Análisis del daño epitelial Producido por<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infección

Resumen

La infección humana por Entamoeba histolytica conduce a la amebiasis, una causa importante de diarrea en los países tropicales. La infección se inicia por la interacción de agentes patógenos con células epiteliales intestinales, provocando la apertura de los contactos célula-célula y en consecuencia la diarrea, a veces seguido por infección del hígado. Este artículo proporciona un modelo para evaluar las primeras interacciones huésped-patógeno para mejorar nuestra comprensión de la patogénesis de la amibiasis.

Resumen

Entamoeba histolytica es el agente causante de la amebiasis humano, una causa importante de diarrea y absceso hepático en los países tropicales. La infección se inicia por la interacción del patógeno con las células epiteliales intestinales. Esta interacción da lugar a una alteración de las estructuras intracelulares tales como uniones estrechas (TJ). TJ asegurar el cierre de la capa epitelial para separar el tejido del huésped de luz intestinal. Estudios recientes demuestran que la interrupción de TJ por la EhCPADH112 proteína parasitaria es un requisito previo para E. invasión histolytica que se acompaña de disfunción de la barrera epitelial. Por lo tanto, el análisis de los mecanismos moleculares implicados en TJ desmontaje durante E. invasión histolytica es de suma importancia para mejorar nuestra comprensión de la patogénesis de la amibiasis. En este artículo se presenta un modelo sencillo que permite la evaluación de las interacciones huésped-patógeno iniciales y el potencial de la invasión del parásito. Parámetros que deben analizarse incluyen tresistencia eléctrica ransepithelial, la interacción de EhCPADH112 con receptores de la superficie epiteliales, cambios en la expresión y localización de marcadores epiteliales de unión y localización de moléculas de parásitos dentro de las células epiteliales.

Introducción

Entamoeba histolytica es un protozoo único responsable de la amibiasis humana, una infección intestinal de células causando inflamación y diarrea. E. histolytica infecta a 50 millones de personas al año, pero sólo alrededor del 10% de las personas infectadas desarrollan los síntomas asociados a la amibiasis ^1. La infección se produce por ingestión de alimentos contaminados o agua que contiene E. quistes histolytica. En el intestino, quistes producen trofozoítos en vivo que se adhieren a la mucina de colon y proliferan ^2. Los trofozoítos suelen formar quistes que se excretan a través de las heces. En otros caso....

Protocolo

1. Establecimiento y mantenimiento de E. Culturas histolytica

1. Crecer axénicamente (totalmente libre de todos los demás organismos contaminantes) 1 x 10 ⁵ trofozoítos de Entamoeba HML cepa histolytica: IMSS clon A ¹⁸ en 16 x 125 mm tubos de cultivo con teflón tapones de rosca de línea regular (o 1 x 10 ⁶ trofozoítos en una desechable T- matraz de 25) y 15 ml (o 50 ml en matraz T-25) de TYI-S-33 medio (caldo de TYI suplementado con 3% de mezcla de diamante vitamina, suero inactivado bovino adulto calor al 10%, 0,5 UI / ml de penicilina y 35 mg / ml de estreptomicina) ¹⁹ en una in....

Resultados

Para una E. éxito cultura histolytica, dos importantes condiciones debe cumplirse: el crecimiento en condiciones axénicas y cosecha en fase logarítmica. Anteriormente, cultivos de E. histolytica se establecieron fácilmente en asociación con ciertas especies de bacterias o tripanosomátidos ^22. Sin embargo, hoy en día es común tener cultivos axénicos de este parásito es decir, un subcultivo indefinida de amebas en un ambiente libre de bacterias que metabolizan, hongos, protozoos, o cé.......

