Microdisección se ha empleado ampliamente para el examen de ADN, ARN, y proteínas dentro del tejido. Microscopía de captura láser (LCM) es el método más comúnmente utilizado, pero una nueva técnica de fresado, mesodissection, es recientemente disponible. Demostramos la extracción de RNA de mesodissected formalina parafina fijo diapositivas de tejidos embebidos de granulomas de Mycobacterium tuberculosis.
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Artículo de método
Un nuevo enfoque para la recuperación Microdissection
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Resumen
Resumen
Microdissection se ha utilizado para el examen de los tejidos en el ADN, el ARN y los niveles de proteína durante más de una década. Microscopía de captura láser (LCM) es la técnica de microdisección más común usado hoy en día. En esta técnica, se utiliza un láser para fundir focalmente una membrana termoplástica que se superpone a una sección de tejido deshidratado 1. La sección de tejido de material compuesto entonces se levanta y se separa de la membrana. Aunque esta técnica puede utilizarse con éxito para el examen del tejido, que consume tiempo y es caro. Además, la finalización con éxito de los procedimientos que utilizan esta técnica requiere el uso de un láser, lo que limita su uso. Un nuevo enfoque de microdisección más asequible y práctica llamada mesodissection es una posible solución a las trampas de la LCM. Esta técnica emplea el sistema de MESO-1/MeSectr moler el tejido deseado a partir de una muestra de tejido montada deslizante, mientras que al mismo tiempo la dispensación y aspiración de fluido para recuperar la muestra de tejido deseada enun poco molino de consumible. Antes de que comience el proceso de disección, el usuario alinea la parafina fijado en formol incorporado (FFPE) deslice con hematoxilina y eosina manchado (H & E) Tobogán de referencia. A partir de entonces, el operador anota el área de la disección deseada y procede a diseccionar el segmento apropiado. El programa genera una imagen archivada de la disección. La principal ventaja de mesodissection es la corta duración necesaria para diseccionar una diapositiva, teniendo un promedio de diez minutos de configurar para probar la generación en este experimento. Además, el sistema es significativamente más rentable y fácil de usar. Una ligera desventaja es que no es tan precisa como la microscopía de captura por láser. En este artículo se demuestra cómo mesodissection puede utilizarse para extraer el ARN a partir de diapositivas de granulomas FFPE causadas por Mycobacterium tuberculosis (Mtb).
Introducción
Las muestras han sido tradicionalmente microdissected manualmente, ya sea todo el tejido o diapositivas utilizando una aguja y bisturí. Para ello se requiere una clara separación entre la sección de tejido de interés y los tejidos circundantes secciones 2. Con los avances actuales en la tecnología de perfil molecular, ha habido una creciente necesidad de evaluar tejido a nivel celular. Debido a las limitaciones de microdisección manual, incluyendo técnicas de LCM se establecieron para permitir una mayor precisión de aislamiento. Esta técnica permite al investigador para aislar poblaciones de células específicas de diversos tipos de células y de diapositivas, que luego se pueden utilizar para ensayos de aguas abajo, tales como perfiles de expresión génica. Aunque es muy eficaz para los ensayos posteriores, LCM no está exenta de limitaciones. En primer lugar, LCM es un proceso costoso y consume mucho tiempo. Además, debido a la naturaleza inestable de ARN, que es a menudo un reto para obtener ARN de alta calidad a partir de muestras LCM 2. Debido a la disadvantages de LCM, siguen siendo necesarios nuevos avances en la tecnología de microdisección para hacerlo más accesible a un mayor número de investigadores de una manera sensible asequible y tiempo.
Uno de estos avances en la tecnología de microdisección ahora disponible es una técnica conocida como mesodissection. En esta técnica se utiliza una máquina para moler la sección de tejido anotada de interés y aspira en una fresa de consumibles 3. A continuación, esta muestra puede ser aspirado por un tubo de recogida y se utiliza para aplicaciones posteriores. Las ventajas de este sistema son que es significativamente menos costoso y sensible al tiempo. En nuestra experiencia, el sistema permite la disección de una sección de tejido granuloma pulmonar en diez minutos. Por otro lado, LCM tradicional requeriría probablemente horas para completar el proceso. El sistema permite al operador cargar un portaobjetos de referencia a utilizar como una comparación, así como herramienta para la anotación. Además se genera un informe esbozando ªárea e de la diapositiva que se ha diseccionado. Hay dos desventajas principales de mesodissection. Aunque es eficaz en la extracción de varias celdas, es difícil aislar una sola célula. Además, la precisión de la imagen generada no es tan clara como si el uso de otros microscopios de imagen.
