El método de cultivo en tres dimensiones se describe en este protocolo recapitula el desarrollo del páncreas a partir de progenitores páncreas de ratón embrionarias dispersas, incluyendo su expansión sustancial, diferenciación y morfogénesis en un órgano ramificada. Este método es susceptible de formación de imágenes, la interferencia funcional y la manipulación del nicho.
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Artículo de método
In Vitro Páncreas Organogenesis de dispersos embrionarios de ratón Progenitores
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Resumen
Resumen
El páncreas es un órgano esencial que regula la homeostasis de la glucosa y segrega enzimas digestivas. La investigación sobre la embriogénesis del páncreas ha llevado al desarrollo de protocolos para producir células pancreáticas a partir de células madre 1. Todo el órgano embrionario puede cultivarse en múltiples etapas de desarrollo 2-4. Estos métodos de cultivo han sido útiles para probar fármacos y para obtener imágenes de los procesos de desarrollo. Sin embargo, la expansión del órgano es muy limitada y la morfogénesis no se recapitula fielmente ya que el órgano se aplana.
Proponemos condiciones de cultivo tridimensionales (3D) que permiten la expansión eficiente de progenitores pancreáticos embrionarios de ratón disociados. Mediante la manipulación de la composición del medio de cultivo es posible generar esferas huecas, compuestas principalmente por progenitores pancreáticos que se expanden en su estado inicial, o bien, organoides complejos que progresan a progenitores expansivos más maduros y se diferencian en células endocrinas, acinares y ductales y que espontáneamente se autoorganizan para parecerse al páncreas embrionario.
Demostramos aquí que el proceso in vitro recapitula muchos aspectos del desarrollo natural del páncreas. Este sistema de cultivo es adecuado para investigar cómo las células cooperan para formar un órgano reduciendo su complejidad inicial a unos pocos progenitores. Se trata de un modelo que reproduce la arquitectura 3D del páncreas y que, por tanto, es útil para estudiar la morfogénesis, incluida la polarización de las estructuras epiteliales y la ramificación. También es apropiado evaluar la respuesta a las señales mecánicas del nicho, como la rigidez y los efectos sobre la tensegridad de la célula.
Introducción
Cultivo de órganos constituye un modelo útil que llena los huecos existentes entre la complejidad y relevancia en las investigaciones in vivo y la simulación conveniente pero aproximada de modelos de línea celular. En el caso del páncreas, no hay una línea de células perfectamente equivalente a progenitores páncreas aunque no se transforman líneas celulares que simulan células endocrinas y exocrinas. Todo el páncreas adulto no puede ser cultivado; aislados islotes endocrinos pueden mantenerse durante semanas sin la proliferación celular y rodajas de tejido se pueden mantener in vitro para algunas horas 5. Cultura páncreas embrionario ha sido ampliamente utilizado no sólo para estudiar su desarrollo, sino también para investigar las interacciones epitelio-mesenquimal 4,6,7, a la imagen procesa 8 o interferir químicamente con ellos 9. Dos métodos de cultivo de órganos se utilizan principalmente: la primera consiste en el cultivo de brotes pancreáticos en placas de fibronectina recubierto 2, que es conveniente para los propósitos de formación de imágenes; la segunda opción es la cultura de los órganos en los filtros en la interfase aire-líquido 3,4 que mejor conserva la morfogénesis. Aunque muy útil, estos métodos conducen a un cierto grado de aplanamiento; la expansión de progenitores es muy limitado en comparación con el desarrollo normal y la población de partida es complejo que comprende todos los tipos de células pancreáticas y células mesenquimales.
La capacidad de la cultura y expandir las células primarias dispersas es valiosa para estudiar las relaciones de linaje y descubrir las propiedades intrínsecas de los tipos de células aisladas 10. Sugiyama et al 11. Podría mantener progenitores pancreáticos y células progenitoras endocrinas que conservaron algunos caracteres funcionales durante 3-5 días en cultivo en capas alimentadoras. Pancreatospheres, similar a neuroesferas 12 y mammospheres 13, se han ampliado de islotes adultos y células ductales aunque la naturaleza de los progenitores / células madreque generan estas esferas no está claro. Además, en contraste con el desarrollo fisiológico, los pancreatospheres contenían algunas neuronas 14,15. Esferas también se produjeron recientemente a partir de progenitores páncreas embrionario 16,17 y regenerar los páncreas de 18 años con una buena expansión de progenitores y posterior diferenciación pero no lograron recapitular la morfogénesis.
Modelos 3D a partir de células dispersas y, a menudo definidos que se auto-organizan en órganos miniaturizados han florecido recientemente y simular el desarrollo o un adulto facturación de múltiples órganos, como el intestino 19,20, el estómago 21, el hígado 22, la próstata 23 y la tráquea 24. En algunos casos, la morfogénesis y la diferenciación del desarrollo se han recapitulado en 3D a partir de células ES, como es el caso de tazas 25, el intestino 26 o cerebrales 27 óptica.
En este sentido, describir un método para expandir progenitores pancreáticos multipotentes disociadas en un andamio 3D Matrigel donde pueden diferenciarse y auto-organizarse.
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Protocolo
Este protocolo tiene como objetivo crecer organoides pancreáticas derivadas de E10.5 murino disociaron células epiteliales pancreáticas.
El protocolo requiere la aprobación ética para la experimentación animal.
1. Disección de dorsal de páncreas Bud de E10.5 embriones de ratón
- Medio esencial Sacrificar los ratones oportuna embarazadas en el día embrionario (E) 10,5, abrir el abdomen con un par de tijeras, retire los dos cuernos uterinos y colocarlos en un plato de Petri de 10 cm llena con tampón fosfato frío salino (PBS) o modificado por Dulbecco (DMEM) se mantuvo en hielo. El experimento total desde el sacrificio a la siembra de células se realiza en 60-90 minutos para prevenir el daño celular.
- Separe el útero en segmentos de embriones individuales utilizando unas tijeras pequeñas. Transferir un embrión a una placa de 35 mm de Petri con PBS frío y visualizar bajo un microscopio de disección con iluminación desde arriba. Con fórceps de disección eliminar el músculo, la decidua y la yema que rodea saC y exponer el embrión. Coloque el embrión de nuevo en medio DMEM frío. Los embriones se pueden transferir fácilmente utilizando un 3 ml de transferencia de plástico pipeta / gotero. Aislar cada embrión individual en una manera similar antes de continuar.
- Coloque un embrión en una limpia de 35 mm placa de Petri en PBS.
- Use unas pinzas finas (0,05 mm de ancho) para quitar la extremidad anterior. Inserte con cuidado la pinza en la apertura para separar el tracto digestivo, desde la región de la médula espinal (Figura 1). OPCIONAL: Para ver más cómodamente el estómago, retire la parte superior del cuerpo del embrión, hasta el corazón y la región de la cola por debajo del saco vitelino.
- Localizar el estómago, el hígado y el intestino. El uso de los fórceps, aislar el tracto gastrointestinal desde el estómago hasta el intestino y colocarlo en DMEM frío en hielo (Figura 1). El brote pancreático dorsal está unido dorsalmente, posterior al estómago (Figura 1).
- Aislar cada tracto gastrointestinal individuo en una simimanera lar antes de continuar. Si los embriones deben ser genotipo, recoger la cola en el momento de la disección y mantener a cada tracto gastrointestinal individual en un pozo diferente en una placa de 24 pocillos con DMEM frío en hielo.
- Coloque un tracto gastrointestinal de una manera limpia de 35 mm placa de Petri en PBS frío. Ahora utilizar la iluminación desde abajo en campo claro de visualizar y diseccionar el brote pancreático dorsal bajo el microscopio de disección. Estas condiciones optimizar la visualización de volúmenes. El uso de agujas de tungsteno afiladas electrolíticamente-o 20 G agujas de jeringa, aislar el brote pancreático con tan poco como sea posible mesénquima alrededor del epitelio (Figura 1).
- Transferir el brote aislado en una placa de Petri que contiene una solución de dispasa frío (1,25 mg / ml) durante 2-3 min. Desde este punto, la transferencia más convenientemente se puede hacer con 50 l capilares de vidrio de llama-tirado conectados a un tubo flexible boca-controlada. Alternativamente, pero con más risk de perder el brote, utilice una pipeta automática 10 l (Pipetman) con puntas de plástico adecuados.
