Microdisección se ha empleado ampliamente para el examen de ADN, ARN, y proteínas dentro del tejido. Microscopía de captura láser (LCM) es el método más comúnmente utilizado, pero una nueva técnica de fresado, mesodissection, es recientemente disponible. Demostramos la extracción de RNA de mesodissected formalina parafina fijo diapositivas de tejidos embebidos de granulomas de Mycobacterium tuberculosis.
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Artículo de método
Un nuevo enfoque para la recuperación Microdissection
En este artículo
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Resumen
Resumen
Microdissection se ha utilizado para el examen de los tejidos en el ADN, el ARN y los niveles de proteína durante más de una década. Microscopía de captura láser (LCM) es la técnica de microdisección más común usado hoy en día. En esta técnica, se utiliza un láser para fundir focalmente una membrana termoplástica que se superpone a una sección de tejido deshidratado 1. La sección de tejido de material compuesto entonces se levanta y se separa de la membrana. Aunque esta técnica puede utilizarse con éxito para el examen del tejido, que consume tiempo y es caro. Además, la finalización con éxito de los procedimientos que utilizan esta técnica requiere el uso de un láser, lo que limita su uso. Un nuevo enfoque de microdisección más asequible y práctica llamada mesodissection es una posible solución a las trampas de la LCM. Esta técnica emplea el sistema de MESO-1/MeSectr moler el tejido deseado a partir de una muestra de tejido montada deslizante, mientras que al mismo tiempo la dispensación y aspiración de fluido para recuperar la muestra de tejido deseada enun poco molino de consumible. Antes de que comience el proceso de disección, el usuario alinea la parafina fijado en formol incorporado (FFPE) deslice con hematoxilina y eosina manchado (H & E) Tobogán de referencia. A partir de entonces, el operador anota el área de la disección deseada y procede a diseccionar el segmento apropiado. El programa genera una imagen archivada de la disección. La principal ventaja de mesodissection es la corta duración necesaria para diseccionar una diapositiva, teniendo un promedio de diez minutos de configurar para probar la generación en este experimento. Además, el sistema es significativamente más rentable y fácil de usar. Una ligera desventaja es que no es tan precisa como la microscopía de captura por láser. En este artículo se demuestra cómo mesodissection puede utilizarse para extraer el ARN a partir de diapositivas de granulomas FFPE causadas por Mycobacterium tuberculosis (Mtb).
Introducción
Las muestras han sido tradicionalmente microdissected manualmente, ya sea todo el tejido o diapositivas utilizando una aguja y bisturí. Para ello se requiere una clara separación entre la sección de tejido de interés y los tejidos circundantes secciones 2. Con los avances actuales en la tecnología de perfil molecular, ha habido una creciente necesidad de evaluar tejido a nivel celular. Debido a las limitaciones de microdisección manual, incluyendo técnicas de LCM se establecieron para permitir una mayor precisión de aislamiento. Esta técnica permite al investigador para aislar poblaciones de células específicas de diversos tipos de células y de diapositiva....
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Protocolo
1. Calibrar Instrumento Mesodissection con 2ID Imaging Software
El software de imágenes 2ID se conoce como el software o el programa para el resto de este artículo. Este paso es necesario para seguir correctamente la imagen, así como alinear varios marcos de diapositivas.
- Encienda el instrumento y el ordenador.
- Abra el software y seleccione "instrumento de calibración".
- Calibrar viajes etapa con el joystick. Mueva el escenario a la posición superior izquierda. Pulse el botón "set" en el paso 1 en el programa.
- Mueva el escenario para bajar la posición correcta. Pulse el botón "set" en el paso 2 en e....
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Resultados
El protocolo mencionado se muestra cómo utilizar una nueva técnica mesodissection para extraer el ARN a partir de diapositivas de tejidos FFPE. La eficacia de este protocolo se muestra a través de diapositivas FFPE de granulomas pulmonares de NHP infectados con Mtb en varias fases infecciosas. Figuras 1-3 son imágenes del instrumento. Figura 4 representa cómo se produce el proceso de disección y la imagen resultante generada por el software. Tabla 1 muestra los.......
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Discusión
Mesodissection es una técnica que puede aplicarse a la extracción de RNA a partir de diapositivas de las lesiones patológicas causadas por una amplia gama de patógenos. Es una necesidad que el usuario sigue el imagen y se alinea la imagen correctamente. Para lograr esto, el instrumento debe ser calibrado siguiendo las instrucciones en el software de imágenes. Cuando la disección, si la diapositiva y área de interés siendo diseccionado no se alinean, el usuario debe volver a calibrar el instrumento. Otro paso crítico en .......
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Divulgaciones
Los autores dan a conocer que no hay intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a las siguientes NIH premios / sub-premios para el apoyo de esta investigación: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, y P51OD011104.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Otros tamaños disponibles | |
| THOR | AvanSci Bio | Calentador-agitador programable | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy Kit de extracción FFPE | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Kit de purificación | Qiagen | 28104 |
Referencias
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer spe....
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 7/01/2014. Citeable Link.
The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal
