extracción de ADN de la saliva puede proporcionar una fuente fácilmente disponible de ADN de alto peso molecular, con poca o ninguna degradación/fragmentación. Este protocolo proporciona parámetros optimizados para la recolección/almacenamiento de saliva y la extracción de ADN para que sean de calidad y cantidad suficientes para ensayos de ADN posteriores con requisitos de alta calidad.
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Artículo de método
Recolección y extracción de ADN de la saliva de Next Generation Sequencing
En este artículo
Resumen
Resumen
La fuente preferida de ADN en la investigación genética humana es la sangre, o líneas celulares derivadas de la sangre, ya que estas fuentes producen grandes cantidades de ADN de alta calidad. Sin embargo, la extracción de ADN de la saliva puede producir ADN de alta calidad con poca o ninguna degradación/fragmentación que es adecuado para una variedad de ensayos de ADN sin el gasto de un flebotomista e incluso se puede adquirir por correo. Sin embargo, en la actualidad, no se han presentado en la literatura protocolos de recolección/extracción de ADN en saliva para la secuenciación de próxima generación. Este protocolo optimiza los parámetros de recolección/almacenamiento de saliva y extracción de ADN para que sean de calidad y cantidad suficientes para ensayos de ADN con los más altos estándares, incluido el genotipado de microarrays y la secuenciación de próxima generación.
Introducción
La obtención de ADN de alta calidad para los estudios genéticos humanos es esencial en el proceso de descubrimiento de genes de enfermedades. Blood, aunque requiere un procedimiento invasivo y también de ser más caro que la recolección de saliva, se ve favorecida por la creación de líneas celulares inmortalizadas como una fuente infinita de ADN, o iPSCs para estudios funcionales, y algunas veces de ADN de sangre se utiliza cuando las líneas celulares no están disponibles. Sin embargo, la obtención de la sangre requiere un flebotomista capacitado y la sangre tiene una vida media más corta que la saliva 1. ADN de la saliva es menos costoso y más fácil de obtener, ya que puede ser recogida y enviada a través del correo electrónico sin la necesidad de un flebotomista, aumentando de este modo posibles piscinas temáticas mucho más allá de la zona de influencia de los hospitales y los laboratorios 2. Estudio de inscripción puede ser mejorado cuando los sujetos tienen la opción de dar una muestra de saliva en lugar de sangre 3, 4. Las preocupaciones sobre la cantidad y calidad del ADN de la saliva pueden haber limitado su nos generalizadae pesar de numerosos estudios estudios recientes que demuestran la idoneidad de la saliva total, con un promedio de 4,3 x 10 5 células por mililitro, para pruebas de ADN a través de los métodos de hisopos bucales mayores que no obtuvieron cantidades significativas de saliva 2, 3, 4, 5, 6. Mientras que existe una literatura modesta que muestra la idoneidad de ADN derivado de la saliva entera para aplicaciones de genotipificación incluyendo métodos basados en microarrays 8, 9, la secuenciación de próxima generación 10, ningún estudio ha examinado (NGS). El objetivo de la optimización de este protocolo de extracción de ADN de la saliva entera era maximizar la cantidad y calidad de las aplicaciones de la genética en una manera rentable que se implementa fácilmente en laboratorios con reactivos y consumibles comunes.
Extracción de ADN de la saliva requiere de varios procedimientos: 1) la recolección y almacenamiento, 2) la lisis celular, 3) tratamiento con RNasa, 4) la precipitación de proteínas, 5) la precipitación con etanol, 6) rehidratación ADN. La solución de ADN de Estabilización de Buffer, se describe2 anteriormente, las funciones adecuadamente sin alteración. No se hizo ningún intento de optimizar el tratamiento con RNasa y medidas de rehidratación de ADN. Para cada paso restante, se identificaron diversas variables que pueden afectar el rendimiento. Cada variable fue manipulado de forma individual y la mejora en el rendimiento y la calidad se evaluó estadísticamente. Para las variables que se mostraron para mejorar el rendimiento y / o calidad del ADN, se incluyeron los valores óptimos en el protocolo final.