- Realizar la aspiración brote pancreático y de eyección bajo control microscópico. Ponga el brote pancreático de nuevo en PBS. Además limpiar el brote pancreático aislado a partir del mesénquima con las agujas y aspiración suave utilizando el capilar de vidrio (Figura 1).
- Cuando se extirpa todo el mesénquima, enjuague el brote pancreático en PBS frío; transferir cada brote a DMEM frío en pozos individuales (60 pocillos mini-bandejas llenas de 10 l de DMEM frío). Es importante no eliminar el mesénquima en dispasa, lo que hace que el tejido muy pegajosa.
2. Plating y Cultura de células dispersas
- Transferir el epitelio disecados de todos los embriones con un capilar de vidrio de la llama-tirado en pozos cónicos de 60 pocillos mini-bandejas llenas de 10 l de PBS para el enjuague.
- Transferir el brote en 10 l de tripsina al 0,05% de unnd déjelo incubado a 37 ° C durante 4 min. Inactivar la tripsina mediante la transferencia de la yema en un pozo con 10 l de DMEM + 10% de suero de ternera fetal (FCS).
- Disociar la suspensión celular por aspiración a través de un capilar fino desmenuzado con un extractor de pipeta. Es importante evitar las burbujas en esta etapa mientras pipeteando arriba y abajo para disociar las células. Organoides Páncreas óptimamente empiezan desde pequeños grupos de 5 a 15 células y, por tanto, la disociación parcial se recomienda (Figura 1).
- Reunir las células de varios embriones en un tubo Eppendorf con el fin de minimizar las diferencias debido a procesamiento individual. Diluir la suspensión de células en Matrigel frío en una proporción 01:03. Alícuota de esta mezcla a una placa de 96 pocillos, 8 l / pocillo o en una placa optimizado para la imagen (ver más abajo).
- Incubar la placa a 37 ° C durante 5 minutos, permitiendo que el Matrigel se espese. Llenar los pocillos con 70 l de medio de elección (organoide o esfera, véase Tables 1 y 2) y dejar en un ambiente humidificado contiene 5% de CO2 y 95% de aire a 37 ° C.
- Sustituya el medio cada 4 º día. Monitorear las colonias pancreáticas crecimiento diario y documentar el proceso de obtención de imágenes.
- Las moléculas pequeñas o proteínas de interés se pueden añadir al medio en esta etapa para experimentos de interferencia, como se informó anteriormente 28.
Tabla 1: media organoide.
| Nombre de los Materiales | Stock Concentración | Concentración en medio final | Volumen de existencias |
| Penicilina-estreptomicina | 100% | 1% | 50 l |
| Reemplazo Serum golpe de gracia (suplemento) | 100% | 10% | 500 l |
| 2-mercaptoetanol | 14,3 M | 0,1 mM | 1 l |
| Miristato acetato de forbol (PMA) | 16 M | 16 nM | 5 l |
| Y-27632 (inhibidor de ROCK) | 50 mM | 10 M | 1 l |
| EGF | 50 g / ml | 25 ng / ml | 2.5 l |
| Recombinante Humana R-1 Spondin | 250 g / ml | 500 ng / ml | 10 l |
| - O - | |||
| Recombinante ratón R-1 Spondin | 250 g / ml | 500 ng / ml | 10 l |
| FGF1 humano recombinante (FCFa) | 100 g / ml | 25 g / ml | 1,25 l |
| Heparina (Liquemin) | 2500 U / ml | 2,5 U / ml | 2 l |
| RecomFGF10 humana recombinante | 100 g / ml | 100 ng / ml | 5 l |
| DMEM/F-12 | 4,412.25 l | ||
| Total | 5000 l |
Tabla 2: mediano Esfera.
| Nombre de los Materiales | Stock Concentración | Concentración en medio final | Volumen de existencias |
| Penicilina-estreptomicina | 100% | 1% | 50 l |
| X50 B27 (suplemento) | 100% | 10% | 100 l |
| FGF2 humano recombinante (bFGF) | 100 g / ml | 64 ng / ml | 3.2 l |
| Y-27632 (inhibidor de ROCK) | 50 mM | 10 M | 1 l |
| DMEM/F-12 | 4845.8 l | ||
| Total | 5000 l |
3. Imagen de la progresión de Desarrollo organoide
- Organoides imagen ya sea diaria o por microscopía lapso de tiempo utilizando un microscopio de time-lapse fluorescente. Para imágenes de lapso de tiempo, utilice un gráfico XY (Z) microscopio de fluorescencia invertido automatizado.
- Depósito de pequeñas gotas de 3 l en placas de 4 pocillos o placas con fondo de cristal llenos de medio de 2-5 ml. Imagen con un objetivo de larga distancia 10 veces. Nota: Los ratones transgénicos que expresan los marcadores fluorescentes se pueden utilizar. Película 1 muestra, por ejemplo, la expansión inicial de organoides de Pdx1-Ngn3-ER TM-IRES-nGFP + ratones 4. La GFP nuclear permite al usuario realizar un seguimiento de las células como objetos individuales, sino principios similares pueden ser aplicados a un seguimiento de las células con fluorescencia de membrana talescomo mT / MG ratones 29.
- Comience time-lapse de imágenes de 3 horas después de la siembra de las células para evitar derivas de enfoque y ajustar el software de automatización de control para tomar 1 imagen / hr durante 3 o más días en las posiciones definidas manualmente. Para cada posición, adquirir una imagen de contraste de interferencia diferencial (DIC), así como la señal de GFP, la presentación de informes de expresión de marcador fluorescente.
4. Recuperación de Organoides para histología
- Coloque la placa de 96 pocillos en hielo y se elimina el medio, reemplazándolo con PBS enfriado con hielo. Esta despolimeriza parcialmente Matrigel.
- Se aspira suavemente cada organoide individuo, la eliminación de la Matrigel circundante usando una punta de 1,000 l con el fin de no perturbar la arquitectura general. Transfiera cada organoide a un pozo con hielo frío PBS. Guarde la placa de hielo. La fijación directa en Matrigel también es posible.
- Fijar el organoide durante 15 minutos en 4% paraformaldehido (PFA), criopreservar en sacarosa e incrustarlo en gelatina. Procesar cada unoorganoide para cryosectioning y la histología como se describe anteriormente (Johansson et al., 2007) 4.
5. Recuperación de Organoides para la PCR y Bioquímica
- Coloque la placa de 96 pozos en el hielo y quitar del medio. Añadir 60 l de RNAlater por pocillo con el fin de estabilizar y proteger el ARN celular.
- Interrumpir el gel en cada pocillo mecánicamente por parcialmente despolimerización en hielo. Cualquiera de recuperar organoides individuales usando una punta de 1,000 l con el fin de no perturbar la arquitectura general o recuperar todo el pozo (con Matrigel) mediante la interrupción de la gel de forma mecánica con una punta de 200 l. Utilice una punta de 1.000 l para transferir el contenido bien en un libre no pegajoso tubo Eppendorf RNAsa mantener en hielo.
- Lave los pocillos con 60 l RNAlater y añada el contenido restante en el mismo tubo de Eppendorf.
- Haga girar los tubos durante 5 minutos a 500-1.000 xga 4 º C.
- Eliminar el sobrenadante, dejando sólo 20 a 30 lde RNAlater en el tubo junto con el sedimento. Para la bioquímica, almacenar las muestras lo más seco posible.
- No congelar las muestras en RNAlater inmediatamente; se almacenan a 4 ° CO / N (para permitir RNAlater penetre a fondo el tejido). El tejido puede almacenarse a -20 ° C para almacenamiento a largo plazo y más tarde se puede procesar para la interrupción del tejido y la extracción de pequeñas cantidades de ARN.
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Resultados
Progenitores pancreáticos dorsal E10.5 disociados y sembradas en 3D Matrigel recapitular el desarrollo del páncreas. Progenitores pueden ser más fácilmente seguidos con reporteros fluorescentes. En nuestro caso hemos utilizado un ratón transgénico que expresa una proteína GFP nuclear controlada por el promotor Pdx1 (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (Película 1) en ausencia de tamoxifeno y por lo tanto sin necesidad de activar NEUROG3 4 (Figura 2).
