El método de cultivo en tres dimensiones se describe en este protocolo recapitula el desarrollo del páncreas a partir de progenitores páncreas de ratón embrionarias dispersas, incluyendo su expansión sustancial, diferenciación y morfogénesis en un órgano ramificada. Este método es susceptible de formación de imágenes, la interferencia funcional y la manipulación del nicho.
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Artículo de método
In Vitro Páncreas Organogenesis de dispersos embrionarios de ratón Progenitores
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El páncreas es un órgano esencial que regula la homeostasis de la glucosa y segrega enzimas digestivas. La investigación sobre la embriogénesis del páncreas ha llevado al desarrollo de protocolos para producir células pancreáticas a partir de células madre 1. Todo el órgano embrionario puede cultivarse en múltiples etapas de desarrollo 2-4. Estos métodos de cultivo han sido útiles para probar fármacos y para obtener imágenes de los procesos de desarrollo. Sin embargo, la expansión del órgano es muy limitada y la morfogénesis no se recapitula fielmente ya que el órgano se aplana.
Proponemos condiciones de cultivo tridimensionales (3D) que permiten la expansión eficiente de progenitores pancreáticos embrionarios de ratón disociados. Mediante la manipulación de la composición del medio de cultivo es posible generar esferas huecas, compuestas principalmente por progenitores pancreáticos que se expanden en su estado inicial, o bien, organoides complejos que progresan a progenitores expansivos más maduros y se diferencian en células endocrinas, acinares y ductales y que espontáneamente se autoorganizan para parecerse al páncreas embrionario.
Demostramos aquí que el proceso in vitro recapitula muchos aspectos del desarrollo natural del páncreas. Este sistema de cultivo es adecuado para investigar cómo las células cooperan para formar un órgano reduciendo su complejidad inicial a unos pocos progenitores. Se trata de un modelo que reproduce la arquitectura 3D del páncreas y que, por tanto, es útil para estudiar la morfogénesis, incluida la polarización de las estructuras epiteliales y la ramificación. También es apropiado evaluar la respuesta a las señales mecánicas del nicho, como la rigidez y los efectos sobre la tensegridad de la célula.
Introducción
Cultivo de órganos constituye un modelo útil que llena los huecos existentes entre la complejidad y relevancia en las investigaciones in vivo y la simulación conveniente pero aproximada de modelos de línea celular. En el caso del páncreas, no hay una línea de células perfectamente equivalente a progenitores páncreas aunque no se transforman líneas celulares que simulan células endocrinas y exocrinas. Todo el páncreas adulto no puede ser cultivado; aislados islotes endocrinos pueden mantenerse durante semanas sin la proliferación celular y rodajas de tejido se pueden mantener in vitro para algunas horas 5. Cultura páncreas embrion....
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Protocolo
Este protocolo tiene como objetivo crecer organoides pancreáticas derivadas de E10.5 murino disociaron células epiteliales pancreáticas.
El protocolo requiere la aprobación ética para la experimentación animal.
1. Disección de dorsal de páncreas Bud de E10.5 embriones de ratón
- Medio esencial Sacrificar los ratones oportuna embarazadas en el día embrionario (E) 10,5, abrir el abdomen con un par de tijeras, retire los dos cuernos uterinos y colocarlos en un plato de Petri de 10 cm llena con tampón fosfato frío salino (PBS) o modificado por Dulbecco (DMEM) se mantuvo en hielo. El experimento total desd....
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Resultados
Progenitores pancreáticos dorsal E10.5 disociados y sembradas en 3D Matrigel recapitular el desarrollo del páncreas. Progenitores pueden ser más fácilmente seguidos con reporteros fluorescentes. En nuestro caso hemos utilizado un ratón transgénico que expresa una proteína GFP nuclear controlada por el promotor Pdx1 (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (Película 1) en ausencia de tamoxifeno y por lo tanto sin necesidad de activar NEUROG3 4 (Figura 2).
Con el .......
