Expresión recombinante de celulasa de Cel5A Trichoderma reesei En plantas de tabaco

Resumen

Las plantas de tabaco se usaron para producir una celulasa fúngica, TrCel5A, a través de un sistema de expresión transitorio. La expresión podría ser monitoreado usando una proteína de fusión fluorescente, y la actividad de la proteína se caracterizó después de la expresión.

Resumen

Enzimas degradantes de celulosa, celulasas, son objeto de la investigación y los intereses industriales. La preponderancia de estas enzimas en los organismos difíciles-a la cultura, como los hongos de fomento de hifas y bacterias anaerobias, ha acelerado el uso de tecnologías recombinantes en este campo. Métodos de expresión vegetales son un sistema conveniente para la producción a gran escala de enzimas y otras proteínas industrialmente útiles. En la presente memoria, se demuestran los métodos para la expresión transitoria de una endoglucanasa fúngica, Trichoderma reesei Cel5A, en Nicotiana tabacum. El éxito de expresión de la proteína se muestra, supervisado por fluorescencia utilizando una proteína de fusión mCherry-enzima. Además, una serie de pruebas básicas se utilizan para examinar la actividad de T. transitoriamente expresó reesei Cel5A, incluyendo SDS-PAGE, transferencia Western, zimografía, así como la fluorescencia y ensayos de degradación del sustrato con base de tinte. El sistema aquí descrito se puede utilizar para producir una célula activaULASE en un corto período de tiempo, a fin de evaluar el potencial de la producción en plantas a través de sistemas de expresión constitutivos o inducibles.

Introducción

La degradación de la biomasa lignocelulósica y su conversión en combustible líquido ha sido concebido como un método para reducir la dependencia de los combustibles fósiles. Un obstáculo importante en el establecimiento de sistemas de procesamiento de biomasa económicamente viables es en la degradación enzimática de la celulosa y la hemicelulosa ^1. Sistemas de expresión de la planta muestran un gran potencial para la producción de enzimas a escala industrial. Los sistemas agrícolas a las plantas de cosecha económica y en el volumen ya están establecidos, como lo han sido durante miles de años. La producción de celulasas en las plantas es deseable debido a factores como la facilidad de autohidrólisis ^2, y el potencial para maximizar el uso de niveles más bajos de la enzima mediante el aumento de la digestibilidad de paredes celulares de las plantas ^1. Finalmente, los sistemas de la planta permiten la focalización de proteínas recombinantes a áreas específicas de las células vegetales y son capaces de modificar posttranslationally enzimas cuando sea necesario ^3.

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Nicotiana tabacum (tabaco) es muy utilizado como organismo modelo para estudios de expresión de proteínas heterólogas en las plantas, debido a sus características de crecimiento y biomasa rápida acumulación ^4. La expresión transitoria de las proteínas recombinantes es una técnica que permite la producción de proteínas en períodos de tiempo cortos ^5, manteniendo al mismo tiempo la flexibilidad en cuanto a la localización y por lo tanto las modificaciones postraduccionales de las proteínas seleccionadas, es decir, celulasas. Esto permite la producción de la celulasa (s) para el análisis básico, y al mismo tiempo sentar las bases de nuevas estrategias de expresión en plantas. Usando una estrategia de expresión transitoria tal, una endoglucanasa de la familia de glicosil hidrolasa 5, Cel5A, derivado de la fúngica huésped de Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) ⁶ se produce (en lo sucesivo referido como TrCel5A). TrCel5A es una proteína de 42 kDa que está glicosilado de forma nativa y es altamente activo en HYDroylzing cadenas de celulosa ^7.

La técnica de la expresión transitoria descrito aquí se basa en un sistema relativamente utilizado comúnmente, infiltrándose en las hojas de plantas con Agrobacteria lleva el gen de interés en un vector de expresión apropiado. Para permitir un análisis rápido de éxito la expresión in planta, TrCel5A también se puede expresar como una proteína de fusión con mCherry, una proteína fluorescente monomérico derivado originalmente de Discosoma sp. Proteína DsRed ^8, con un adicional de seis residuos de histidina (His-tag) fusionado a el C-terminal (TrCel5A-mCherry). La expresión de la proteína de fusión heteróloga, TrCel5A-mCherry, por tanto, se puede controlar en el cultivo de plantas mediante el uso de la luz verde para examinar mCherry dispersión. Si se desea, las secciones delgadas de material de la planta pueden ser examinados bajo luz verde al microscopio para determinar la localización específica de la proteína. Para este trabajo, la señal y la transentarse péptidos fueron incorporados en la construcción, para localizar la exportación de proteínas heterólogas a la retículo endoplásmico ^9.

Para analizar la actividad de celulasas expresadas de plantas, incluyendo TrCel5A, una serie de pruebas de actividad de celulasa se puede ejecutar. Después de la extracción de las proteínas solubles totales de la planta, TrCel5A puede purificarse parcialmente usando una técnica de incubación térmica. El tamaño de la proteína se estableció utilizando SDS-PAGE seguido por transferencia Western. La zimografía puede ser utilizado para analizar la actividad contra los sustratos, por ejemplo, de celulosa que ha sido carboxi-metilado (haciendo carboximetilcelulosa: CMC) para la solubilidad ^10. Actividad de la celulasa y glucosidasa se puede controlar utilizando el fluoróforo 4-metilumbeliferil (4-MU) asociado con β-D-celobiósido (combinado: 4-MUC). Otro método para evaluar la actividad endoglucanasa implica el análisis de espectrometría de CMC que se ha asociado con un azo-dye (Remazolbrilliant Blue R) ^11. Además, la actividad de proteína de ambos endoglucanasas y una gama de celulasas se puede controlar por el uso de una prueba de análisis de azúcares, tales como la hidrazida p-hidroxi benzoico (PAHBAH) de ensayo ^12. Estas técnicas se pueden utilizar para elucidar y cuantificar la actividad de la celulasa de interés expresada.

Protocolo

1. Crecimiento de tipo salvaje de N. tabacum plantas

1. Para crecer N. tabacum L. cv. Plantas Petit Havana SR1 en suelo, coloque las semillas de tabaco en macetas llenas de tierra apropiadas para macetas normales para la germinación. Después de 2 semanas, la transferencia de las plantas de semillero a macetas individuales. Incubar las plantas en un invernadero con constante de 22 ° C (periodo de oscuridad) o 25 ° C (punto de luz) y 70% de humedad relativa del aire. Proporcionar iluminación en un 16/8 horas de luz / oscuridad ciclo (por ejemplo, Philips IP65 400 W lámparas; 180 mmol · ^s-1 · ^m-2; λ = 400-700 nm) y agua todos los días.

2. Expresión transitoria de TrCel5A y TrCel5A-mCherry Proteínas

1. En condiciones estériles, recoger colonias individuales de Agrobacterium Agarobacterium (GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RIFR) que contenían pTRAkc-ER-TrCel5A o pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry y traslado a un matraz Erlenmeyer que contiene 10 ml de extracto de levaduracaldo (YEB, preparado según las especificaciones del fabricante) medio y kanamicina (50 mg / ml), rifampicina (50 mg / ml), y carbenicilina (100 mg / ml) para la selección. Incubar durante 36-40 horas a 26 ° C y 180 rpm. Nota: El diseño de las construcciones apropiadas para la expresión de la proteína se encuentra fuera del alcance de este documento, pero para la orientación, los métodos de Maclean et al ¹³ y Munro y Pellham ¹⁴ se puede seguir para el diseño de construcción..
2. Tomar 200 l de cada cultivo para inocular 20 ml de YEB con las concentraciones de antibióticos mencionados anteriormente e incubar en las mismas condiciones que antes.
3. Después de 36-40 horas, preinduce las culturas mediante la adición de 2 l acetosyringon (200 mM concentración final), 100 l 40% (w / v) de solución de glucosa y 200 l de 1 M de tampón MES pH 5,6. Incubar toda la noche.
4. Preparar 100 ml de un tampón de infiltración 2x ​​(sales basales 100 g / L de sacarosa, 3,6 g / L de glucosa, 8,6 g / l de Murashige y Skoog, Ajustar el pH a 5,6 utilizando hidróxido de potasio).
5. Mida OD ₆₀₀ de las culturas con diluciones 1:5 hasta alcanzar una _DO600 de 5-6. Cálculo de volumen de cultivo necesario para 30 ml de medio de infiltración a una DO de _600. Añadir 15 ml de tampón de infiltración 2x, a continuación, añadir _H2O desionizada para hacer el buffer hasta 30 ml.
6. Tome las plantas de invernadero y utilizar una punta de pipeta de nick el lado abaxial de la 3 ^ª a la 5 ^ª hoja de la parte superior para facilitar la infiltración.
7. Utilice una punta de pipeta para nick el lado abaxial de las hojas para facilitar la infiltración.
8. Llene una jeringa con medio de infiltración y ponerlo (sin aguja) en una de las muescas hechas previamente. Apoyar jeringa con un dedo en el lado adaxial de la hoja. Presione el medio con cuidado en el tejido de las zonas de la hoja intervenales. Nota: Después de la infiltración, cultivar plantas en un invernadero bajo las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Además, mantener una proporción igual de untreated, las plantas no transitoria de expresión (NTEPs) como controles, en las mismas condiciones que las plantas se infiltró.

3. Evaluación de TrCel5A-mCherry Expresión en las hojas de las plantas

1. Después de 4-6 días, tome las plantas se infiltró con A. tumefaciens que contienen pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry del invernadero y colocarlos en un cuarto oscuro para el análisis de fluorescencia.
2. Para visualizar la fluorescencia en secciones de hojas que expresan TrCel5A-mCherry, plantas de luz utilizando una fuente de luz portátil que emite luz verde a 515 nm con un filtro rojo (620-750 nm). Nota: En profundidad caracterización de expresión de la proteína en las hojas de las plantas se puede lograr por las hojas delgadas de seccionamiento con un vibrátomo y el examen bajo luz y microscopía de fluorescencia. Para ello siga los siguientes pasos:
   1. Cortar secciones pequeñas de aproximadamente 5 x 5 mm de tamaño de una hoja de infiltrado e incrustarlos en 4% de agarosa disuelta en 50 mM de tampón de fosfato (pH 5,7).
   2. Cortadasección de 80-90 micras de tamaño de las hojas integrados utilizando un vibratomo. Colóquelos en un portaobjetos, cubra con un tampón o una hoja de cubierta y examinarlas con un microscopio a 10 aumentos con un detector de fluorescencia, usando la misma longitud de onda y el filtro se ha dicho.

4. TrCel5A extracción de hojas de tabaco

1. Corte los pedazos de hojas de tabaco para un peso aproximado de 1 g de plantas infectadas con A. tumefaciens que contienen pTRAkc-ER-TrCel5A y colocar en un mortero previamente enfriado con nitrógeno líquido. Añadir una cantidad apropiada de nitrógeno líquido para las muestras. Grind deja a polvo usando un mortero enfriado previamente.
2. Añadir 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM a la cuestión de la hoja del suelo y mezclar hasta que la mayoría de la materia de la hoja está en suspensión. Extracto de centrifugar a 15.000 xg durante 20 min a 4 ° C y tomar sobrenadante que contiene proteína.
3. CentriFuge el extracto a 15.000 xg durante 20 min a 4 ° C y tomar sobrenadante que contiene proteína-teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. Deseche el sedimento.
4. Purificar parcialmente TrCel5A incubando el sobrenadante que contiene proteína a 55 º C durante 10 min. Dejar reposar a temperatura ambiente durante otros 10 min, a continuación se centrifuga a 15.000 xg durante 10 min a TA. Repita el proceso de purificación parcial para las plantas no infiltradas para obtener muestras de control. Utilice estas muestras para todos los siguientes experimentos. Nota: Las soluciones de proteínas pueden ser almacenadas a 4 ° C durante un máximo de 1 semana o a -20 ° C durante un máximo de 3 meses.
5. Repita el proceso de purificación parcial para las plantas no infiltradas para obtener muestras de control. Utilice estas muestras para todos los siguientes experimentos. Nota: Las soluciones de proteínas pueden ser almacenadas a 4 ° C durante un máximo de 1 semana o a -20 ° C durante un máximo de 3 meses.

5. SDS-PAGE, Western Blot, y azo-CMC Zymography de TrCel5A-mCherry

1. Compra o preparar un 12% (p / v) SDS-PAGE geles como por los métodos establecidos ^15.
2. Disolver CMC en agua para obtener una (w / v) solución de 1,5%. Para hacer geles de CMC-SDS-PAGE, sustituir 1 ml de 1,5% de CMC de 1 ml de agua en una solución de 10 ml de mezcla de gel de SDS-PAGE, lo que resulta en un 0,1% (w / v) de CMC + 12% (w / v ) de la mezcla en gel de SDS-PAGE. Verter en gel normalmente. Nota: Asegúrese de que la CMC en la solución original se haya disuelto completamente por una combinación de agitación y calentamiento a 40 ° C (repetir directamente antes de preparar la solución de gel).
3. Desnaturalizar muestras por ebullición en presencia de SDS, según métodos establecidos ^12. Como control positivo, utilizar una dilución 1:500 de una mezcla de celulasa disponibles comercialmente a partir de T. reesei, tales como T. reesei ATCC 26921. Como control negativo utilizar una solución de proteína preparada de manera similar a partir de hojas no infiltrados (NTEPs).
4. Llevar a cabo la electroforesis según los protocolos normales de ^15,por ejemplo, uso 200 V durante ~ 50 min con la electroforesis se detuvo una vez que el frente de colorante alcanzó el fondo del gel.
5. Teñir uno en gel de SDS-PAGE utilizando 0,1% (w / v) azul brillante de Coomassie y destain utilizando una mezcla de ácido acético metanol / glacial. Nota: Tinción rápida y decoloración se puede realizar calentando suavemente la tinción y la decoloración se deben soluciones, es decir, mediante el uso de un horno de microondas durante ~ 15 segundos para calentar (pero no hervir) primero la tinción y luego las soluciones destaining, cambiando la solución de decoloración después de 10 min , o cuando se enfría, y repita con la nueva solución decolorante.
6. Realizar la transferencia Western de uno en gel de SDS-PAGE utilizando protocolos establecidos ^16,17. Utilice los siguientes anticuerpos: un anticuerpo policlonal de conejo contra un anticuerpo anti-conejo región Fc etiqueta de His (primaria) y una cabra policlonal que ha sido conjugado con una fosfatasa alcalina (secundaria). Nota: anticuerpos secundarios se deben seleccionar para permitir la visualización utilizando nitroazul de tetrazolio chloride/5-bromo-4-chloro-3 '-indolyphosphate sal p-toluidina (NBT / BCIP), tal como se describe ^18.
7. Realizar la proteína en gel de replegamiento en el 0,15% (w / v) en gel de SDS-PAGE CMC incubando el gel en 1,5% (w / v) de β-ciclodextrina, tampón citrato-fosfato 20 mM, pH 6,5, a temperatura ambiente con agitación suave durante 15 min ^19.
8. Deseche la solución de β-ciclodextrina y lavar brevemente el gel con H ₂ O. Incubar a temperatura ambiente en 50 mM de tampón de acetato de sodio (pH 4,8) durante 15 min. Realizar CMC zimografía usando el 0,15% de CMC en gel de SDS-PAGE replegada incubando el gel en acetato de sodio 30 mM de tampón de pH 4,8 durante 20 min a 50 ° C.
9. Realizar CMC zimografía usando el replegada 0,15% (w / v) en gel de SDS-PAGE CMC incubando el gel en 30 mM de tampón de acetato de sodio (pH 4,8) durante 20 min a 50 ° C.
10. Teñir el gel durante 10 min utilizando un 0,1% w / v de solución de rojo Congo y destain durante 30 min o hasta que las bandas claras se observaron utilizando 1 M de NaCl. Se lava el gel con 0,3% (v / v) de ácido acético para obtener imágenes más clara.

6. 4-MUC Ensayo de actividad de TrCel5A

1. Preparar una solución madre de 10 mM de 4 MUC en 50% (v / v) de metanol, y almacenarlo en la oscuridad a temperatura ambiente
2. Inmediatamente antes del ensayo, preparar una solución de trabajo 4-MUC 2x, compuesto de 1 mM de 4-MUC y 60 mM de acetato de sodio, pH 4,8.
3. Realice esta prueba sobre muestras que contienen 100 l de proteína de la hoja (con o sin TrCel5A inducible expresado), 100 l de una mezcla de celulasa disponibles comercialmente a partir de T. 1:1.000 reesei y H ₂ O puro, respectivamente. Ejecutar cada muestra por triplicado.
4. Pipetear 100 l de la solución de trabajo 4-MUC en pocillos separados de una placa de 96 pocillos, a continuación, añadir 100 l de cada muestra.
5. Determinar 0 min punto de tiempo de 4-MU de fluorescencia a través de la espectroscopia de fluorescencia, usando una longitud de onda de excitación de 360 ​​nm y una longitud de onda de emisión de 465 nm.
6. Incubar las placas durante 20min a 50 ° C, cubierto con tapas adhesivas para evitar la evaporación. Detenga la reacción de congelación (o mediante la combinación de 100 l 0,15 M de glicina, pH 10,0, y 100 l de muestra en una placa separada).
7. Determinar el punto final de 4-MU de fluorescencia a través de la espectroscopia de fluorescencia, usando una longitud de onda de excitación de 360 ​​nm y una longitud de onda de emisión de 465 nm. Reste 0 min del final del estudio (20 min) punto de tiempo para obtener el cambio en los valores de fluorescencia.

7. Azo-carboximetil celulosa Ensayo de actividad de TrCel5A

1. Preparar un stock de 1,5% (w / v) azo-CMC que se almacena a temperatura ambiente, y una solución de precipitación que contiene acetato 18 mM de zinc, 0,5 M de acetato de sodio, pH 5 y etanol 80% (v / v), en la sala de la tienda temperatura.
2. Inmediatamente antes del ensayo, preparar una solución de azo-CMC 2x de trabajo, compuesta de 1% (w / v) azo-CMC (en _H2O) y 60 mM de acetato de sodio, pH 4,8.
3. Combine 50 l de muestra y 50 l de la obraing solución en tubos de 1,5 ml.
4. Las muestras de ensayo que contienen 50 l de proteína de la hoja (con o sin TrCel5A expresado transitoriamente); 100 l de una mezcla de celulasa disponibles comercialmente a partir de T. reesei diluido 1:1.000; y pura H ₂ O. Muestras y los estándares manejados por triplicado.
5. Incubar las muestras durante 20 min a 50 ° C. Detener la reacción añadiendo 250 l de solución de precipitación. Vortex cada muestra vigorosamente durante 10 segundos para asegurar soluciones fueron completamente combinados.
6. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 min y luego vórtice de nuevo. Centrifugar las muestras a 1000 xg durante 10 min. Tomar 200 l de cada sobrenadante de la muestra a una placa de 96 pocillos, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento.
7. Ensayo usando espectroscopia de absorbancia a una longitud de onda de 590 nm.

8. Ensayo PAHBAH de TrCel5A

1. Use una perforadora para cortar un círculo (~ 5,5 mm de diámetro) de papel de filtro. Añadir 100 l de NaAc 60 mM, pH 4,8, y 100 l de muestras, o bien que contienen proteína de la hoja (con o sin TrCel5A inducible expresado) o un T. comercial mezcla de celulasa reesei, diluido 1:1.000, y se incuba con círculos de papel de filtro durante 20 horas a 50 ° C con 300 rpm de temblar. Para cada muestra se incuba con papel de filtro, también se incuba una solución duplicado sin papel de filtro como se muestra-controles individuales.
2. Preparar un 330 mM p-hidroxi benzoico hidrazida (PAHBAH) Una solución disolviendo PAHBAH en H ₂ O con la adición de 5 ml de HCl concentrado para un total de 100 ml de solución, y almacenarlos a temperatura ambiente. Nota: Los mejores resultados se consiguen mediante la adición de HCl a un volumen más pequeño de suspensión PAHBAH, es decir, 30 ml, que se agita bajo condiciones de temperatura para ayudar a la disolución antes de hacer el volumen a 100 ml con H ₂ O.
3. Preparar PAHBAH solución B, que contiene citrato de sodio 50 mM, cloruro de calcio 10 mM y NaOH 500 mM y se almacena a temperatura ambiente.
4. Immediately antes del ensayo, preparar una solución de trabajo de 1,5 x de reactivo PAHBAH 1 ml a 9 ml de solución tampón, almacenar en hielo hasta su uso (para ser utilizado dentro de 4 horas).
5. Preparar muestras en termoestables 0,2 o 0,5 ml tubos. Combine 5 l de cada solución incubadas con papel de filtro (paso 8.1) 45 l de H ₂ O y 100 l de solución de trabajo PAHBAH. Controles de muestra (muestras incubadas sin papel de filtro) deben utilizarse en las mismas concentraciones (5 l de la muestra, 45 ₂ O, la solución de trabajo 100 l PAHBAH l H). También prueba 5 normas (5 l) que contienen entre 0 y 0,2 g / l de glucosa, y H pura ₂ O. Muestras y los estándares manejados por triplicado.
6. Incubar las muestras durante exactamente 10 min a 100 ° C, a continuación, enfriar a temperatura ambiente durante exactamente 10 min. Soluciones de la pipeta en una placa de 96 pocillos y ensayo espectroscópicamente a una longitud de onda de 410 nm. Reste la muestra-controles individuales (incubadas sin papel de filtro) a partir de muestras para obtener definitivavalores.

Resultados

TrCel5A y TrCel5A-mCherry se expresaron con éxito en plantas de tabaco usando el sistema de expresión transitoria (Figuras 1A y 1B). El examen del patrón de expresión de la proteína de fusión TrCel5A-mCherry reveló hojas sanas (Figura 1C), que mostró que la expresión de proteínas generalizada con luz verde (Figura 1D).

La extracción de las proteínas solubles totales se realizó en plantas de tabaco que tenían hojas que conten...

Discusión

La expresión recombinante de celulasas es un campo de gran interés, debido al deseo de los sistemas de producción de biocombustibles más eficientes ^1. Las plantas ofrecen muchas posibilidades para la producción de celulasas éxito, con características tales como las técnicas de aprovechamiento económico y métodos autohidrólisis son propiedades muy deseables para la producción de biocombustibles a gran escala. Además, el uso de diferentes localizaciones para la producción de proteínas permite, en caso necesario...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
4-metilumbeliferil β-D-celobiósido	SIGMA-ALDRICH	M6018
Ácido acético	ROTH	3738
Acetosiringón (concentrado)	ROTH	6003
Antibiótico - kanamicina	ROTH	T832
Antibiótico - rifampicina	ROTH	4163
Antibiótico - carbenicilina	ROTH	6344
Anticuerpo - conejo anti His(6) pAb	ROCKLAND	600-401-382
Anticuerpo - cabra anti conejo AP, FC pAb	DIANOVA	111-055-008
Azo-carboximetilcelulosa	MEGAZYME	S-ACMC
β-ciclodextrina	SIGMA-ALDRICH	C4805
Cloruro de calcio dihidratado	SIGMA-ALDRICH	C5080
Carboximetilcelulosa	ROTH	3333.1
Celulasa de Trichoderma reesei ATCC 26921	SIGMA-ALDRICH	C2730
Congo rojo	SIGMA-ALDRICH	75768
Coomasie azul brillante G 250	ROTH	9598.2
D(+)-glucosa	ROTH	8337
Etanol	ROTH	K928
Papel de filtro - Rotilabo papel secante	ROTH	CL67
NBT/BCIP	SIGMA-ALDRICH	72091
TAMPÓN MES	ROTH	4256
Metanol	ROTH	8388
Citrato de sodio	ROTH	3580
Dodecililsulfato de sodio	SERVA	20765
Hidróxido de sodio	ROTH	6771
Suelo, Einheitserde classic	Espectrómetro PATZER GMBH
- Infinite M200	TECAN
Sacarosa	SIGMA-ALDRICH	S-5390
4-hidroxibenzhidrazida	SIGMA-ALDRICH	H9882
ROTH	1058		tamponada con fosfato
- BLAK RAY	UVP
Vibratome - VT1000S	Leica