Aislamiento rápido y purificación de mitocondrias para el trasplante por disociación de tejidos y filtración diferencial

Resumen

Un método para el rápido aislamiento de las mitocondrias a partir de biopsias de tejido de mamíferos se describe. Preparaciones de hígado de rata o de músculo esquelético se homogeneizaron con un disociador tejido comercial y mitocondrias se aislaron por filtración a través de filtros diferencial de malla de nylon. Tiempo de aislamiento mitocondrial es <30 min frente a 60 - 100 min utilizando métodos alternativos.

Resumen

Métodos de aislamiento mitocondriales descritos previamente utilizando centrifugación diferencial y / o centrifugación en gradiente de Ficoll requieren de 60 a 100 minutos para completar. Se describe un método para el rápido aislamiento de las mitocondrias a partir de biopsias de mamíferos usando un disociador tejido comercial y filtración diferencial. En este protocolo, homogeneización manual se reemplaza con ciclo de homogeneización estandarizada del disociador tejido. Esto permite uniforme y homogeneización coherente de tejido que no se logra fácilmente con homogeneización manual. Después de la disociación del tejido, el homogeneizado se filtró a través de filtros de malla de nylon, que eliminan etapas de centrifugación repetitivas. Como resultado, el aislamiento mitocondrial se puede realizar en menos de 30 min. Este protocolo de aislamiento rinde aproximadamente 2 x 10 ¹⁰ mitocondrias competentes viables y respiración de 0,18 ± 0,04 g (peso húmedo) muestra de tejido.

Introducción

Las mitocondrias existen en todas las células del cuerpo excepto las células rojas de la sangre y están involucrados en un gran número de importantes procesos celulares y metabólicos ^1-4. Debido a estas muchas funciones, el daño mitocondrial puede tener efectos perjudiciales ^3. Con el fin de investigar la función mitocondrial y la disfunción mitocondrial varios métodos de aislamiento se han descrito. Las cuentas publicadas tempranas de fecha aislamiento mitocondrial a la década de 1940 ^5-8. El primer intento documentado demostró aislamiento mitocondrial moliendo el tejido hepático en un mortero, seguido de centrifugación en una soluci....

Protocolo

Preparación

1. Preparar 1 M K-HEPES Stock Solution (ajustar el pH a 7,2 con KOH).
2. Preparar 0,5 M K-EGTA Stock Solution (ajustar el pH a 8,0 con KOH).
3. Preparar 1 M KH ₂ PO ₄ Stock Solution.
4. Preparar 1 M de _MgCl2 Stock Solution.
5. Preparar tampón de homogeneización (pH 7,2) de sacarosa 300 mM, 10 mM K-HEPES, y 1 mM de K-EGTA. Almacenar a 4 ° C.
6. Preparar sacarosa 250 mM Respiración Buffer, 2 mM KH ₂ PO _4, 10 mM _MgCl2, 20 mM K-HEPES buffer (pH 7.2) y 0,5 mM K-EGTA (pH 8,0). Almacenar a 4 ° C.
7. Preparar 10x PBS Solución Stock disolviendo 80 g ....

Resultados

Una figura que describe los pasos de procedimiento en el aislamiento de las mitocondrias utilizando la disociación de tejido y filtración diferencial se muestra en la Figura 1. Duración total del procedimiento es de menos de 30 min.

Las muestras de tejido se obtuvieron usando un punzón de biopsia de 6 mm. Peso del tejido fue de 0,18 ± 0,04 g (peso húmedo). El número de mitocondrias aisladas como se determina por recuento de tamaño de partícula fue de 2,4 x 10 x ¹⁰.......

Discusión

Para aislar con éxito las mitocondrias utilizando este protocolo es esencial para mantener todas las soluciones y las muestras de tejido en hielo para preservar la viabilidad mitocondrial. Incluso cuando se mantiene en hielo, mitocondrias aisladas exhibirán una disminución en la actividad funcional en el tiempo ^19. Recomendamos que todas las soluciones y adiciones serán pre-preparados. Nos pre-pesar y almacenar Subtilisina A en 4 mg alícuotas de 1,5 ml tubos de microcentrífuga y almacenar a -20 ° C. Del mismo.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sacarosa	Sigma Aldrich	84100
HEPES	Sigma Aldrich	H4034
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Substilsin A	Sigma Aldrich	P5380
BSA	Sigma Aldrich	A7906
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5379
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266
NaCl	Sigma Aldrich	S6191
KCl	Fisher Scientific	P2173
Na2HPO4	Fisher Scientific	S374
ATPlite >	Perkin Elmer
50 ml Tubos Cónicos	BD	352098
40 μ m Filtros de nylon	BD	352340
GentleMACS Tubo C	Miltenyl Biotech	120-005-331
1,5 ml Tubo Eppendorf	Fisher Scientific	05-408-129
Punzón de biopsia de 6 mm	Miltex	33-36
10 μ m Pluristrainer	Pluriselect	43-500-10-03
Centrífuga Eppendorf 5415C	Marshall Scientific	EP-5415C
Disociador GentleMACS	Miltenyl Biotech	130-093-235
Placas de 96 pocillos, tratadas para cultivo de tejidos	VWR	82050-732
Rotomax 120 Agitador orbital	Heidolph	544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode   Lector de microplacas	BioTek
Multisizer 4 Contador	Beckman Coulter	A63076
Sistema Oxytherm	Hansatech Instruments
Hemacitómetro	Fisher Scientific	267110

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