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Discusión
La producción a gran escala de células beta funcionales in vitro sigue siendo ineficaz 1. En este contexto desafiante, estudios de biología del desarrollo pueden ayudar a descifrar las señales exactas que se requieren para la diferenciación de las células beta funcionales. Este protocolo permite el mantenimiento, expansión y diferenciación de células progenitoras pancreáticas embrionarias in vitro. Esto incluye la formación de células beta productoras de insulina que no co-expresar otras hor.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado de forma secuencial por un Frontiers NCCR en la adjudicación piloto de Genética, Investigación de Diabetes Juvenil Fundación Beca 41-2009-775 y Grant 12-126875 de Det Frie Forskningsråd / Sundhed og Sygdom. Los autores agradecen el laboratorio Spagnoli por acoger la grabación de vídeo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15070-063 | Existencias mantenidas en -20 ° C |
| KnockOut Serum de repuesto (suplemento) | Gibco | 10828-028 | Stock mantenido en -20 ° C |
| 2-mercaptoetanol | Sigma Aldrich | 3148-25ML | Stock mantenido en 4 & deg; C |
| Acetato de miristato de forbol (PMA) | Calbiotech | 524400-1MG | Stock mantenido en -20 ° C |
| Y-27632 (inhibidor de ROCK) | Sigma Aldrich | ab120129 | Stock mantenido a -20 °C. ¡Atención! La estabilidad/origen es una fuente frecuente de problemas. |
| EGF | Sigma Aldrich | E9644-2MG | Stock mantenido en -80 ° C |
| R-espondina 1 humana recombinante | R& D | 4645-RS-025/CF | Existencias mantenidas a -80 ° C |
| Ratón recombinante R-espondina 1 | R& D | 3474-RS-050 | Existencias mantenidas en -80 ° C |
| FGF1 humano recombinante (aFGF) | R& D | 232-FA-025 | Existencias mantenidas a -80 ° C - no incluir para aumentar la producción de células beta |
| Heparina (Liquemina) | Drossapharm | Stock mantenido en 4 & deg; C | |
| FGF10 humano recombinante | R& D | 345-FG-025 | Existencias mantenidas en -80 ° C |
| DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15070-063 | Existencias mantenidas en -20 ° C |
| B27 x50 (suplemento) | Gibco | 17504-044 | Existencias mantenidas en -20 ° C |
| FGF2 humano recombinante (bFGF) | R& D | 233-FB-025 | Existencias mantenidas en -80 ° C |
| Matrigel | Corning | 356231 | Stock mantenido en -20 ° C |
| Tripsina 0.05% | Gibco | 25300-054 | Existencias mantenidas en 4 ° C |
| RNAlater - Reactivo estabilizador de ARN | Qiagen | 76104 | Tienda en RT |
| Dispase | Sigma Aldrich | D4818-2MG Concentración de | trabajo: 1,25 mg/ml. Stock mantenido a -20 ° C |
| BSA para la reconstitución | Milipore | 81-068 | Para la reconstitución de citocinas - stock mantenido a -20 ° C |
| Suero fetal de ternera (FCS) | Gibco | 16141079 | Stock mantenido en -20 ° C |
| Bandejas MicroWell de 60 pocillos | Sigma Aldrich | M0815-100EA | |
| Placas de 4 pocillos | Thermo Scientific | 176740 | |
| Placas de 95 pocillos Fondo F | Greiner Bio | 6555180 | |
| Glas Ibidi | 81158 | ||
| Micropipetas de vidrio de eliminación Microscopio | |||
| Cell® estación de imagen (soporte Olympus IX81 invertido motorizado) equipado con una cámara Hamamatsu ORCA ER B7W y el Ludin Cube and Box. Stand Leica DMI6000 B rodeado por un cubo y una caja Ludin, equipado con una cámara Leica DFC365 FX y la interfaz de comandos del software AF6000 Expert/Matrix. | |||
| Objetivo | Olympus UPLAN FL NA 0.30 aire 9.50 mm 10X larga distancia; Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 aire 11.0 mm 10X larga distancia |
Referencias
- Pagliuca, F. W., Melton, D. A. How to make a functional beta-cell. Development. 140, 2472-2483 (2013).
- Percival, A. C., Slack, J. M. Analysis of pancreatic development using a cell lineage label. Exp Cell Res. 247, 123-132 (1999).
- Attali, M., et al.
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Reimpresiones y permisos
