, y se agita a temperatura ambiente durante 1,5 horas, seguido de agitación a 4 ° C durante la noche.
   5. Dividir la solución en partes iguales en cuatro tubos de 50 ml y centrifugar durante 1,5 horas a 2300 x g.
   6. Recoger el sobrenadante transparente, de alta viscosidad (aproximadamente el 90-95% de las acciones), alícuota en tubos de 50 ml estériles, y se almacena a 4 ° C durante un máximo de 3 meses.
2. Cultura y Etiquetado de las células
   1. Mantener las líneas celulares de cáncer de ovario en monocapa en un tiincubadora de cultivo ncidencia a 37 ° C, 5% de _CO2 en medio de crecimiento apropiado (DMEM para las células KGN ¹⁷ y MCBD110: M199 para las líneas celulares OVCA429 y OVCA433 ¹⁸⁾ suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L -glutamina, y 1% de penicilina-estreptomicina.
   2. Mantener las células mesoteliales humanos LP9 en M199: Hams medio F12 que contiene 15% de FBS, 10 ng / ml de Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) y 400 ng / ml de hidrocortisona, en una incubadora a 37 ° C, 5% de CO _2.
   3. Se siembran las células en el tamaño deseado frasco y crecen hasta aproximadamente el 75% de confluencia. Células de la cosecha por tripsinización utilizando 0,05% de tripsina / EDTA, centrifugado a 186 xg durante 5 min, y lavar sedimento de células dos veces con PBS.
   4. Contar las células utilizando un hemocitómetro.
3. Método de etiquetado celular fluorescente opcional
   1. Resuspender las células cancerosas a una concentración final de 1 x 10 ⁶ células / ml en 1 ml de precalentado PBS/0.1% de BSA.
   2. Añadir 2 l de 5 mM de stock célula Trsolución CSFE as (u otra etiqueta celular preferida que está retenido a largo plazo) a las células a una concentración final de 10 mM y se incuba a 37 ° C durante 10-15 min en un baño de agua.
   3. Se inactiva la reacción con 1 ml de medio frío de hielo que contienen 10% de FBS y de re-sedimento por centrifugación. Resuspender en 10 ml de medio de crecimiento precalentado adecuado (vea Paso 1.2.1).
   4. Se siembran las células en un 75 ^cm2 de filtro con tapa el frasco y la cultura a 37 ° C, 5% de CO _2.
   5. Compruebe células bajo un microscopio de fluorescencia para verificar que el nivel de fluorescencia de etiquetado es adecuada para la detección. Una vez que las células alcanzan aproximadamente el 75% de confluencia, cosecha y cuentan que en los pasos 1.2.3 y 1.2.4 anteriores.

2. Generación de esferoides en metilcelulosa

1. Calcular el volumen de las células de cáncer de ovario de la sección 1 necesarias para la generación de esferoide (se requiere un total de 300.000 células por cada pleno experimento placa de 96 pocillos). Note: si el uso de diferentes líneas celulares que se presenta aquí, pueden necesitar ser optimizado para cada línea de las densidades de células de generación de esferoide uniforme.
2. Para calcular la dilución de las células en los medios de comunicación metilcelulosa, en primer lugar restar el volumen de la celda requerida (paso 2.1) a partir de 15 ml.
3. Añadir 3 ml de solución de metilcelulosa (para hacer 20% de metilcelulosa final) a un volumen de medio de cultivo apropiado para cada línea celular, igual a 15 ml, menos el volumen de la celda y se mezcla a fondo por inversión suave.
4. Añadir 300.000 células al medio que contiene metilcelulosa y mezclado a fondo por inversión suave.
5. Pipetear 150 l de la mezcla de células / metilcelulosa / media (para un total de 3000 células / pocillo) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos cóncava cultivo de fondo y de la cultura a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 1-4 días o hasta esferoides uniformes forman (1 esferoide / pocillo se observa por lo general).

3. RTCA celulares Invasión ensayos

NOTE: lecturas de impedancia se expresan como el Índice de Células (CI), un parámetro adimensional que es un cambio relativo en la impedancia de la pila medida que representa el estado de las células. Para el análisis, los datos de importación en una hoja de cálculo, como Microsoft Excel.

1. Preparación Plate
   1. Trabajando en grupos de 4 pozos a la vez, añadir 50 l de matriz (diluido 1:10 en medio de cultivo libre de suero) a cada pocillo de la cámara superior de una placa de 16 pocillos RTCA CIM para asegurar que el área total de la superficie está cubierta . Retire 30 l de la matriz de inmediato, pero poco a poco, para deshacerse de cualquier exceso de líquido.
   2. Incubar la placa a 37 ° C durante 4 horas antes de su uso en una incubadora de cultivo de tejidos.
   3. Añadir 30 l de medio libre de suero (SFM) apropiados para cada línea celular de cáncer a la cámara superior y 160 l de los medios de comunicación con o sin suero (según su diseño experimental) a la cámara inferior.
   4. Montar la placa CIM haciendo clic en la cámara baja en la cámara superior y equilibrcomió en una incubadora a 37 ° durante 1 hora en una incubadora de cultivo de tejidos.
2. Programación del instrumento RTCA
   1. Abra el programa de RTCA y seleccione la pestaña "Diseño". Resalte todos los pozos experimentales.
   2. Haga clic derecho sobre pozos y seleccione 'Activar pozos'; luego rellenar condiciones experimentales y nombres de celda si lo deseas.
   3. Para agregar pasos o pasos secundarios para el programa, seleccione la pestaña 'Schedule' y haga clic derecho en 'Agregar un paso'. El primer paso es una preprogramada barrido de fondo, que se incorpora automáticamente en el programa una vez 'agregar un paso' que se elija.
   4. Introduzca los detalles del programa que desee para la Etapa 2 del programa de RTCA, que se registrarán las lecturas durante el establecimiento de la monocapa LP9. Agregar los intervalos de tiempo entre lecturas de impedancia seleccionando la pestaña 'Intervalo' y entrar '15 minutos '. Agregar duración experimental seleccionando el 'Duración' una pestañad entrar en un tiempo de entre 12 a 24 horas.
   5. Para agregar pasos posteriores, seleccione la pestaña 'Schedule' y haga clic derecho en 'Agregar un paso "e introduzca los detalles de los pasos adicionales, como el anterior. Paso 3 del programa RTCA dirigirá el instrumento para tomar las lecturas durante la invasión esferoide; introducir min '5 'bajo la' pestaña 'y '48 horas' de intervalo en la pestaña "Duración".
   6. Seleccione 'plato' en la barra de menú y guardar.
3. Generación de LP9 monocapa y medición del esferoide Invasión
   1. Coloque la placa de la CIM en el instrumento RTCA y programa abierto desde el paso 3.2 anterior. Antes de la adición de células, seleccione 'Ejecutar' en la barra de menú y luego en "Inicio". Un barrido de fondo se realizará automáticamente (paso 1 en las instrucciones del software RTCA).
   2. Retire la placa de la CIM desde el instrumento tras el barrido de fondo y el lugar en una campana de cultivo de tejidos.
   3. 50,0 Placa00 LP9 células suspendidas en 160 l SFM en la cámara superior de cada placa CIM también.
   4. Colocar la placa en el instrumento RTCA y tomar lecturas cada 15 minutos, mientras que la monocapa LP9 está estableciendo durante la noche (Paso 2 del programa RTCA).
   5. Cosecha esferoides cancerosas generan en la etapa 2 'Generación de esferoides en metilcelulosa', arriba.
      1. Asépticamente, corte 1 mm de la parte superior de una punta de pipeta de 1 ml y utilizar para recuperar suavemente el contenido de cada pocillo. Transferir a un tubo _estéril.
      2. Se centrifuga a 120 xg esferoides durante 8 minutos, y retirar medio de metilcelulosa que contiene por aspiración suave.
      3. Lave esferoides dos veces más con PBS, centrifugar a 120 xg durante 8 minutos para sedimentar esferoides después de cada lavado.
      4. Para cada pocillo experimental, resuspender un total de 10 esferoides en 160 l de medio sin FBS.
      5. Pausa el experimento RTCA seleccionando 'Ejecutar' desde la barra de menú y la comprobación y# 8216; Pausa '. Retire la placa de la CIM en el instrumento, y colocarlos en una campana de cultivo de tejidos. Aspirar los medios de comunicación de cada pocillo y reemplazar con los medios de comunicación que contiene esferoide (10 esferas en 160 l) o medio fresco para los pocillos de control-LP9 solamente.
   6. Devuelva la placa al instrumento RTCA. Seleccione 'Ejecutar' desde la barra de menú y comprobar 'Abortar paso'. El programa se desplazará al siguiente paso automáticamente. Para reanudar el experimento, seleccione 'Ejecutar' desde la barra de menú y comprobar 'Start / Continue'. Paso 3 en el programa RTCA iniciará.
4. Análisis de Datos
   1. Para determinar el nivel de invasividad de las células esferoide, restar los valores obtenidos para la monocapa LP9 sólo a partir de las lecturas individuales obtenidos para las líneas celulares de cáncer de ovario en cada punto de tiempo.
   2. Para trazar "invasión esferoide ', normalizar todos los valores hasta el punto de tiempo en el que se añadieron los esferoides en la placa, por setting ese punto de tiempo a '0 '.

