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Artículo de método

Reducción de gravedad Demostraciones entorno de hardware de un prototipo miniaturizado citómetro de flujo y Compañero Microfluidos Tecnología de mezcla

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DOI:

10.3791/51743

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13 de noviembre de 2014

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1DNA Medicine Institute, 2Harvard Medical School, 3NASA Glenn Research Center, 4ZIN Technologies

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Diagnósticos sanguíneos vuelo espacial necesitan innovación. Pocas manifestaciones han sido publicados ilustrando en vuelo, la tecnología de diagnóstico de salud de gravedad reducida. Aquí presentamos un método para la construcción y operación de un banco de pruebas de vuelo parabólico para un diseño de la citometría de flujo en el punto de atención de prototipo, con componentes y estrategias de preparación adaptables a otras configuraciones.

Resumen

Hasta hace poco, se recogieron muestras de sangre de los astronautas durante el vuelo, transportados a la Tierra en el transbordador espacial, y se analizaron en los laboratorios terrestres. Si los seres humanos son a viajar más allá de la órbita baja de la Tierra, una transición hacia el espacio listo, punto-de-cuidado se requiere (POC) de pruebas. Este tipo de pruebas tiene que ser integral, fácil de realizar en un ambiente de gravedad reducida, y no afectada por las tensiones de lanzamiento y el vuelo espacial. Dispositivos POC Innumerables han sido desarrollados para imitar homólogos a escala de laboratorio, pero la mayoría tienen aplicaciones estrechas y pocos tienen uso demostrable en un ambiente reducido la gravedad en vuelo. De hecho, las manifestaciones de los diagnósticos biomédicos en gravedad reducida se limitan por completo, por lo que la elección de los componentes y ciertos desafíos logísticos difícil acercarse al tratar de probar la nueva tecnología. Para ayudar a llenar el vacío, presentamos un método modular para la construcción y operación de un dispositivo de diagnóstico de sangre prototipo y su p asociadoarabolic banco de pruebas de vuelo que cumple con las normas para las pruebas de vuelo a bordo de un vuelo parabólico, aviones reducido la gravedad. El primer método se centra en el montaje de equipo de perforación, pruebas en vuelo reducido la gravedad de un citómetro de flujo y un chip de microfluidos mezcla compañero. Los componentes son adaptables a otros diseños y algunos componentes personalizados, tales como un cargador de muestras microvolumen y la micromezclador pueden ser de particular interés. El método entonces enfoque cambia a la preparación del vuelo, ofreciendo pautas y sugerencias para prepararse para una prueba de vuelo con éxito en lo que respecta a la formación de los usuarios, el desarrollo de un procedimiento operativo estándar (SOP), y otras cuestiones. Por último, se describen en vuelo los procedimientos experimentales específicas a nuestras manifestaciones.

Introducción

La insuficiencia de los diagnósticos de salud en el espacio listo actuales presenta un factor limitante para profundizar la exploración espacial tripulada. Diagnóstico necesitan ser integral, fácil de usar en gravedad reducida y relativamente poco afectada por las tensiones de lanzamiento y el vuelo espacial (por ejemplo, altas fuerzas G, la vibración, la radiación, los cambios de temperatura y presión de la cabina cambios). Los avances en las pruebas de punto de atención (POCT) pueden traducirse en soluciones efectivas de vuelo espacial a través del uso de las muestras de pacientes más pequeños (por ejemplo, un pinchazo en el dedo), fluidos más simples y de menor tamaño (es decir, de microfluidos), y la reducción de los requerimientos de energía eléctrica, entre otros ventajas. La citometría de flujo es un enfoque atractivo para POC en el espacio debido a la amplia utilidad de la tecnología, incluyendo hacia el recuento de células y cuantificación de biomarcadores, así como la miniaturización potencial significativo. Anterior citómetros de flujo en el espacio relevante incluyen la 'efic embalaje nucleariency '(NPE) instrumento que utiliza la fluorescencia de arco de la lámpara simultánea inducida y volumen electrónico (Coulter volumen) de medición 1-4, un relativamente pequeño flujo de sobremesa citómetro de representación de la' primera generación de flujo en tiempo real de datos de citometría durante gravedad cero '5, un 'microflujo sin vaina citómetro' capaz de 4 y 5 parte de glóbulos blancos (WBC) recuento diferencial utilizando pretratado 5 l muestras de sangre entera de 6-9, y un 'fibra óptica basada en' citómetro de flujo recientemente probado a bordo en el Internacional Estación Espacial 10.

La evaluación de la tecnología de diagnóstico para aplicaciones espaciales potenciales se realiza normalmente a bordo de aeronaves en gravedad reducida que utilizan una trayectoria de vuelo aproximadamente parabólica para simular un nivel deseado de ingravidez (por ejemplo, gravedad cero, marciana-gravedad) 11. La evaluación es un reto porque las oportunidades de vuelo son limitados, repetventanas cortas sitivos de la microgravedad puede hacer que sea difícil evaluar metodologías o procesos que normalmente requieren períodos ininterrumpidos más largos de 20 a 40 segundos, y manifestaciones pueden requerir equipo adicional no utilizado fácilmente en vuelo 12-15. Por otra parte, las manifestaciones anteriores de tecnologías de diagnóstico in vitro (IVD) usados ​​en, o diseñados para, gravedad reducida son limitadas y mucho trabajo permanece inédito. Además de los citómetros de flujo anteriormente, otros IVD-tecnologías espaciales relevantes descritos en la literatura incluyen un dispositivo de tinción de sangre entera para aplicaciones de inmunofenotipaje 16, un sistema automatizado de cámara basado en citómetro de 12, un analizador clínico de mano para potenciometría integrado, amperometría, y Conductometría 12,17, un dispositivo de microfluidos 'T-sensor' para la cuantificación del analito que se basa en una mezcla basada en la difusión y la separación 18, y una rotación 'laboratorio en un CD' plataforma de diagnóstico 19,20. Los recién llegados a las pruebas de gravedad reducida también pueden mirar a demostraciones de vuelo parabólico no relacionadas con el diagnóstico in vitro cuando se trata de hacer de la evaluación dispositivo posible (o averiguar lo que es posible). Las manifestaciones de otros experimentos médicos o biológicos anterior con la preparación del vuelo, las estrategias durante el vuelo, y el equipo de pruebas de vuelo bien documentado se incluyen en la Tabla 1 15, 21-35. Estos pueden ser de carácter informativo debido a la inclusión de tareas manuales en vuelo, el uso de equipo especializado, y la contención experimental.

