Se describen las técnicas básicas y los refinamientos de procesamiento de congelación-fractura de las muestras y los nanomateriales biológicos para el examen por microscopía electrónica de transmisión. Esta técnica es un método preferido para revelar características ultraestructurales y especializaciones de las membranas biológicas y para la obtención de datos de dimensiones y espaciales a nivel ultraestructural en ciencias de los materiales y productos de la nanotecnología.
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Artículo de método
Fundamental elementos técnicos de Freeze-fractura / Freeze-grabado en Biológica Microscopía Electrónica
En este artículo
Resumen
Resumen
Criofractura / congelación grabado describe un proceso por el cual las muestras, por lo general biológico o nanomaterial en la naturaleza, se congelan, fracturar y replicado para generar un carbono / platino "fundido" destinada a examen mediante microscopía electrónica de transmisión. Las muestras se someten a la tasa de congelación ultrarrápidos, a menudo en presencia de agentes crioprotectores para limitar la formación de cristales de hielo, con posterior fractura de la muestra en nitrógeno líquido enfría temperaturas bajo alto vacío. La superficie fracturada resultante se replica y se estabilizó por evaporación de carbono y platino desde un ángulo que confiere detalle superficie tridimensional para el reparto. Esta técnica ha demostrado ser particularmente instructivo para la investigación de las membranas celulares y sus especializaciones y ha contribuido considerablemente a la comprensión de la forma celular para la función celular relacionada. En este informe, examinamos los requisitos de instrumentos y protocolo técnico para la realización decongelación-fractura, la nomenclatura y las características de los planos de fractura asociado, las variaciones en el procedimiento convencional, y criterios para la interpretación de las imágenes de congelación de fractura. Esta técnica se ha utilizado ampliamente para la investigación ultraestructural en muchas áreas de la biología celular y mantiene la promesa como una técnica de imagen molecular emergente de la nanotecnología, y los estudios de la ciencia de materiales.
Introducción
El concepto y la aplicación práctica de procesamiento de congelación-fractura de las muestras biológicas se introdujo por Steere 1 más de la mitad de hace un siglo. El aparato temprana apropiado componentes dispares en una unidad autónoma de trabajo 1. El aparato original fue modificado y refinado en instrumentos disponibles comercialmente con el fin de acomodar la necesidad crítica para la manipulación a distancia, el mantenimiento de alto vacío, y la evaporación de carbono y metales para producir una réplica adecuado para el examen por microscopía electrónica de transmisión (Figura 1 y la Figura 2).
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Protocolo
1 Preparación de muestras biológicas para criofractura / Freeze-grabado
- Utilice una formulación convencional fijador EM tales como glutaraldehído al 2% + 2% de paraformaldehído en tampón de fosfato 0,1 M durante 1 hora. para llevar a cabo la fijación primaria de los tejidos biológicos. NOTA: Si bien puede ser deseable para congelar algunos tipos de especímenes sin fijación previa, patógenos transmitidos por la sangre precauciones universales exigen fijación apropiada cuando la muestra se compone de tejido humano.
- Después de la fijación primaria, enjuagar la muestra en el mismo tampón suplementado con 0,2 M de sacarosa por no más de 1 hr.
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Resultados
La premisa fundamental de la interpretación de imágenes de criofractura es que los planos de fractura pasan a través de la bicapa lipídica de las membranas que confieren dos caras de fractura, llamada por convención el PF-cara (plasma fractura-cara) y EF-cara (fractura-cara extracelular) (Figura 3). El PF-cara es la mitad de la bicapa lipídica de la membrana adyacente al citoplasma de la célula y el EF-cara es la mitad de la bicapa lipídica de la membrana adyacente al medio extracelular. La técnica de c.......
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Discusión
En los años siguientes a su introducción y disponibilidad comercial, congelación-fractura / procedimientos de grabado fueron ampliamente utilizados para investigaciones de la estructura de la membrana biológica. De hecho, las mejores perspectivas de algunas de las especializaciones estructurales de las membranas se han obtenido en las preparaciones de congelación-fractura / Etch. Estos estudios no sólo han contribuido a la comprensión de la organización estructural de las membranas, pero también proporcionaron una visió.......
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Divulgaciones
El autor no tiene nada que revelar.
Agradecimientos
Esta presentación fue respaldada por un Premio al Innovador Clínico para JLC del Instituto de Investigación Médica de Auxiliares de Vuelo y por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos. Aunque la investigación descrita en este artículo ha sido financiada total o parcialmente por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos a través de un Acuerdo de Cooperación CR83346301 con el Centro de Medicina Ambiental, Asma y Biología Pulmonar de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, no ha sido sometida a la revisión requerida por pares y políticas de la Agencia. y, por lo tanto, no refleja necesariamente las opiniones de la Agencia y ....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Balzers Planta de congelación-fractura/congelación-grabado | Balzers | BAF400T | |
| Tampones estándar varios | proveedores | ||
| Fijadores de aldehído estándar varios | proveedores | ||
| Dicromato de sodio | varios proveedores | ||
| Ácido sulfúrico | varios proveedores | ||
| Suministros desechables para evaporación de platino/carbono | Technotrade International | ||
| Nitrógeno líquido | varios proveedores | ||
| Propano | varios proveedores | ||
| Suministros desechables para microscopía electrónica | Ciencias de la microscopía electrónica Microscopio electrónico de | ||
| transmisión | Carl Zeiss Inc. |
Referencias
- Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).
- Pinto da Silva, P., Branton, D. Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane mar....
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Reimpresiones y permisos