Esferoides de cáncer de ovario puede ser generado a partir de muchos tipos de líneas celulares mediante el cultivo en suspensión o por la recolección de células tumorales primarias de la ascitis maligna 2,14. Aquí dos líneas celulares de cáncer de ovario epitelial, OVCA433 y OVCA429, y una línea de tumor de células de la granulosa del ovario, KGN, se han utilizado para generar esferoides (Figura 1A). En este método, las células son cultivadas en pozos de fondo en U mientras que está suspendido en los medios de comunicación que se ha hecho viscoso por la adición de metilcelulosa. En estas condiciones, muchas células de cáncer de ovario presentan una capacidad inherente a agregarse para formar esferoides 13. Tras el cultivo durante la noche en suspensión en metilcelulosa / medios de comunicación, todas las tres líneas celulares forman estructuras compactas esferoide de aproximadamente 400-500 m de diámetro (Figura 1A). Mientras tanto, se prepara la placa de RTCA CIM, en primer lugar, mediante el recubrimiento de la interfase de la membrana porosa con la matriz y luego una monocapa confluente de mes humanoscélulas othelial (Figura 1B). Una vez formados, los esferoides se transfieren luego a la placa de CIM preparado. Esferoides cáncer cosechadas se siembran en placa en la parte superior de la monocapa LP9 y evaluaron como se describe a continuación. Imágenes bajo microscopía de fase estándar (o bajo microscopía fluorescente, si se siguió el paso marcado de células opcional) de cultivos paralelos se toman periódicamente para ayudar en la interpretación de los datos RTCA (Figura 1C).

Es informativo para evaluar tanto el nivel basal de la invasión de una línea celular de cáncer, así como la invasión inducida quimioatrayente-. Típicamente, la invasividad basal se mide por la adición de SFM a ambas las cámaras superior e inferior. Medio completo (10% de FBS), que contiene muchos factores quimiotácticos potenciales, se utiliza en el ejemplo actual para examinar invasión 'inducida quimioatrayente-' (Figura 2). Estudios paralelos de células mesoteliales LP9 solos confirmaron que estas células son mínimamente eninvasiva más de 2 días bajo sea basal o 'quimioatrayente' condiciones inducidas y por lo tanto eran un buen tipo de células para su uso en ensayos de co-cultivo con células de cáncer de ovario (Figuras 2A y 2B). En contraste, esferoides de cáncer de ovario generados usando cualquiera de las tres líneas celulares exhibieron la capacidad de invadir hacia un quimioatrayente (FBS) (Figuras 2A-2C). La principal ventaja de la utilización de los instrumentos en tiempo real RTCA sobre ensayos de punto final tradicionales es que los cambios en el comportamiento celular / esferoide se pueden cuantificar con el tiempo. Durante el ensayo de 2 días, el KGN, OVCA429 y líneas celulares OVCA433 todos mostraron la capacidad de invadir a un quimioatrayente (indicado mediante el aumento de los índices de glóbulos), pero los bajos niveles basales de la invasión (Figura 2 C). Las líneas celulares mostraron tasas similares de invasión, tal como se indica por las pistas paralelas de las curvas (Figura 2C); Sin embargo, la curva de OVCA429 exhibió una asíntota superior más alta,lo que indica un nivel máximo más alto de invasión en comparación con las otras líneas celulares. Además, las líneas celulares mostraron una diferencia en sus tiempos de inicio de la invasión, con las células KGN invadir rápidamente las barreras celulares y de la matriz y la OVCA433 y OVCA429 células que tienen 3 a 5 veces más largo para invadir, respectivamente (Figura 2D). Es importante destacar que, sus comportamientos en el inicio de la invasión no eran predictivos de su capacidad general para la invasión (Figuras 2C y 2D). Esto sugiere diferentes capacidades inherentes de las líneas celulares de cáncer, pero también puede indicar que diferentes factores pueden regular los comportamientos invasivos tempranos y tardíos de esferoides.

Figura 1 generación esferoide y el modelo de juego experimental A:.. Imagos bajo un microscopio de contraste de fase de esferoides se forman en metilcelulosa / media (arriba) y de la línea celular correspondiente crecido como una monocapa (abajo) B:. Esquema que muestra el RTCA 2 recámara placa CIM bien establecido, en el que pre-formado el cáncer de ovario esferoides se colocan en la parte superior de una monocapa de una capa mesotelial barrera LP9 / matriz en la cámara superior y media ± FBS como quimioatrayente se añade a la cámara inferior. Los electrodos debajo de la interfaz de la medida 2 cámaras incrementando la impedancia eléctrica como más células invaden a través de las barreras a la cámara inferior C:. Imágenes de esferoides KGN en la parte superior de la monocapa LP9 bajo microscopía de contraste de fase (izquierda) o la microscopía de fluorescencia (derecha). Las barras de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tarifa de acceso abierto pagada por ACEA Biosciences, Inc. y el Instituto de Investigación Médica MIMR-PHI.