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Protocolo
NOTA: Antes de proporcionar muestras de saliva todos los sujetos dieron su consentimiento informado se ajuste a las directrices para el tratamiento de los sujetos humanos en Hospital Nacional de Niños.
1. Saliva Collection y Almacenamiento
- Antes de la toma de saliva, asegúrese de que la boca del sujeto es libre de alimentos u otras sustancias extrañas al tener el tema enjuague su boca con agua y evitando comer o beber durante 30 minutos antes de recoger la muestra.
- Abrir un tubo de centrífuga de 15 ml con 2,5 ml de tampón de ADN estabilización 2 asegurándose de no tocar la parte interior de la tapa o tubo, y haga que el sujeto escupió 2,5 ml de saliva en la solución tampón. Nota: Recogida de más de 2,5 ml de saliva puede conducir a la degradación de la muestra a partir de una relación insuficiente de la muestra a un tampón de estabilización de ADN. Recopilación demasiado poco de saliva reducirá los rendimientos esperados de protocolo. Para evaluar los volúmenes de recogida, utilice los gradientes numerados en el lado de tél tubo.
- Reemplace la tapa y mezclar por inversión hasta que se homogeneiza la mezcla. Agitación vigorosa no es necesario. Almacenar las muestras a temperatura ambiente para el almacenamiento a corto plazo o 4 ° C para el almacenamiento a largo plazo (> 3 meses).
2. Preparativos iniciales y lisis celular
- Antes de iniciar la extracción, calentar un baño de agua a 37 ° C, y preparar un cubo de hielo. Se necesitan tres tubos de 15 ml de centrífuga cónicos para cada muestra extraída. Los tres tubos se utilizan para mantener la célula y la proteína de pellets, la final gDNA extraídos, y los sobrenadantes isopropanol y etanol.
- Recuperar las muestras de almacenamiento, e invertir las muestras varias veces luego vórtice a velocidad media durante 15 segundos.
- Dispense 2.5 ml de muestra en un tubo de centrífuga de 15 ml limpio, y añadir 5 ml de solución de lisis celular. Mezclar la muestra 50 veces por inversión, e incubar a TA durante 30 min.
Remoción 3. ARN
- Añadir 40 l de RNasa A de Solution a 100 mg / ml, y se incuba a 37 ° C durante 15 min.
- Sacar la muestra del baño a 37 ° C y enfriar en hielo durante 3 min.
- Después de la incubación RNasa A, aumentar la temperatura del baño de agua a 65 ° C para la etapa de rehidratación ADN del protocolo.
4. Proteína y extracción de lípidos
- Añadir 50 l de solución de proteinasa K a 20 mg / ml, mezclar varias veces por inversión, y se incuba a temperatura ambiente durante un mínimo de 30 min. Nota: Este es un posible punto de pausa para el protocolo. Después de la adición de la solución de proteinasa K, la muestra puede ser almacenada a 4 ° C hasta la extracción puede ser completada. El almacenamiento a 4 ° C durante un máximo de 24 horas no ha demostrado tener un efecto significativo en los rendimientos de extracción o la calidad del ADN. El almacenamiento a largo plazo en esta etapa no ha sido evaluada.
- Añadir 1,7 ml de solución de Precipitación de Proteínas y agitar vigorosamente durante 20 segundos a alta velocidad, y el lugar en hielo durante 10 min.
- Una vez que las muestras se han enfriado en hielo durante 10 min, se centrifuga durante 10 min a 3.000 xg y 4 ° C. Las proteínas precipitadas deben formar una bolita apretada para continuar. Si la pastilla no es apretado o la solución es aún turbia, las muestras se pueden enfriar en hielo durante 5 min más y centrifugación repetida. Las muestras deben mantenerse en hielo para asegurar una bolita apretada.