Con el ...
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Discusión
La producción a gran escala de células beta funcionales in vitro sigue siendo ineficaz 1. En este contexto desafiante, estudios de biología del desarrollo pueden ayudar a descifrar las señales exactas que se requieren para la diferenciación de las células beta funcionales. Este protocolo permite el mantenimiento, expansión y diferenciación de células progenitoras pancreáticas embrionarias in vitro. Esto incluye la formación de células beta productoras de insulina que no co-expresar otras hor...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado de forma secuencial por un Frontiers NCCR en la adjudicación piloto de Genética, Investigación de Diabetes Juvenil Fundación Beca 41-2009-775 y Grant 12-126875 de Det Frie Forskningsråd / Sundhed og Sygdom. Los autores agradecen el laboratorio Spagnoli por acoger la grabación de vídeo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15070-063 | Existencias mantenidas en -20 ° C |
| KnockOut Serum de repuesto (suplemento) | Gibco | 10828-028 | Stock mantenido en -20 ° C |
| 2-mercaptoetanol | Sigma Aldrich | 3148-25ML | Stock mantenido en 4 & deg; C |
| Acetato de miristato de forbol (PMA) | Calbiotech | 524400-1MG | Stock mantenido en -20 ° C |
| Y-27632 (inhibidor de ROCK) | Sigma Aldrich | ab120129 | Stock mantenido a -20 °C. ¡Atención! La estabilidad/origen es una fuente frecuente de problemas. |
| EGF | Sigma Aldrich | E9644-2MG | Stock mantenido en -80 ° C |
| R-espondina 1 humana recombinante | R& D | 4645-RS-025/CF | Existencias mantenidas a -80 ° C |
| Ratón recombinante R-espondina 1 | R& D | 3474-RS-050 | Existencias mantenidas en -80 ° C |
| FGF1 humano recombinante (aFGF) | R& D | 232-FA-025 | Existencias mantenidas a -80 ° C - no incluir para aumentar la producción de células beta |
| Heparina (Liquemina) | Drossapharm | Stock mantenido en 4 & deg; C | |
| FGF10 humano recombinante | R& D | 345-FG-025 | Existencias mantenidas en -80 ° C |
| DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15070-063 | Existencias mantenidas en -20 ° C |
| B27 x50 (suplemento) | Gibco | 17504-044 | Existencias mantenidas en -20 ° C |
| FGF2 humano recombinante (bFGF) | R& D | 233-FB-025 | Existencias mantenidas en -80 ° C |
| Matrigel | Corning | 356231 | Stock mantenido en -20 ° C |
| Tripsina 0.05% | Gibco | 25300-054 | Existencias mantenidas en 4 ° C |
| RNAlater - Reactivo estabilizador de ARN | Qiagen | 76104 | Tienda en RT |
| Dispase | Sigma Aldrich | D4818-2MG Concentración de | trabajo: 1,25 mg/ml. Stock mantenido a -20 ° C |
| BSA para la reconstitución | Milipore | 81-068 | Para la reconstitución de citocinas - stock mantenido a -20 ° C |
| Suero fetal de ternera (FCS) | Gibco | 16141079 | Stock mantenido en -20 ° C |
| Bandejas MicroWell de 60 pocillos | Sigma Aldrich | M0815-100EA | |
| Placas de 4 pocillos | Thermo Scientific | 176740 | |
| Placas de 95 pocillos Fondo F | Greiner Bio | 6555180 | |
| Glas Ibidi | 81158 | ||
| Micropipetas de vidrio de eliminación Microscopio | |||
| Cell® estación de imagen (soporte Olympus IX81 invertido motorizado) equipado con una cámara Hamamatsu ORCA ER B7W y el Ludin Cube and Box. Stand Leica DMI6000 B rodeado por un cubo y una caja Ludin, equipado con una cámara Leica DFC365 FX y la interfaz de comandos del software AF6000 Expert/Matrix. | |||
| Objetivo | Olympus UPLAN FL NA 0.30 aire 9.50 mm 10X larga distancia; Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 aire 11.0 mm 10X larga distancia |
Referencias
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