La tuberculosis (TB) es una importante causa de muerte de la enfermedad infecciosa de la humanidad en todo el mundo y es consecuencia de la infección por Mtb. En la mayoría de los individuos expuestos a aerosoles de Mtb, la infección está latente limitado. En por lo menos 10 millones de personas anualmente, da lugar a la enfermedad de la TB activa 4. Durante la infección latente, Mtb está contenida dentro de las lesiones pulmonares patológicos conocidos como granulomas. Por lo tanto, se ha argumentado que el resultado de la infección por Mtb se decide a nivel del granuloma 5.
Aquí demostramos cómo mesodissection se puede utilizar para microdissect granulomas causados por Mtb. Las diapositivas utilizadasson de FFPE tejido pulmonar de los macacos rhesus infectados. Para el propósito de esta demostración, vamos a diseccionar granulomas en su totalidad. También demuestran que el ARN se puede extraer de los tejidos recuperados. Esta técnica se puede aplicar a muestras de tejido de varios otros especímenes y luego se usa para una variedad de ensayos de aguas abajo.
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Protocolo
1. Calibrar Instrumento Mesodissection con 2ID Imaging Software
El software de imágenes 2ID se conoce como el software o el programa para el resto de este artículo. Este paso es necesario para seguir correctamente la imagen, así como alinear varios marcos de diapositivas.
- Encienda el instrumento y el ordenador.
- Abra el software y seleccione "instrumento de calibración".
- Calibrar viajes etapa con el joystick. Mueva el escenario a la posición superior izquierda. Pulse el botón "set" en el paso 1 en el programa.
- Mueva el escenario para bajar la posición correcta. Pulse el botón "set" en el paso 2 en el programa.
- Calibrar la aspiración pulsando primero "Z-button" para recaudar conjunto de la cabeza. Pulse el botón "pulso aspirado" y el botón "disección" en la palanca de mando hasta que la varilla de control de émbolo alcanza la primera posición. Pulse el botón "set" en el paso 3 del programa.
- Pulse el botón "reinicio aspirado y# 8221; botón. Una vez que el émbolo se detiene en la posición de la prensa "conjunto" de abajo en el paso 4.
- Haga clic en la pestaña de "escala".
- Coloque la regla de calibración en el lado blanco.
- Centrarse microscopio si es necesario.
- Dibuja una línea entre las dos barras de escala a través del ratón.
- Introduzca la distancia en el recuadro paso 2 botón. Presione "compute" etiquetados.
- Haga clic en la pestaña de "punto de mira". Gire la velocidad del motor a 1.
- Inserte xScisor en el conjunto de cabeza. Conjunto de la cabeza inferior en el eje z posición lista pulsando el botón "eje Z". NOTA: El conjunto de la cabeza es la gran estructura en la parte superior del instrumento de disección. El xScisor se conoce como un poco molino de consumible para el resto de este artículo.
- Haga clic en el botón "disección de participar" en la palanca de mando. NOTA: Este botón se encuentra en la parte superior de la palanca de mando.
- Definir centro de rotación visual. Para ello, mueva centro del punto de mira sobre el centro de giro con definird parámetro en el paso 1 del programa. Use la flechas arriba y abajo en la "x" y los bares "eje y" para ajustar los píxeles para alinear en forma de cruz. Haga clic en la pestaña de "hecho".
- Haga clic en el icono de "casa". NOTA: Esto se representa una imagen de la casa ubicada en la esquina superior derecha cerca.
2. Crear Imagen de referencia
- Coloque H & E diapositivas en el escenario. Coloque la tapa opaca en la parte superior de la diapositiva. Conducir el instrumento moviendo el joystick hacia la zona deseada de la corredera H & E. Guarda la imagen generada. NOTA: Cualquiera de la pestaña "Referencia de captura" o pestaña "diseccionar" se puede utilizar para completar este paso.
3. Alinee Paño para Disección
- Haga clic en la opción "diseccionar tejido" en la pantalla principal.
- Rellene el "operador", "número de la disección de la adhesión", "el número de acceso de referencia", "número de código de barras xScisor," & #8220; disección número de lote fluida "," Tamaño xScisor "y" Descripción "en la pestaña" Configuración ".
- Haga clic en la pestaña de "encontrar el tejido".
- Importación de imágenes de referencia previamente guardados.