Categoría Ejemplos
Atención médica de emergencia La intubación traqueal (laringoscopio guiada, en maniken) 21, de soporte vital cardíaco (cerdos anestesiados) 22
La atención quirúrgica La cirugía laparoscópica (vídeo simula 23, en cerdos anestesiados 24,25)
Imagen médica o evaluación fisiología Ultrasonido con cámara de presión negativa inferior del cuerpo 26, medidor de flujo Doppler (montado cabeza) 27, monitor de la presión venosa central 28
Equipos biológica especializada Lector de microplacas (y la caja en vuelo guante) 29, sistema de control de temperatura para los experimentos del ciclo celular 30, microscopio (campo claro, contraste de fase y fluorescencia multicanal capaz) 15, capilarunidad de electroforesis acoplado al microscopio de vídeo 31
Otro Recolección de plantas con fórceps 32, contenida ratas 33,34 y 35 de peces para la observación

Tabla 1. Antena vuelo de demostración con ejemplos bien descrito Métodos / Experimentos

Para ampliar los ejemplos anteriores y proporcionar un mayor conocimiento de exitosas demostraciones en vuelo, estamos presentando un procedimiento modular y adaptable para la construcción y operación de un prototipo citómetro de flujo con la tecnología de mezcla de microfluidos relacionada como parte de un banco de pruebas de vuelo parabólico. La plataforma permite a las manifestaciones de la carga de la muestra, la mezcla de microfluidos, y la detección de las partículas fluorescentes, y se puso a prueba a bordo de la NASA de 2010 facilitó el acceso a Medio Ambiente Espacial (FAST) flig parabólicaHTS, volados del 29 de septiembre al 1 de octubre de 2010. Estas demostraciones tirar desde el principio, medio y final, respectivamente, de un potencial de flujo de trabajo de dispositivo en el que se cargan, diluidos o mezclados con reactivos de muestras de sangre por punción capilar-tamaño, y se analizaron por medio de óptica detección. Escalar un citómetro de flujo en una unidad compacta requiere innovación y la selección cuidadosa parte. Personalizado y componentes fuera de la plataforma se usan aquí, elegido como mejores aproximaciones iniciales de elecciones finales de componentes, y pueden ser adaptables a los designios de otros innovadores. Siguiendo un esquema de opciones de componentes prototipo, la configuración se describe en una estructura de soporte que sirve de esqueleto para el montaje de perforación. Componentes del prototipo se asignan lugares, asegurados, y acompañados por los componentes adicionales necesarios para la experimentación con éxito. La atención se desplaza a procedimientos más abstractas que implican un procedimiento estándar de operación (SOP) el desarrollo, la capacitación y otros aspectos logísticos. Por último, los procedimientos de demostración-específica sondescrito. Las estrategias que aquí se describen y las opciones de apoyo a los componentes del equipo de perforación (por ejemplo, un microscopio, caja de acrílico, etc.), aunque implementado aquí por prototipo específico, hablan a las cuestiones generales y desafíos relevantes para probar cualquier equipo de diagnóstico en sangre en un ambiente de gravedad reducida .

En los vuelos de 2010, dos lunar-gravedad (el logro de aproximadamente 1/6 gravedad de la tierra) y dos vuelos de microgravedad fueron programadas a través de 4 días, aunque en última instancia, estos fueron reprogramados en 3 días. Las manifestaciones se llevaron a cabo a bordo de un avión de pasajeros del jet modificado de gestión privada, de fuselaje estrecho 36. Cada vuelo, a condición 30-40 parábolas, cada uno produciendo aproximadamente 20 seg de alta gravedad (aproximadamente 1,8 g), seguido de 20-25 seg de las condiciones de gravedad reducida. Después se ejecuta la mitad de las parábolas, el avión se detuvo por un período de alrededor de 5-10 minutos en el nivel de vuelo para que el avión para dar la vuelta y regresar hacia el lugar de aterrizaje, mientras que performing el resto de las parábolas.

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Protocolo

Las muestras de sangre humana utilizadas en este protocolo se recogieron con la aprobación del IRB utilizando protocolos mínimamente invasivos (ver Agradecimientos).

1. Aparejo Asamblea

  1. Ensamble los componentes del prototipo (fluídica, el control, la electrónica de adquisición de datos / ópticos) para un flujo sencillo sistema de citometría para ser utilizado en condiciones de gravedad reducida
    1. Preparar un sistema de presión con el mínimo peso y el poder necesita para conducir fluidos del sistema
      1. Conectar una bomba de aire en miniatura a un sensor de presión diferencial.
      2. Para mantener una presión de conducción constante, controlar la salida de la bomba con ancho de pulso de modulación y un ciclo de trabajo regulada mediante un controlador proporcional-integral-derivado en el software de control personalizado (etapa 1.1.7).
    2. Prepare un recipiente fuente de fluido que se puede cargar sin atrapar aire (véase el paso 3.4)
      1. Colocar un vial de plástico rígido (Figura 1 A) con un diaphra látexgm, firmemente la tapa asegurable, y el tubo de entrada de aire en la base vial (conexión sellada con adhesivo óptico).
      2. Asegúrese de que la bomba presuriza el vial sin aire o fugas de líquido, comprimiendo el diafragma para conducir el flujo de fluido fuera de la tubería de salida de la tapa.
    3. Diseño de un contenedor de desechos de fluidos para recoger los residuos sin la construcción de una contrapresión que comprometer el flujo
      1. Utilice un vial de pegada, dentro de una ampolla de diseño (Figura 1B) de doble contención.
      2. Tapar los viales con una ventana de esponja de espuma asegurado que atrapa los residuos flotantes, pero permite la igualación de presión de aire con el ambiente de la cabina.
    4. Hacer un cargador de muestras para su uso en gravedad reducida
      1. Máquina y armar un diseño de abrazadera de resorte con rieles guía (Figura 1C) de tal manera que abrazaderas de forma fiable un capilar vaina-montado entre dos juntas tóricas en la línea de fluido. Asegúrese de que conserva el volumen de la muestra cuando se carga, acomoda sistema pdesescarchado cuando no está insertada una muestra, y evita la introducción de burbujas errante.
      2. Asegúrese de que en ausencia de un capilar, los muelles presionan las juntas tóricas juntos para completar la línea de fluido y permitir el cebado sin fugas (Figura 1D, izquierda).
    5. Diseñar un micromezclador que no se basa en subcomponentes mecánicos accionados a funcionar
      1. Concebir un micromezclador espiral vórtice de dos de entrada (Figura 1E) que alcanza la advección caótica necesario superar flujo laminar dentro de los canales de microfluidos. Este diseño ofrece todo el fluido que entra aguas abajo de manera que una carrera de la muestra no afecta a la siguiente.
      2. Para mayor comodidad, fabricar diseño elegido utilizando el método (Figura 1F) de rápido prototipo de polidimetilsiloxano (PDMS). Utilizar una fotomáscara diseñado asistido por ordenador en dos dimensiones impresos en 20.000 dpi para fabricar el necesario SU-8 molde en una instalación de salas blancas 37.
        NOTA: Utilice una modicado de calibre 23 en condiciones de un molino de perforación vertical para perforar agujeros en las ensenadas, vórtice, de entrada, detección y puntos de salida de la detección, y una lupa de mano para ayudar a dirigir la aguja. Recorta las fichas de los PDMS utilizando una hoja de afeitar y encajar los agujeros con 0,5 pasadores "huecos de acero que sobresale de la cara no moldeado posterior de la viruta. Conecte la clavija de salida de caracol central para el pin de entrada del canal de detección de uso de tubo capilar.
      3. Chip de Limpiar a fondo con etanol y se seca la superficie moldeada con cinta adhesiva mate. Utilice una jeringa vacía a soplar el etanol de los pasadores. Tratar de chips PDMS y una cubierta de vidrio prístina dentro limpiador de plasma y unirlos a los 10 segundos, aplicando una ligera presión, comprobando inmediatamente por microscopía de luz que el chip se presiona completamente, sin comprometer la permeabilidad del canal.
    6. Montar un bloque óptico en miniatura tamaño de la palma de detectar las partículas que fluyen individuales
      1. El diseño de la figura 2AB es adecuado para dos colores epifluorescence iluminación láser y detección, y utiliza un PDMS recta canales (120 por 200 micras) de células de flujo para la conveniencia.
      2. Bloque de montaje (Figura 2C), utilizando componentes óptico-disponibles en el mercado y alinear los módulos de conteo de fotones sola fibra acoplada.
    7. La electrónica y el software de diseño para el control de dispositivos y de adquisición de datos
      1. Para una mayor comodidad en la creación de prototipos temprano, utilizar piezas soldadas a mano conectados a la adquisición de datos (DAQ) tarjetas (Figura 2D).
      2. Código y un programa de software a medida (ejemplo en Figura 2E) para operar los dispositivos de los equipos de perforación y sincronizar todos los datos.
  2. Los componentes adicionales (no formalmente parte del prototipo)
    1. Incorporar un acelerómetro de 3 dimensiones (Figura 2D, izquierda) y un medidor de caudal (no en la foto). Un acelerómetro está presente a bordo de la aeronave, pero (probablemente) no puede ser directamente sincronizado con oTher registraron datos.
  3. Combinación de energía eléctrica
    1. Un mecanismo para el cierre de la electrónica rápida y completa (necesario por razones de seguridad en los vuelos reducida gravedad)
      1. Conecte una sola tira de la energía (con un solo botón I / O) para el panel de distribución de energía de la aeronave (120 VAC 60 Hz).
      2. Retire la batería del portátil y ordenador portátil fijado para operar a través de cable de alimentación solo.
    2. Alimentación para todos los dispositivos
      1. Alimentar directamente el portátil (retirado de la batería), un microscopio de luz, y dos detectores de fotones usando regleta.
      2. Dispositivos de la energía restante a través de tarjetas de adquisición de datos USB conectados a las baterías de un portátil o utilizando.
  4. Diseño rig-Vuelo listo
    1. Consideraciones para un desempeño exitoso en vuelo
      1. El espacio total disponible se limita a un área más pequeña de lo previsto una manifestación similar en el suelo (Figura 3A). Considere el espacio total disponible y la forma en que sritmo se dividirá entre el espacio experimental equipo de perforación (incluyendo los componentes más allá de los formalmente parte del prototipo) y el espacio de usuario que rodea a la plataforma. Plataformas experimentales varían en términos de posicionamiento hacia delante o hacia atrás, pero esto no afecta en gran medida el espacio operacional disponible (o en vuelo de la física).
      2. Determine qué componentes se accede de manera más apropiada en un pie, de rodillas, o la altura del suelo, así como teniendo en cuenta los componentes que más se beneficiarán de la protección alcanzado dentro de una estructura de soporte.
    2. Estructura de soporte del aparejo
      1. Obtener o construir un bastidor de equipo vertical que cumple con las necesidades de diseño considerado, contiene todos los componentes, permite a diferentes niveles verticales de organización, soporta aceleraciones de vuelo, y con seguridad se sujeta al piso de la cabina de aviones previsto.
      2. Asignar componentes a niveles dentro del bastidor del equipo (Figura 3B): un nivel superior para colocar el ordenador portátil, un nivel medio-estante para csubcomponentes prototipo ontain y un nivel de piso para contener toallitas extras, guantes, y un contenedor de residuos varios.
      3. Concebir estructuras adicionales dentro del rack para adaptarse a diferentes niveles deseados. Implementar vigas de soporte en 'altura mid' celebrar una 2 pies. Por 2 pies. Placa protoboard microscopio para atornillar los componentes del equipo de perforación, y vigas de apoyo de aproximadamente 2 pies más altos de apoyo a un canal portátil de vuelo aprobado.
      4. Dentro de niveles verticales, determinar disposición óptima de componentes, teniendo en cuenta las limitaciones de accesibilidad incurridos debido a la presencia de otros componentes, así como debido a la posibilidad de posición / orientación de la propia plataforma a bordo de un vuelo (por ejemplo, 4ª lado de una plataforma de cuadrados pueden estar cerca de la pared de las aeronaves, dejando sólo 3 lados accesible).
        NOTA: Las correas de las piernas para asegurar los operadores de las pruebas están a una distancia fija de la plataforma y pueden no estar disponibles en todos los lados.
      5. Sobre la base de estas determinaciones, dicionar la placa protoboard en 4 cuadrantes (Figura 3C), la colocación de lugares dedicados para la electrónica y el bloque óptico hacia la pared aviones, y el cargador de la muestra y el chip de microfluidos hacia el espacio de la cabina.
  5. Obtención de prototipos, la contención, y la configuración de visualización
    1. La electrónica del sistema
      1. Diseño, cortado con láser, y montar una caja de acrílico personalizado (Figura 2D) para contener las tarjetas DAQ (atado) y las juntas soldadas a mano (atornillado a la pared de la caja).
      2. Utilizar una puerta giratoria para facilitar el acceso (fijado en vuelo con cierre de tela de gancho-y-lazo) y agujeros de salida para cables y alambres de USB.
    2. Cargador de muestras
      1. Fabricar una caja de acrílico personalizado 'guante' (Figura 4A) con orificios de acceso brazo para proporcionar un espacio cúbico en el que realizar la demostración cargador (Figura 4C) sin riesgo de contaminación de la cabina de vuelo.
      2. Alimentar la tubería hacia y desde el cargador a través de pequeños agujeros circulares en el lado de la caja.
    3. Micromezclador
      1. Adaptar el equipo utilizado en el suelo. Perno de un estereomicroscopio (Figura 4B) a la placa de tablero y encajar con un soporte de chip de acrílico de encargo, también atornillada a la placa.
      2. Colocar una cámara CCD USB ​​al ocular del microscopio y conectarlo a la computadora portátil (Figura 4D) para guardar video sincronizado con otros datos (la gravedad, la presión de conducción, y el caudal).
    4. Bloque óptico
      1. Fabrique una caja de acrílico personalizado opaco (Figura 4A, derecha) para cubrir el bloque, protegiéndolo de la luz ambiente y el control de los peligros del láser.
      2. Utilizar un filtro de 'ventana' óptico para verificar la función de láser de forma segura.
    5. Laptop
      1. Atornille una bandeja portátil vuelo aprobado a las vigas de apoyo dentro de la estructura de soporte.
      2. Uso hook-y-lazo de sujeción para asegurar los cables USB a lo largo de la arquitectura rack.
  6. Dentro de la aplicación de demostración de vuelo
    1. Intervenciones simples para proceder a través de demostraciones
      1. Incorporar componentes adicionales que eliminar exigen ajustes de tubos manuales en vuelo u otras acciones que requieren destreza significativa o podría correr el riesgo con fugas de fluidos en el medio ambiente de la cabina.
        1. Custom-máquina e integrar un colector de presión (Figura 5A) que consta de un cilindro de aluminio perforado y roscado para adaptarse a una rosca en la aguja adaptador luer que sirve como una entrada de presión. Perforar agujeros más pequeños alrededor de la circunferencia para adaptarse a las juntas tóricas y tubo capilar como puntos de venta. Utilice para presionar a varios viales de origen simultáneamente.
        2. Montar un panel de válvulas de solenoide de tres vías (Figura 5B) controlados por interruptores MOSFET tándem (Figura 5C) conectados a una tarjeta de adquisición de datos. Adaptar tubo capilar para adaptarsepuertos de la válvula. Se utiliza para controlar el flujo de fluido desde los diferentes viales.
      2. Software de Programa de proceder a través de demostraciones (Figura 6), utilizando intervenciones de un solo botón (por ejemplo, un solo clic en el ordenador portátil).
    2. Control manual de copia de seguridad
      1. Añadir abrazaderas de diapositivas para arreglar para permitir un poco de control manual sobre los fluidos, tal vez, si la tubería inesperadamente necesita ser desconectado y reconectado durante el vuelo.
      2. Incluya suficientes toallitas de limpieza en la sección perchero de pie en caso de fugas en vuelo.
  7. Vuelo perturbación de preparación: Listo para el sistema de posibles fuerzas bruscas sacudidas, vibraciones, o colisión de pasajeros en vuelo.
    1. Estabilización de alineación
      1. Aplique epoxi de secado rápido a los componentes alineados que están mal ajustado fácilmente, en particular componentes ópticos.
      2. Aplicar epoxi de grado industrial sobre el epoxi de secado rápido, así como para garantizar otra Componenct según sea necesario, incluyendo el accesorio de la cámara CCD para el ocular del microscopio.
    2. Pruebas de perturbación física
      1. Agite estructura de soporte plataforma con todos los componentes en su lugar.
      2. Compruebe la funcionalidad individuo componente después de someter la plataforma a la perturbación, componentes ópticos especialmente alineados.
    3. La gestión del riesgo de Pasajeros
      1. Aplicar relleno de espuma de áreas (esquinas, bordes) de la estructura de los equipos en rack vertical que podría perjudicar a un pasajero de vuelo que golpea accidentalmente en la plataforma (Figura 4C).
      2. Relleno seguro con cinta adhesiva de color negro.

2. Demostración Preparación y Logística

  1. En vuelos y equipo de tierra asignaciones de funciones
    1. Asignar operador (s) plataforma para llevar a cabo tanto en la configuración de perforación y todas las operaciones de práctica en vuelo. Hands-on operadores pueden visualizar mejor cuando configuración plataforma se ha completado.
    2. Asignar un lector para leer el SOP SOP en voz alta durante el entrenamiento y durante el vuelo. El proceso de lectura SOP durante el entrenamiento puede identificar puesta en escena incómoda o inoportuna.
    3. Asigne de apoyo en tierra para llevar a cabo la preparación de muestras y cualquier otra tarea de preparación que no implican directamente el equipo de perforación, minimizando la carga de tiempo a los operadores del equipo de perforación.
  2. Procedimiento operativo estándar inicial (SOP) desarrollo
    1. Escribe todas las medidas para incorporar previa al vuelo (día antes y la mañana antes), en vuelo, y los procedimientos posteriores al vuelo, utilizando sólo los equipos y materiales que estará disponible en el lugar de vuelo. Un bloque de 5 a 10 minutos de vuelo de avión de nivel puede estar disponible para los procedimientos de configuración de última hora antes del inicio de parábolas o en el punto a mitad de camino cuando el avión da la vuelta.
    2. Asignar procedimientos experimentales en vuelo a los números dedicados de parábolas, y señaló que las parábolas es probable que se separaron en un punto intermedio para permitir que el avión para dar la vuelta y regresar al aterrizajesitio, y que otro grupo puede solicitar el plano para nivelar mediados de experimento o un menor número de parábolas pueden ser volados de lo esperado.
    3. Concebir los procedimientos de demostración para reducir al mínimo el riesgo de peligro biológico más allá de la contención eficaz, evitando muestras biológicas reales cuando sea posible. Utilizar colorante alimenticio azul claveteado contando con bolas fluorescentes (Figura 1D) como una alternativa a la sangre durante la manifestación cargador de muestras.
  3. Formación Demostración
    1. Establecer un programa de entrenamiento suficiente para revisar completamente y refinar el SOP, así como generar datos de control de tierra a fondo para comparar con los datos de vuelo.
    2. Después de realizar SOP previa al vuelo, 'bloquear' el equipo de perforación en una habitación para simular la experiencia en vuelo, cortando el acceso a herramientas o materiales terrestres. Para el entrenamiento aún más estricto, marque una sección de la pista de la satisfacción de las dimensiones asignadas que estarán disponibles en el vuelo 32.
    3. Durante el entrenamiento, siga SOP eXactly, y usar un cronómetro para anunciar 20 a 30 parábolas seg, lo que indica la entrada y salida de gravedad reducida, así como un descanso parábola pleno vuelo.
    4. Incorporar SOP finalizados en horarios reales diarios de vuelo, dividiendo las actividades de "pre-vuelo" entre el día de vuelo y antes de que el vuelo del día.
    5. Entrenar para ocurrencias inesperadas en vuelo, incluido fuerzas repentinas que golpean la plataforma o el plano de repente nivelación en el medio de un experimento.
    6. Estabilidades de prueba de muestras y reactivos cuando se someten a un largo descanso (horas o más) entre los procedimientos previos al vuelo y durante el vuelo la actividad. Tenga en cuenta también que las temperaturas pueden ser significativamente mayores en la ubicación de vuelo.
    7. Entrene a varias personas como operadores primarios para operar con pericia el dispositivo durante el vuelo. Es impredecible que se enferma durante las parábolas, y un usuario determinado puede ser afectada en un vuelo y se enferman en otro.
  4. Equipos de tierra y apoyomateriales
    1. Montar una caja de herramientas para incluir componentes de copia de seguridad y el equipo necesarios para las reparaciones, incluyendo herramientas de mano, equipos de soldadura y pegamento / epoxi entre muchos otros artículos.
    2. Reúna la muestra y cantidades de reactivos más allá de lo que está destinado a ser utilizado durante los vuelos programados en caso inesperado aplazamiento vuelo tiene lugar después de una muestra o reactivo ya se ha alistado para el vuelo.
  5. Envío
    1. Envío necesarios para el transporte de la plataforma de instalación, equipo de tierra (herramientas, centrifugadoras, Pipetas, mezclador de vórtice, otros) y perecederos (células de la sangre, reactivos). Tener suficiente tiempo para recibir, inspeccionar, ensamblar, y el hardware de prueba para la campaña de vuelo.
    2. Aparejo Encase en todos los lados, excepto parte inferior utilizando el plástico de burbujas. Aparejo de la nave mediante un cuadro de cajón de madera de encargo, equipado internamente con almohadillas de espuma y material de choque.
    3. Buque de apoyo los equipos de tierra / herramientas en un recipiente rígido o en el pecho.
    4. Perecederos nave en 1 en aislados de espesor.caja de la espuma, que contiene hielo seco para los artículos que requieren de almacenamiento -20 ° C y el congelador paquete fresco para los artículos que requieran de 4 ° C de almacenamiento.
  6. Las pruebas de pre-vuelo
    Realizar pruebas de pre-vuelo en el lugar de vuelo para comprobar la funcionalidad de todos los componentes de varios días antes de los vuelos.
    Equipos de perforación de vuelos se pesan y grúa cargaron en el avión, y es probable que permanezcan en la aeronave durante la duración de la semana de vuelo.

3. Las demostraciones en vuelo

Las manifestaciones / experimentos se dividen entre dos denominaciones día ("Día A" y "Día B" más abajo). Un día se designa para la demostración y micromezcla Día B se designa por las manifestaciones de carga de detección de partículas y de la muestra.

  1. La preparación de muestras de tierra para demostraciones micromezclador (Día A solamente)
    1. Diluir 3 ml de colorante azul alimentos en 12 ml de 1x tampón fosfato salino (PBS).
    2. Diluir 3 ml de colorante de alimentos amarillo into 12 ml 1x PBS.
    3. Strain 15 ml de células rojas de la sangre comercialmente purificados.
      PRECAUCIÓN: Debido a que ningún método de prueba puede garantizar con un 100% de certeza la ausencia de un agente infeccioso, productos humanos derivados siempre deben manipularse como riesgos biológicos.
    4. Viales de muestra de carga (véase el paso 3.3) para cada muestra, además de un vial adicional que contiene sólo una solución salina.
  2. La preparación de muestras de tierra para la demostración bloque óptico
    1. Combine 60 l contar bolas fluorescentes con 14 ml de PBS 1x (4.3 granos / l) con 1% de Tween. Cargar en la muestra del vial.
      PRECAUCIÓN: Manipule todos los productos químicos con la precaución y el uso de equipo de protección personal (EPP).
    2. Diluir un 50 l pinchazo en el dedo muestra de sangre entera 100 veces con 1x PBS y añadir colorante SYTO 83 para [final] = 5 M. Ligeramente vórtice para mezclar. Incubar durante> 5 min a temperatura ambiente.
      PRECAUCIÓN: SYTO 83 colorante se disuelve en dimethylsulfoxide (DMSO), que se absorbe fácilmente a través de la piel. Puede ser irritante para los ojos, el sistema respiratorio y la piel. Manejar el uso de PPE.
    3. Muestra de células Centrífuga (a 2.300 g durante 4 min), pipetear el sobrenadante.
    4. Lave muestra de células teñidas mediante la adición de 1 ml 1x PBS, centrifugar a 2300 g durante 4 min pipeta el sobrenadante. Repita dos veces más.
    5. Volver volumen a 15 ml con PBS 1x para llegar a un 1 final: la dilución de 500 veces de stock comercial original. Células de la cepa y de carga en la muestra del vial.
  3. La preparación de muestras de tierra para la demostración cargador de muestras (Día B solamente)
    1. Preparar consumibles capilares para la demostración cargador de muestras por el corte de tubos capilares de micro-hematocrito en segmentos de 15 mm con una cuchilla de afeitar.
    2. Preparar la muestra para la demostración del cargador: Mezclar 250 ml de perlas stock fluorescentes con 250 l sin diluir colorante alimenticio azul (500 granos / l). Draw 250 l de muestra en dos jeringas de 1 ml, cada uno equipado con un ne punta romaedle que se grabó cerrada con cinta aislante.
  4. Cargar viales fuente de fluido
    1. Aplicar fresco, diafragma de látex sin polvo al vial (corte en el dedo de guante aceptable). Asegúrese de que el diafragma es lo suficientemente largo para extenderse desde el piso vial y doblar sobre el borde exterior superior. Deslice el anillo vial sobre la parte doblada.
    2. Coloque una pinza deslizante temporal en la tubería de salida de tapón que impida la expulsión de fluidos durante la inserción tapa.
    3. Antes de llenar el vial, presurizar negativamente el vial con una jeringa para expandir el diafragma. Vierta líquido a la parte superior del vial e inserte la tapa en un ángulo tal que no quede aire atrapado debajo de la tapa durante la colocación de la tapa (un poco de líquido se derrame). Eliminar brevemente pinza deslizante a la tubería de salida y la liberación prime presión ejercida por el colapso de la membrana.
  5. Preparar demostraciones del equipo de perforación
    1. Conecte y compruebe todas las conexiones de los tubos
    2. Enganche viales de origen en el sistema. Viales caber en un acry personalizadatitular vial lic y fijarlos con y cierre de gancho y bucle.
    3. Vacíe los residuos contenidos en frascos o contenedores.
    4. Compruebe el espacio en disco duro y software de demostración personalizada de inicio.
    5. Realizar fluidos del sistema procedimiento específico para cada manifestación de cebado.
    6. Intercambiar en nuevas baterías a cualquier dispositivo alimentado por batería (por ejemplo, acelerómetro).
    7. Agitar manualmente muestras de partículas fluorescentes.
    8. Ejecute breve experimento de prueba de pre-vuelo.
  6. Evite en vuelo cinetosis
    1. Toma prestados los medicamentos (escopolamina y dextroanfetamina, seguro y eficaz para la prevención de la enfermedad de movimiento durante el vuelo)
    2. Preste atención recomienda estrategias de posicionamiento del cuerpo durante el vuelo (por ejemplo, acuéstese sobre la espalda durante el aumento de la gravedad, con el cuerpo recto y la cabeza inclinada hacia adelante, y permitir que el cuerpo flote por sí solo durante la transición a la gravedad reducida). Si es posible, utilice varias parábolas temprana para adaptarse a los cambios de gravedad.
    3. Conserve una bolsa de vómito plástico de fácil acceso en un bolsillo delantero. El vómito puede ocurrir de repente y sin precedente náuseas.
  7. Posición operadores del equipo de perforación una vez en vuelo, se acercan espacio aéreo parábola dedicado. Proporcionar suficiente espacio para permitir que los operadores del equipo de perforación se acuesten durante intervalos de alta gravitación y permiten el acceso a correas de las piernas. Una vez que comienzan las parábolas, no se aplican las fuerzas fuertes en el cuerpo durante la gravedad reducida, ya que puede enviar el cuerpo demasiado rápido y algo peligrosamente.
  8. Realizar demostración mezclador de microfluidos (Día A solamente)
    1. Agitar manualmente vial de sangre antes de ejecución de prueba.
    2. Mezclar la sangre y solución salina en una proporción de 1: 1 a 1,5, 2, 3, 4, 5, y 6 psi, durante al menos 2 parábolas cada uno, la grabación de datos de vídeo sincronizadas con otras lecturas.
    3. Inyectar aire en la entrada de solución salina para probar si la arquitectura de canal voluntad atrapar una burbuja que podría evitar la mezcla óptima.
    4. Mezclar azul y amarillo colorantes alimentarios a las 1,5, 2, 3, 4, 5, y 6 psi durante al menos 2parábolas cada uno, de nuevo la grabación de datos sincronizados.
    5. Aplicar las abrazaderas deslizantes para fluidos del sistema cuando haya terminado para evitar una mayor producción de residuos.
    6. Compruebe la integridad de los datos antes de apagar la electrónica en caso de repetición de demostración que se requiere.
  9. Realizar bloque óptico y demostraciones Cargador de muestras (Día B solamente)
    1. Agitar manualmente muestras antes de ejecutar.
    2. Conduzca contar bolas fluorescentes a través del bloque óptico durante 3 parábolas. Lave el sistema con solución salina durante al menos 1 parábola entre tipos de muestras.
    3. Repita 3.9.2 para las partículas de hidrogel fluorescentes y glóbulos blancos.
    4. Comprobar los datos de las entidades que faltan que necesitan ser repetido antes de pasar a la demostración cargador de muestras.
    5. Comienza la grabación de demostración cargador muestra usando la grabadora de vídeo de alta definición.
    6. Cuando el avión entra reduce la gravedad, usar una jeringa de muestra para colocar una gota de la mezcla de colorantes de talón de conteo en una yema del dedo para simular una muestra pinchazo en el dedo. Utilice unirrealmente gran caída (Figura 1D) para poner a prueba los límites de mantener un dedo pinchazo en un dedo de la muestra durante la gravedad reducida.
    7. Utilice consumibles capilar para recoger la muestra (aproximadamente 10 l) del dedo y de la carga en el cargador capilar.
    8. Limpie muestra restante del dedo utilizando toallitas incluidos en la caja.
    9. Conducir la muestra en el sistema óptico para la detección.
    10. Repita las pruebas varias veces utilizando diferentes operadores.
    11. Comprobar los datos de las entidades que faltan que necesitan ser repetido antes de apagar la electrónica.
  10. Apagado después del vuelo
    1. Vaciar los residuos y disponer adecuadamente el uso de la etiqueta de riesgo biológico recipientes de contención, según sea necesario. Los residuos peligrosos puede requerir el envío de la instalación de aeronaves.
    2. Sistema de lavado a fondo, utilizando una jeringa de 5 ml cargado con agua para proporcionar una limpieza enérgica. Válvulas de descarga hacia atrás y adelante a través de los 3 puertos.
    3. Limpie cualquier lío utilizando toallitas con alcohol.
    4. Sistema vuelva a cebar para la próxima manifestación.