5. Aislamiento y purificación de ADNg
- En un tubo de centrífuga de 15 ml limpio, pipeta de 5 ml de isopropanol y 8 l de solución de glucógeno puro a 20 mg / ml.
- Verter el sobrenadante que contiene el ADNg de la etapa 4.3 en el tubo que contiene la solución de isopropanol y el glucógeno, dejando atrás el sedimento de proteína precipitada. Una vez que el sobrenadante se ha añadido, mezclar suavemente la muestra 50 veces por inversión y centrifugar durante 30 minutos a 3.000 xg y 4 ° C.
- Verter lentamente el sobrenadante en un tubo de 15 ml limpio. Después de la eliminación del sobrenadante, añadir 1 ml de etanol al 70% alavar el pellet oscilando lentamente y moviendo suavemente el etanol sobre el sedimento precipitado varias veces. Conservar el etanol en el tubo.
- Después del lavado inicial, centrifugar la muestra durante 1 min a 2.000 xg y 20 ° C. Esta etapa de centrifugación se puede hacer en cualquiera de 4 ° C o 20 ° C. Ningún efecto significativo de la temperatura se ha demostrado para este paso.
- Después del lavado y la centrifugación inicial de la pastilla, verter lentamente el lavado con etanol del tubo y desechar, a continuación, realizar un segundo lavado repitiendo los pasos 5.3 y 5.4.
- Después de la eliminación del sobrenadante del segundo lavado, permitir que el pellet se seque al aire durante 15 min.
- Si la muestra no se ha secado completamente, secar al aire durante otros 15 min.
6. rehidratación de gDNA
- Una vez que la muestra se ha secado, añadir 300 l de Tris-EDTA para rehidratar el sedimento gDNA seca.
- Vortex la muestra durante 5 segundos a velocidad media y el lugar en un65 ° C baño de agua caliente durante 1 hora.
- Retire las muestras del baño de agua y se incuban O / N a temperatura ambiente.
NOTA: Todos los productos y reactivos utilizados se enumeran en la Tabla de materiales, así como la Tabla 4.
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Resultados
Para determinar los parámetros óptimos para la extracción de ADN se realizó una serie de extracciones de ADN emparejados. Una sola muestra de saliva se dividió y cada porción probado con uno de dos valores posibles para una variable dada. Se realizaron al menos ocho repeticiones de cada prueba de pares (por ejemplo, una sola muestra de saliva se dividió en alícuotas para probar la extracción con y sin inicial 50 ° C de incubación). Optimización se basó en cuatro métricas estándar: rendimiento total del ADN, el ...
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Discusión
El presente procedimiento es un protocolo de extracción de ADN optimizada que ha mejorado considerablemente el rendimiento de ADN de alto peso molecular en comparación con métodos estándar, sin comprometer la calidad del ADN. El paso crítico con el mayor efecto sobre el rendimiento más fue paso 5.2, que incluye una etapa de centrifugación ya durante la precipitación de etanol que cualquier protocolo publicado revisado aquí, excepto que no estaba ampliamente distribuido 11. No se detectaron cambios en la calid...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por un R01 de los Institutos Nacionales de Salud (DC009453 apoyo a CWB).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 15 ml Tubos de centrífuga | Fisher | 12-565-268 | |
| Solución de lisis celular | Qiagen | 158908 | |
| proteinasa K | Sigma | P6556 | |
| Solución de precipitación de proteínas | Qiagen | 158912 | |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 | |
| Glucógeno | EZ-BioResearch | S1003 | |
| Etanol al 70% | Fisher | 04-355-305 | |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 | |
| NaCl | Fisher | AC194090010 | |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 | |
| EDTA (0.5 M) Solución | Fisher | 03-500-506 | |
| Dodecil Sulfato de Sodio | Fisher | BP166-100 | |
| Mezclador de vórtice analógico | Fisher | 02-215-365 | |
| Centrífuga 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
