Este artículo le mostrará cómo controlar la dinámica de glutamina en las células vivas mediante FRET. Sensores codificados genéticamente permiten la monitorización en tiempo real de las moléculas biológicas con una resolución subcelular. Diseño experimental, detalles técnicos de los parámetros experimentales, y las consideraciones para los análisis post-experimentales serán discutidos para los sensores de glutamina codificados genéticamente.
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Artículo de método
Glutamina Flux Imaging utilizando sensores codificados genéticamente
En este artículo
Resumen
Resumen
Sensores codificados genéticamente permiten la monitorización en tiempo real de las moléculas biológicas con una resolución subcelular. Una enorme variedad de tales sensores para moléculas biológicas se hizo disponible en los últimos 15 años, algunos de los cuales se convirtió en herramientas indispensables que se utilizan rutinariamente en muchos laboratorios.
Una de las emocionantes aplicaciones de sensores codificados genéticamente es el uso de estos sensores en la investigación de los procesos de transporte celulares. Propiedades de los transportistas, como la cinética y especificidades de sustrato se pueden investigar a nivel celular, que proporciona posibilidades de análisis específicos de tipo celular de las actividades de transporte. En este artículo, vamos a demostrar cómo la dinámica del transportador se pueden observar utilizando el sensor de glutamina codificado genéticamente como ejemplo. Diseño experimental, detalles técnicos de los parámetros experimentales, y las consideraciones para los análisis post-experimentales serán discutidos.
Introducción
Debido a la notable progreso en tecnologías que permite el examen del transcriptoma y el proteoma a nivel celular, ahora ha quedado claro que la bioquímica y el flujo resultante de los metabolitos y los iones son altamente tipo específico de célula. Por ejemplo, en el hígado de los mamíferos, la degradación y la síntesis de glutamina secuencial se llevan a cabo de forma simultánea por las células periportal y células perivenosos respectivamente, la alimentación de amonio para el ciclo de la urea en el primer tipo de células, mientras que consume el exceso de amoníaco en este último 1-3. En algunos casos, se detecta heterogeneidad bioquímica significativa i....
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Protocolo
1. Preparación de la muestra
Nota: En muchos casos, los experimentos de perfusión verterlo una porción significativa de las células, lo que puede convertirse en un problema frustrante. Aunque no es necesario para todas las líneas celulares, las superficies de vidrio cubierta de recubrimiento con poli-L-lisina (añadir 1,0 ml/25 cm 2 de solución de 0,01% de la superficie, incubar> 5 min, se lava dos veces con agua de calidad de cultivo celular, y en seco la cabina de bioseguridad) mejora la adhesión celular. Además, tenga en cuenta el nivel de bioseguridad (BSL) de la línea celular utilizada, y siga el procedimiento operativo están....
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Resultados
Tiempo curso experimentos típicos se representan en la Figura 2. En estos experimentos, FRET sensores de glutamina con afinidades de 8 mM (FLIPQTV3.0_8m, Figura 2A y 2B) y 100 M (FlipQTV3.0_100 μ C y D) fueron co-expresada con un ASCT2 intercambiador de aminoácidos obligatoria 18 en células COS7 10. La afluencia de glutamina se detecta como el cambio en las relaciones de intensidad de fluorescencia entre el donante (mTFP1) y el aceptor (Venus)
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Discusión
El éxito de los experimentos de imagen depende de algunos factores críticos. Uno de estos factores es la afinidad de sensores utilizado, como se discutió anteriormente. Concentración absoluta del sustrato en el compartimiento subcelular de interés, sin embargo, es a menudo desconocida. Por lo tanto le recomendamos probar múltiples sensores con afinidades escalonados para encontrar el que funciona mejor bajo la condición experimental deseado. Por ejemplo, en nuestro caso transfectadas las células COS7 con sensores de glu.......
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Divulgaciones
No hay nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención 1R21NS064412, subvención NSF 1052048 y Jeffress Memorial Trust subvención J-908.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microscopio fluorescente invertido | Olympus | IX81F-3-5 | Un microscopio fluorescente invertido equivalente de otros proveedores también sería apropiado. |
| Filtro de excitación (mTFP1) | Omega Optical | 3RD450-460 | Ancho de banda 450-460 nm Filtro de |
| excitación (Venus) | Chroma | ET500/20 | Ancho de banda 490-510 nm |
| Filtro de emisión (mTFP1) | Chroma | HQ495/30m | Ancho de banda 475-505 nm |
| Filtro de emisión (Venus) | Chroma | ET535/30m | Ancho de banda 520-550 nm |
| Espejo dicroico (canales FRET) | Chroma | 470dcxr | Paso largo, corte de 470 nm |
| Espejo dicroico (canal YFP) | Chroma | 89002bs | Pases 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm |
| mJuego de filtros Cherry | Chroma | 49008 | Excitación 540-580 nm, paso largo dicroico con corte de 585 nm, filtro de emisión 595-695 nm |
| Fuente de luz | Olympus | U-LH100L-3-5 | Fuente de luz LED o halógena que produce una intensidad de luz estable, no se recomiendan lámparas de mercurio |
| Cámara CCD | Qimaging | Rolera-MGi EMCCD | |
| Objetivo de fluorescencia apocromática Sistema de perfusión | Olympus | ||
| , ValveBank II | AutoMate Scientific | [01-08] | Otros sistemas de perfusión que permiten un intercambio rápido de soluciones también funcionarían |
| Cámaras de flujo laminar | C& L Instruments | VC-MPC-TW | Otras cámaras de flujo larminar también funcionarían. |
| Portaobjetos con cámara | Lab-Tek | 154534 | Para experimentos a cámara abierta Bomba de |
| perfusión | Thermo Scientific | 74-046-12131 | Para experimentos a cámara abierta Software |
| que soporta mediciones radiométricas | Intellegenent Imaging Innovation | Slidebook 5.5 | |
| Cabina de bioseguridad de flujo laminar | ESCO | LA-3A2 | |
| Isotemp CO2 Incubadora | Thermo Scientific | 13-255-25 | |
| Dulbecco's MEM (DMEM) | Hyclone | SH30243.01 | |
| Suero cósmico de ternera | Hyclone | SH3008703 | |
| Penicilina/estreptomicina | Hyclone | SV30010 | |
| Medio sin suero para la transfección (OPTI-MEM I) | Invitrogen | 31985 | Utilizado con Lipofectamine 2000 |
| Solución de poli-L-lisina | Sigma | P4707 | |
| Deslizamientos de cubierta de vidrio circular de 25 mm | Thermo Scientific | 12-545-102 | En caso de que se utilice VC-MPC-TW |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | También se pueden utilizar otros reactivos de transfección. |
| Solución A (tampón de Hank) | 9,7 g de sal HANK (Sigma H1387), 0,35 g de NaHCO3, 5,96 g HEPES a 1 L, pH ajustado a 7,35 con NaOH | ||
| Solución B Solución A | + 0,04 mM Gln | ||
| Solución C | Solución A + 0,2 mM | ||
| Gln Solución D | Solución A + 1 mM | ||
| Gln Solución E | Solución A + 5 mM Gln | ||
| Solución F | Solución A + 5 mM Ala |
Referencias
- Haussinger, D. Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle. Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).
- Haussinger, D. Hepatic glutamine metabolism. Beitr Infusionther Klin Ernahr. 17, 144-157 (1987).
- Watford, M., Chellaraj, ....
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Reimpresiones y permisos