Discusión

Con el fin de estudiar in vitro las interacciones huésped-patógeno durante la infección epitelial por E. histolytica, es fundamental trabajar con culturas bien establecidos de ambas células epiteliales y trofozoítos. Por ejemplo, anteriormente, E. culturas histolytica usualmente se habían establecido en asociación con ciertas especies de bacterias o tripanosomátidos ^22,23. Sin embargo, el co-cultivo de E. culturas histolytica es contraproducente para el es.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clon A	Hospital IMSS, México	Sin/número	Trofozoítos virulentos18
TYI caldo	Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich	211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879	3,45% BBL Biosate peptona 58 mM glucosa 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6,5 mM K2HPO4 16,3 mM ácido ascórbico 8,1 mM L-cisteína 0,1 mM citrato de amonio férrico, ajuste el pH 6.819
Suero bovino adulto	Microlab, Labs., Mex.	SU146	Úselo al 10% e inactivado a 56 ° C durante 30 min
Diamond  mezcla de vitaminas  - Tween 80	In vitro	SR-07	Uso al 3%
Penicilina	A orillas del lago,  Méx.	34564SSA IV	0,5 UI/ml
Estreptomicina	A orillas del lago,  Méx.	75757SSA IV	35 y micro; g/ml
Tubos de cultivo con tapón de rosca Pyrex de 15 ml con tapones fenólicos revestidos de PTFE	Corning-Pyrex	9826-16X	16 x 125 mm, capacidad 15 ml y tapones fabricados con una fórmula especial resistente a los efectos de la temperatura
Placas de cultivo celular, 6 pocillos	Corning-Costar	3516	Placas estériles, diámetro del pocillo 34,8 mm y área de crecimiento 9,5 cm2.  Los anillos de la tapa evitan la contaminación cruzada
Matraz de cultivo celular de 25 cm2	Corning-Costar	430168	Matraces de cuello inclinado
MDCK (riñón canino Madin Darby) tipo I	Colección Americana de Cultivos Tipo	CCL34	Células epiteliales renales cultivadas entre el pasaje DMEM de 60th y 90th
DMEM	Gibco	12800-017	Dulbecco's Modified Eagle Medio con alta glucosa.
Neonate Calf Serum	In vitro	S-02	Usar al 10%.
Mezcla de penicilina/estreptomicina	In vitro	A-01	Solución madre 10.000 U/µ g/ml
de insulina	AMSA	398MJ94SSA	IV Solución madre 100 UI/ml
Solución de tripsina	Frasco in vitro	EN-005	Solución enzimática al 0,05% sin calcio y magnesio
75 cm2 matraz de cultivo	Corning-Costar	430720	Matraces de cuello inclinado para el cultivo de trofozoítos en medio TYI-S-33
Soportes permeables Transwell	Corning-Costar	3470	0,4 µ membrana de poliéster M, inserto de 6,5 mm en placa de 24 pocillos, área de crecimiento placa de cultivo celular de 0,3 cm2
24 pocillos	Corning-Costar	3524	Poliestireno transparente, tratado para una fijación celular óptima, esterilizado por radiación gamma y certificado como no pirogénico
Complete Mini	Roche	11836 153 001	El cóctel de inhibidores de la proteasa inhibe un amplio espectro de serina, cisteína y metaloproteasas. Concentración final 1 mM
Trans-epoxisuccinil-L-leucylamido (4-guanidino) butano (E-64)	SIGMA-Aldrich	E3132	Inhibidor de la cisteína proteasa, concentración final 40 y micro; g/ml
p&alfa; ZO-1	Invitrogen	402200	IgG policlonal de conejo  anticuerpo  contra  un péptido sintético en la región media de la proteína humana ZO-1
mα EhCPADH112	Anticuerpo casero	sin/ Número	Anticuerpo monoclonal de ratón IgM  contra  epítopo 444-601 ubicado en el terminal C de EhCPADH11221,27
FITC-cabra anti-ratón IgM Zymed		62-6811	Isotiocianato de fluoresceína (FITC)-marcado con cabra anti-ratón secundario  anticuerpo
TRITC- cabra anti-conejo IgG (H+L)	Zymed	816114	Marcado con isotiocianato de tetrametil-rodamina (TRITC)  anti-conejo de cabra IgG  anticuerpo secundario.
Instrumento de precisión STX2	Electrode World	102711	Consta de un par fijo de electrodos dobles, de 4 mm de ancho y 1 mm de grosor. Cada varilla del par de electrodos contiene una pelleta de plata/cloruro de plata para medir el voltaje y un electrodo de plata para pasar la corriente. Para usar con EVOM
Instrumento de precisión mundial del voltohmetro epitelial EVOM		12111	Úselo en modo de resistencia y manténgalo desenchufado durante las mediciones TER
Cámara de Neubauer	MEARIENFELD	610610	Hemocitómetro
Leica TCS_SP5_MO	Leica	Sin/número	Microscopía confocal láser con Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/software BIN
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000 Medio de	montaje para fluorescencia
4',6-diamino-2-fenilindol (Dapi)	SIGMA	D-9542	0.05 mM concentración final
Albúmina sérica bovina (BSA)	US Biological	A-1310	0.5%  concentración final para solución de bloqueo