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Resultados

Los resultados representativos para la demostración micromezclador aparecen en la Figura 7, como se ve por la cámara CCD montada en el microscopio estereoscópico. Mezcla puede evaluarse visualmente en cualquier punto a lo largo de la espiral, así como en el canal de salida para los experimentos que involucran dos conjuntos de fluidos: sangre / solución salina y de colorante azul / amarillo. El análisis cuantitativo de las imágenes de dos dimensiones puede incluir la determinación de la uniformidad de so...

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Discusión

El método descrito aquí permitió demostración efectiva de los principales componentes de la tecnología (la carga de la muestra, de mezcla de microfluidos, y detección óptica) durante los 2010 RÁPIDOS vuelos parabólicos, con resultados comparables a pruebas en tierra. Los métodos de formación y SOP descritos aquí fueron particularmente eficaz, y ayudaron a iluminar herramientas y otro ser 'muletas' confiado en para demostraciones prácticas que no estarían disponibles a bordo del vuelo parabólico.

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Divulgaciones

Eugene Y. Chan, Candice Bae, y Julia Z. Sharpe son inventores de patentes de tecnología relacionados presentadas a través del Instituto de Medicina de ADN, una entidad comercial.

Agradecimientos

Desarrollo de hardware fue apoyado por los contratos NNX09CA44C y NNX10CA97C NASA SBIR. Análisis de los datos de las manifestaciones de bloques y cargador de muestras ópticas fue apoyado por la NASA Fase III NNC11CA04C Contrato. La colección de la sangre humana se realizó utilizando NASA IRB Protocolo # SA-10-008. Software de control / adquisición proporcionada a través del Programa de Becas de Dispositivos Médicos de National Instruments. Moldes para los microchips se realizaron en las instalaciones de microfabricación Johns Hopkins y el Centro Harvard para sistemas a nanoescala. Otto J. Briner y Lucas Jaffe (Instituto de Medicina del ADN) ayudaron en el montaje en rack durante el verano de 2010. El personal de vuelo de la NASA de vídeo proporcionado imágenes de vídeo durante la semana de vuelo. Carlos Barrientos (Instituto de Medicina del ADN) proporcionó fotografía y cifra la asistencia. Un agradecimiento especial a la facilitó el acceso a la tecnología espacial para el Medio Ambiente 2010 del programa, la Oficina de la NASA Gravedad Reducida, la División de Contramedidas Adaptación Humana y del Centro de Investigación Glenn de la NASA,ZIN Technologies, y el Programa de Investigación en Seres Humanos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Micro bomba de aireSmart Products, Inc.AP-2P02A Presiónmáxima = 6.76 psi; 1.301" x 0.394" x 0.650", 0.28 oz (8 g); disponible directamente en Smart Products
Sensor de presión diferencialHoneywell International, Inc.ASDX015D44RRango  de  0-15 psi; 0.974" x 0.550" x 0.440", 0.09 oz (2.565 g); los proveedores incluyen Digi-Key y Mouser Electronics
Frasco de plástico rígido (tamaño pequeño)Loritz & Asociados, Inc.55-05Poliestireno; ID 0,81" (20,6 mm), IH 2,06" (52,4 mm); disponible directamente de LA Container Inc.; producto similar disponible en Dynalab Corp.
guantes de examen de látexdynarex corporation2337Dedo medio utilizado para el diafragma de látex en el vial de fuente de fluido. Otras marcas (p. ej., Aurelia ®   Vibrante ™) Aceptable.
Pegamento ópticoNorland ProductsNOA 88Adhesivo de baja desgasificación; disponible directamente en Norland; También disponible en Edmund Optics Inc.
Electroválvulas de 3 víasThe LEE CompanyLHDA0531115HVálvulas de gas, pero pueden funcionar con líquido; 1.29" L, 0.28" D. Producto descontinuado.  Productos similares disponibles en The LEE Company.
Caudalímetro volumétrico de aguaOMEGA Engineering inc. FLR-1602ASe prefiere encarecidamente el medidor de caudal sin contacto. Recomendamos el sensor de flujo de líquido SENSIRION LG16 OEM para caudales desde nl/min hasta 5 ml/min.
PCD-mini detector de fotones  SenslPCDMini-00100Para la detección de fluorescencia; disponible directamente en Sensl
AccelerometerCrossbow Technology, Inc.CXL02LF3detección de fuerza de 3 dimensiones.  Suministrado a DMI por la NASA. Producto similar disponible en Vernier Software & Tecnología, LLC. 
Microscopio estereoscópicoAmScopeSE305R-AZ-E
Cámara CCDThorlabs DCU223C1.024 x 768 Resolución, Color, USB 2.0; disponible directamente desde Thorlabs
USB y cable de disparo (entrada/salida) para cámara CCDThorlabsCAB-DCU-T1Disponible directamente en Thorlabs
Tubos de microperforaciónSaint-Gobain Corporation AAD04103Tygon®; ID 0.02", OD 0.06", 500 pies, 0.02" pared. Proveedores: VWR, Thermo Fisher Scientific Inc.
Pasadores de acero huecos NewEngland Small Tube(personalizado)0.025 "OD, 0.017" ID, 0.500 " L, tubo de acero inoxidable, tipo 304, cortado, desbarbado, pasivado; habilitar conexiones de tubos de microperforación, conexiones de tubos de viruta
Abrazadera deslizanteWorld Precision Instruments, Inc.14042Disponible directamente en World Precision Instruments
Piezas adaptadoras LeurWorld Precision Instruments, Inc.14011Disponible directamente en World Precision Instruments
Oblea de silicioAddison Engineering, Inc.6" de diámetro; para la fabricación de moldes SU-8
Agente de curado de elastómero de polidimetilsiloxano (PDMS)Dow Corning3097358-1004Proveedor: Global Industrial SLP, LLC
Aguja (calibre 23), punta biseladaTerumo Medical CorporationNN-2338RPared ultradelgada; 23 G x 1.5"; 22 G también utilizables; proveedores: Careforde, Inc.,  Aguja dispensadora médica Port City
(calibre 23), punta romaCML Supply901-23-10023 G x 1";   disponible en CML Supply
Cover glassThermo Fisher Scientific, Inc.12-518-105EGold Seal™ vidrio de borosilicato no corrosivo; para cubierta de virutas PDMS; 24 x 60 mm; disponible en Thermo Fisher Scientific, Inc.
Bomba de vacíoMountainMTN8407Para desgasificar PDMS; proveedor:  Sistema Ryder, Inc. 
Cámara de vacíoThermo Fisher Scientific, Inc.5311-0250Nalgene&comercio; Policarbonato transparente; disponible en Thermo Fisher Scientific, Inc.
Limpiador de plasmaHarrick PlasmaPDC-32G
Lupa de manoMitutoyo183-131Úselo en sentido inverso para permitir la visualización a ~15".
EtanolCAROLINA861283Para la limpieza de virutas. Diluir al 70% con agua de miliporos.
Sistema de purificación de aguaThermo Fisher Scientific, Inc.D11901Disponible directamente en Thermo Fisher Scientific, Inc.
Monturas de traducción optomecánicaThorlabsK6XMontaje óptico cinemático de 6 ejes; producto descontinuado; nuevo producto (K6XS) disponible directamente en Thorlabs
LaptopHewlett-PackardVP209AVHP Pavilion Laptop con Windows 7
Bandeja para laptop (con resorte)National Products, INC.RAM-234-3 RAM Tough-Tray™. Puede acomodar computadoras portátiles de 10 a 16 pulgadas de ancho.
Divisor USBConnectland Technology Tarjetas3401167
limitadas (8 entradas analógicas, 12 E/S digitales)National InstrumentsNI USB-6008de 12 bits, 10 kS/s de bajo costo DAQ
Multifunción Tarjetas de Adquisición de Datos USB (16 entradas analógicas, 32 E/S digitales)National InstrumentsNI USB-6216de 16 bits, 400 kS/s Aislado Serie M MIO DAQ, Control Alimentado por Bus
/ adquisición de SoftwareNational InstrumentsLabVIEW 2009Codificación personalizada de National Instruments (NI) LabVIEW 
Software de modelado de sólidos 3DDassault Systè mes SolidWorks Corp.SolidWorks 2011
Software de modelado 2DAUTODESKAutoCAD LT 2008
Bastidor de equipos verticales(proporcionado por la NAS)N/A
Placa de pruebas óptica de aluminio sólidoThorlabsMB242424" x 24" x 1/2", 1/4"-20 Grifos; disponible directamente de Thorlabs
Acero y endurecedor de grado industrialThe J-B Weld CompanyJ-B Weld Steel Pegamento epoxi reforzado
Micro-hematocrito capilar Fisher Scientific22-362-574interior de 1,1 a 1,2 mm
jeringas de 1 mlHenke-Sass, Wolf4010.200V0NORM-JECT®; proveedor: Grainger, Inc.
Glóbulos rojos humanosInvestigación innovadoraIPLA-WB3Probado y encontrado negativo por el proveedor para: HBsAg, VHC, VIH-1, VIH-2, VIH-1Ag o VIH 1-NAT, ALT y sífilis por métodos aprobados por la FDA. Debido a que ningún método de prueba puede garantizar con un 100% de certeza la ausencia de un agente infeccioso, los productos derivados de humanos deben manipularse como se sugiere en el Manual del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos sobre BIOSEGURIDAD EN LABORATORIOS MICROBIOLÓGICOS Y BIOMÉDICOS, PARA MUESTRAS DE SUERO O SANGRE HUMANAS POTENCIALMENTE INFECCIOSAS
Concentrado salino tamponado con fosfatoP5493SIGMA10x; diluido a 1x
TweenP9416SIGMATWEEN® 20
CentrífugaLW ScientificSTRAIGHT8-5KCentrífuga abatible de 8 posiciones. Disponible a través de distribuidores autorizados. Otras centrífugas disponibles directamente de LW Scientific.
Grabadora de vídeo HDSonyMHS-CM5
Tinción de ácido nucleico fluorescente naranjaInvitrogenS-11364SYTO® 83 Tinción de ácido nucleico fluorescente naranja.  Almacenado en solvente DMSO. Use siempre el equipo de protección personal recomendado. No se requiere asesoramiento especial
.
Perlas contadoras fluorescentesInvitrogenMP 36950CountBright™ Cuentas de conteo absolutas.  Use siempre el equipo de protección personal recomendado. No se requieren consejos especiales de manejo.
de adquisición de datos USB de diámetro

Referencias

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