- Coloque una diapositiva FFPE sin manchas de 5 micras de espesor en el escenario. Mueva etapa a la misma zona que el representado en la imagen de referencia. Haga clic en la pestaña "Insertar imagen".
- Haga clic en la pestaña "align". Usa el ratón y las flechas asociadas para alinear la imagen de referencia a la imagen sin mancha.
4. Anotar Slide
- Haga clic en la pestaña de "anotar".
- Utilice el ratón para dibujar un círculo alrededor del área deseada de la diapositiva que se microdissected.
5. Cargue consumible Mill Bit
- Rellene consumible poco molino con tampón deseado, aquí búfer PKD, tirando del émbolo hacia arriba y hacia abajo en un movimiento fluido varias veces. Asegúrese de excluir el aireburbujas.
- Levante el eje Z por "botón del eje Z" presionando.
- Cargar consumible poco molino en la máquina. Para ello, deslizando la fresa de consumibles en la parte superior de la máquina para que la línea blanca en las líneas de instrumentos con la línea de negro en la fresa de los consumibles. Pulse el botón de "reinicio de aspiración" para permitir que el émbolo sea bajado a la posición correcta. NOTA: Debe ser fácil para deslizar la fresa de los consumibles. Si no es así, asegúrese de que los indicadores estén alineados correctamente.
- Bajo el eje Z pulsando de nuevo el botón "eje Z".
6. Disección de tejidos (Figura 4)
- Abra la pestaña "diseccionar".
- Gire a velocidades de motor y aspiración a 1.
- Marque la casilla "espectáculo de seguimiento". Nota: Esto permite al usuario visualizar el área diseccionado durante el proceso de disección.
- Una vez listo para diseccionar, continúe sosteniendo el botón "participar", así como "el aspirado y #8221; botón mientras se mueve la palanca de mando en una dirección en sentido antihorario para diseccionar el tejido.
- Continuar para diseccionar en una dirección hacia la izquierda hasta el aspirado es pestaña "lleno" se vuelve rojo.
7. Vaciar y quitar consumible Mill Bit
- Coloque un tubo de microcentrífuga de 0,5 l bajo la punta de la fresa de los consumibles.
- Varilla Press control "aspiración" rápidamente para expulsar la muestra en tubo de microcentrífuga.
- Pulse con el aumento de la fuerza para expulsar usado fresa de consumible.
- Enjuague fragmento de tejido tirando del émbolo hacia atrás. Empuje el émbolo hacia adelante para expresar la muestra restante en consumibles poco molino. El fragmento de tejido será ahora contenido dentro del tubo de microcentrífuga.
8. Muestra Lyse con proteinasa K digestión por un tratamiento térmico
- Añadir 70 l de TE pH 8,5 que contiene 5 g de proteinasa K a la muestra de tejido recuperada.
- Coloque la muestra en programable calentador de agitador.
- La digestión completa usando programable calentador-agitador a la siguiente configuración: 60 ˚ C durante 30 minutos a 1500 rpm; 82 ˚ C durante 15 min a 1500 rpm; y 25 ˚ C durante 1 minuto a 450 rpm. La muestra está ahora lista para aplicaciones posteriores.
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Resultados
El protocolo mencionado se muestra cómo utilizar una nueva técnica mesodissection para extraer el ARN a partir de diapositivas de tejidos FFPE. La eficacia de este protocolo se muestra a través de diapositivas FFPE de granulomas pulmonares de NHP infectados con Mtb en varias fases infecciosas. Figuras 1-3 son imágenes del instrumento. Figura 4 representa cómo se produce el proceso de disección y la imagen resultante generada por el software. Tabla 1 muestra los...
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Discusión
Mesodissection es una técnica que puede aplicarse a la extracción de RNA a partir de diapositivas de las lesiones patológicas causadas por una amplia gama de patógenos. Es una necesidad que el usuario sigue el imagen y se alinea la imagen correctamente. Para lograr esto, el instrumento debe ser calibrado siguiendo las instrucciones en el software de imágenes. Cuando la disección, si la diapositiva y área de interés siendo diseccionado no se alinean, el usuario debe volver a calibrar el instrumento. Otro paso crítico en ...
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Divulgaciones
Los autores dan a conocer que no hay intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a las siguientes NIH premios / sub-premios para el apoyo de esta investigación: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, y P51OD011104.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Otros tamaños disponibles | |
| THOR | AvanSci Bio | Calentador-agitador programable | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy Kit de extracción FFPE | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Kit de purificación | Qiagen | 28104 |
Referencias
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).
- Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 7/01/2014. Citeable Link.
The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal
