El trasplante de piel de cola es un poderoso modelo para estudiar el rechazo dependiente de las células T y la inducción de tolerancia durante las respuestas inmunes alogénicas en ratones. Las ventajas de este protocolo son la cirugía invasiva menor y la facilidad de seguimiento sin necesidad de sacrificar el ratón receptor.
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Artículo de método
El trasplante de la cola de la piel para el Estudio alogénico de células T CD4 respuestas en ratones
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Resumen
Resumen
El estudio de las respuestas de los linfocitos T y sus consecuencias durante el reconocimiento de aloantígenos requiere un modelo que permita distinguir entre linfocitos T donantes y huéspedes, monitorizar fácilmente el injerto y adaptar el sistema para responder a diferentes preguntas inmunológicas. Medawar y sus colegas establecieron el trasplante alogénico de piel de cola en ratones en 1955. Desde entonces, el modelo de trasplante de piel se ha modificado y adaptado continuamente para responder a preguntas específicas. El uso de la piel de la cola hace que este modelo sea fácil de puntuar para el rechazo del injerto, no requiere una preparación extensa ni anestesia profunda, es aplicable a animales de todos los antecedentes genéticos, desalienta la necrosis isquémica y permite la intervención química y biológica.
En general, tanto los linfocitos T alogénicos CD4+ como los CD8+ son responsables del rechazo de los aloinjertos, ya que reconocen antígenos principales de histocompatibilidad no coincidentes de diferentes cepas de ratones. Se han descrito varios modelos para la activación de células T alogénicas en ratones trasplantados con piel. La identificación de moléculas de clase I y II del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) en diferentes cepas de ratones, incluidos los ratones C57BL/6, fue un paso importante hacia la comprensión y el estudio de las alorespuestas mediadas por células T. En el modelo de trasplante de piel de cola descrito aquí, una mutación de tres puntos (I-Abm12) en el surco presentador de antígeno de la molécula MHC-clase II (I-A b) es suficiente para inducir una fuerte activación alogénica de las células T CD4+ en ratones C57BL/6. Los injertos de piel de ratones I-Abm12 en ratones C57BL/6 se rechazan en un plazo de 12 a 15 días, mientras que los injertos singénicos se aceptan durante un máximo de 100 días. La ausencia de linfocitos T (ratones CD3-/- y Rag2-/-) permite la aceptación del injerto de piel hasta 100 días, que puede superarse mediante la transferencia de 2 x 104 linfocitos T de tipo salvaje o transgénicos. Las células T transferidas adoptivamente proliferan y producen IFN-γ en ratones Rag2-/- trasplantados con i-Abm12.
Introducción
El trasplante de órganos sólidos, como la piel, el corazón y los riñones es ahora un procedimiento estándar en la práctica médica en todo el mundo 1. Órganos trasplantados con éxito pueden ser rechazadas por la activación del sistema inmune receptor, que reconoce los antígenos principales de histocompatibilidad del donante. Por lo tanto los pacientes transplantados necesitan tratamiento con medicamentos inmunosupresores 2. El trasplante alogénico de piel en ratones fue establecido por Medawar y sus colegas en 1955 y ha sido útil para la identificación de las moléculas específicas que se describen más adelante como complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I y II. Desde entonces, el modelo de trasplante de piel ha sido modificado y adaptado para estudiar el papel de los subconjuntos de células T y la relevancia de la química y la intervención biológica en la supresión de rechazo de injertos 2-4 continuamente. La piel de la oreja y el tronco son más difíciles de preparar y son más susceptibles a la hipoxia y la necrosis de la piel de la cola-5; Sin embargo,el procedimiento de trasplante es similar. Además, el seguimiento de trasplantes de cola de la piel es fácil debido a la textura del cabello característico de la piel.
Este artículo proporciona un procedimiento detallado de MHC de clase II desajuste trasplante de cola de la piel que permite el estudio de los diferentes aspectos de la T CD4 + rechazo de aloinjertos mediada por células y la tolerancia en ratones. La mutación natural de tres puntos en la molécula de MHC clase II IA B (llamado IA BM12) 6-9 es suficiente para inducir el rechazo de aloinjertos de piel en ratones C57BL / 6 8. La molécula de BM12 IA activa las células T CD4 + con diferentes receptor de células αβ-T (TCR) cadenas de ratones C57BL / 6, entre las que se identificaron las células T Vα2Vβ8-TCR-específicas con el fin de generar un ratón transgénico TCR-10. La transferencia adoptiva de células-TCR-específicos Vα2Vβ8 T se ha usado para establecer un modelo de rechazo en C57B inmunodeficienteL / 6 Rag2 - / - ratones transplantados con la piel IA BM12.
Las diferencias genéticas entre el donante y el receptor afectan el resultado de la aceptación y el rechazo de trasplante. Hay diferentes tipos de trasplantes: autoinjertos son los trasplantes de la persona beneficiaria misma; syngrafts y aloinjertos son los trasplantes de individuos genéticamente idénticos y no relacionados genéticamente, respectivamente. Aceptación de diferentes trasplantes de órganos alogénicos se ha demostrado por la intervención química y biológica en pacientes y modelos de ratón 11,3,4. En un enfoque básico, anti-CD3 tratados C57BL / 6 ratones mostraron una supervivencia prolongada de IA BM12 cola-piel (datos no publicados). El agotamiento de los CD4 + y CD8 + T las células antes del trasplante en ratones receptores resultó en la aceptación de MHC de clase I y II injertos no coincidentes (Apocalipsis en el 12). Curiosamente, el rechazo de injertos de piel depende de la presencia de células CD4 + Células T (rev. en 12). En este modelo, la orientación interacciones específicas entre diferentes células inmunes mediante el bloqueo de las moléculas coestimuladoras con anticuerpos o supresión con células T reguladoras podría inducir tolerancia (datos no publicados). De hecho, el bloqueo de ambos CD40 y CD28 dio lugar a la tolerancia 13,14 aloinjerto de piel a largo plazo.
Trasplante de Cola-piel es fácil de realizar y fácil de controlar en comparación con el trasplante de otros órganos. Además, los trasplantes de cola de la piel son fáciles de preparar y son menos susceptibles a la isquemia de otros tejidos de la piel. En contraste a los anestésicos inyectados, el uso de gas anestésico (isofluorano) durante el trasplante acorta tanto el procedimiento y el tiempo de recuperación destinatario. Curling del trasplante de cola de la piel, que puede conducir a la cicatrización de heridas incompleta y el rechazo del injerto, se evita mediante la aplicación de adhesivo de tejido. Además, el modelo de trasplante de piel de la cola-IA BM12 activa exclusivamente CD4 + Células T, tanto inmunocompetentes como ratones inmunodeficientes (de los mismos antecedentes genéticos) facilitar la interpretación de los resultados.
Este protocolo describe un modelo de ratón fiable, reproducible y fácilmente controlables que permite la intervención química y biológica. El modelo está diseñado para investigar el rechazo y la tolerancia a la inducción de los trasplantes de cola de la piel.
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Protocolo
En esta publicación, el vídeo y el protocolo, se llevaron a cabo todos los procedimientos con animales de acuerdo con el protocolo de los animales aprobado por la autoridad cantonal de Basilea-Ciudad, Suiza. Realice todos los procedimientos en condiciones de esterilidad, cuando sea posible.
1. Preparación de Cirugía
- Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos y gasas antes de su uso.
- Calentar la almohadilla caliente y organizar los instrumentos quirúrgicos en la tabla (Tabla de Materiales / Métodos).
- Abra las vendas de la tira dedo. Aplique vaselina en la plataforma de la herida con un algodón (asegúrese de que la gasa se cubre totalmente).
- Pesar los ratones y administrar analgesia buprenorfina 0,05 mg / kg de peso corporal. Nota: esto proporcionará analgesia inmediatamente después del trasplante.
2. Preparación de la cola de la piel para el Trasplante
- La eutanasia a los ratones donantes (por ejemplo, IA) BM12, los cuales por asfixia de CO 2 y disinfect las colas con solución de desinfección antes de la escisión.
- Coloque la cola con la franja negro sobre una placa de plástico limpio y cortado longitudinalmente a lo largo de la línea media, haciendo una incisión superficial que afecta sólo la capa de piel.
- Retirar la piel de la cola utilizando pinzas de agarre.
- Ponga la cola de la piel en una placa de cultivo de 10 cm celda llena con 10 ml de HBSS.
3. Procedimiento Quirúrgico
- Anestesie ratones receptores (por ejemplo, ratones C57BL / 6) por inhalación de una solución de isofluorano 3% en una caja de inducción transparente. Nota: Se necesita 3-5 minutos para el ratón para llegar a la anestesia plano quirúrgico. Use ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
- Coloca el ratón sobre la almohadilla tibia y aplicar el 1,5% isofluorane través de una mascarilla boca y el culo cada reflejo animal toe pellizcos.
- Afeitar el sitio dorsal de los ratones receptores (por ejemplo, C57BL / 6) y quitar los pelos contaminantes utilizando un sw gasa secaab.
- Desinfectar sitio trasplante afeitado con solución aséptica.
- Apriete la piel con unas pinzas en el sitio central / derecha del dorso y el uso de tijeras curvas para hacer una incisión alrededor de alrededor de 1 x 0,6 cm.
- Si se produce una hemorragia, luego limpiar la herida con un hisopo de algodón estéril.
- Evaluar el tamaño de la incisión y cortar un trasplante de el tamaño estimado de la cola-piel utilizando el bisturí.
- Recorte esquinas para redondear el trasplante.
- Cargue el trasplante en el bisturí, el exceso seca de HBSS en un hisopo de algodón estéril y lo coloca en el lecho del injerto del ratón receptor.
- Evitar la superposición de los donantes y de la piel de acogida y aplicar adhesivo tisular en la zona de contacto de forma exclusiva.
- Aplicar un yeso sin arrugas alrededor de la cintura del ratón.
- Aplicar el adhesivo vendaje no elástico para fijar el yeso para el ratón (3 mm desplazado).
- Una incisión con las tijeras alrededor de 3 mm en el sitio ventral superior del vendaje. Nota: Esto es para evitar trapping de los dientes del ratón durante la fase de recuperación.
- Retire la anestesia boca máscara y mantener a los ratones trasplantados en la almohadilla caliente hasta que despierto.
- Volver ratones trasplantados a sus jaulas sólo cuando esté completamente recuperado y evaluar su movilidad para asegurarse de que el vendaje no está demasiado ajustado.
- Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos con etanol al 70% antes de proceder con la cirugía siguiente.
4. Cuidado post-operatorio
- Añadir jarabe que contiene paracetamol al agua de bebida (4 mg / ml) y administrarlo durante 7 días.
- Ratón Regresar a la sala de los animales una vez que se haya recuperado.
- Seguir de cerca los ratones en busca de signos clínicos como la depresión u otros cambios de comportamiento (comer o inmovilidad), aspecto anormal (falta de aseo personal) o la postura (pilo-erección o postura encorvada) durante el tiempo que el vendaje está en su lugar (1 semana).
5. Eliminación del vendaje (6-7 días post-trasplante)
- Anesthetize los ratones por inhalación de una solución de isofluorano 3% en una caja de inducción transparente (véase más arriba).
- Cortar el vendaje y el yeso con unas tijeras de la arteria y cuidadosamente eliminarlos. Nota: evitar el estiramiento del sitio de trasplante.
- Monitorear los ratones trasplantados en busca de signos clínicos (ver 4.3) y la puntuación para el rechazo de los injertos de piel (Tabla 1). Nota: El sistema de puntuación de injerto se aprovecha de las diferentes texturas de pelo en la cola de la piel en comparación con el dorsal de la piel. La aparición del trasplante y su rechazo se clasifica en 3 grados. Piel alogénico (MHC II no coinciden, por ejemplo, IA BM12) injertos de C57BL / 6 ratones inmunocompetentes son generalmente rechazados dentro de 12 a 15 días después del trasplante (datos propios y 15-20).
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Resultados
En una primera aproximación C57BL / 6 ratones fueron trasplantados con aloinjertos BM12, los cuales IA y b syngrafts IA. Después de retirar el vendaje, injertos signos manifiestos de la cicatrización de heridas y sin cierre de la zona de contacto en C57BL / 6 ratones (Figura 1A). Después de la retirada del vendaje, CD4 + T inflamación mediada por células condujo a la aparición de áreas necróticas (manchas rojas) y el rechazo de aloinjertos BM12, los cuales IA ...
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Discusión
Trasplante de la piel es un método ampliamente utilizado para el estudio de rechazo y dependiente de las células T de la tolerancia. Desde que se estableció el modelo de trasplante de piel, se han aplicado varias adaptaciones y cambios. En el procedimiento descrito, IA BM12 trasplante de cola de piel se realiza con gas anestésico (isofluorano). El uso de la anestesia con gas reduce el tiempo de ejecución y la recuperación de los ratones, lo que disminuye la presión sobre los ratones trasplantados. El procedim...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de SNF PPOOA-_119204 y PPOOP3_144918 a S.W.R. Agradecemos a E. Palmer y B.T.H. Hausmann por los ratones y la experiencia técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Betadine solución estándar | Mundipharma | ||
| Hisopo de algodón | Carl Roth GmbH | 31025060 | |
| Dafalgan , UPSA | Bristol Myers Squibb UPSA | ||
| Tiras de dedo Hansaplast | Beierdorf AG | REF.76861 | |
| Histoacryl adhesivo para tejidos | Braun | REF.1050052 | |
| Leukotape classic , 2 cm x 10 m | BSN Medical SAS | REF.02204-00 | |
| PBS, Solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 | Invitrogen | 10010015 | GIBCO |
| Gasa estéril, 5 x 5 cm, 8 capas | MaiMed GmbH | 21010 | |
| Pinza de patrón estrecho | FST | 11003-12 | |
| Tijera de iris fina curvada | FST | 14095-11 | |
| Tijera de iris | fina FST | 14094-11 | |
| Tijeras de mayonesa | FST | 14010-15 | |
| Tijeras de arteria punta de bola 11,5 cm | FST | 14080-11 | |
| Pinza de tejido | FST | 11021-14 | |
| Cuchilla quirúrgica n.º 20 | Swann-Morton LTD | 3006 | Acero al carbono |
| Mangos de cuchilla quirúrgica | Swann-Morton LTD | ||
| Jeringa, 1 ml | ARTSANA | Temgesic Desechable | |
| , buprenorfina | ESSEX Chemie AG | 0,3 mg/ml | |
| Placas de cultivo de tejidos 10 cm, 60,1 cm2 | TPP | ||
| Vaselina | Vifor SA | ||
| Almohadilla caliente | Solis | Tipo 223 |
Referencias
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